Nghiên cứu xác định một số đoạn ADN mã vạch và nhân giống lan phi điệp tím hòa bình (dendrobium anosmun lindley) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP -LUẬN VĂN THẠC SỸ KH OA HỌC LÂM NGHIỆP ĐỖ QUỲNH LIÊN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐOẠN ADN MÃ VẠCH VÀ NHÂN GIỐNG LAN PHI ĐIỆP TÍM HỊA BÌNH (Dendrobium anosmun Lindley) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO CHUYÊN NGHÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS BÙI THỊ MAI HƯƠNG PGS.TS NGUYỄN VĂN VIỆT Hà Nội, 2020 i LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan, cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Nếu nội dung nghiên cứu trùng lặp với cơng trình nghiên cứu cơng bố, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm tn thủ kết luận đánh giá luận văn hội đồng khoa học Hà nội, ngày… tháng… Năm 2020 Người cam đoan ( Tác giả ký ghi rõ họ tên) Đỗ Quỳnh Liên ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp trang bị kiến thức cho suốt q trình học tập Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Văn Việt TS Bùi Thị Mai Hương tận tình bảo hướng dẫn tơi suốt q trình làm luận văn Thạc sĩ Tôi xin cảm ơn cán Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp Trường Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện cho hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp sát cánh hỗ trợ động viên vật chất tinh thần trình học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Học viên Đỗ Quỳnh Liên iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii BẢNH DANH MỤC VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH x ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu chung Phi điệp tím Hịa Bình 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật học Phi điệp tím Hịa Bình 1.1.3 Một số điều kiện sinh thái 1.1.4 Giá trị sử dụng 1.2 Tổng quan ADN mã vạch 1.2.1 Giới thiệu ADN mã vạch (DNA barcode) 1.2.2 Một số locus sử dụng làm thị mã vạch ADN thực vật 10 1.2.3.Những nghiên cứu ứng dụng ADN mã vạch giám định loài 13 1.3 Tổng quan nuôi cấy mô - tế bào 16 1.3.1 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật 16 1.3.2 Các bước tiến hành phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật 17 1.3.3 Thành tựu nuôi mô chi Dendrobium 19 Chương 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 23 2.1.1 Mục tiêu tổng quát 23 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 23 2.2 Nội dung nghiên cứu 23 iv 2.2.1 Xác định số trình tự ADN mã vạch 23 2.2.2 Nhân giống Phi điệp tím Hịa Bình kỹ thuật ni cấy mơ tế bào 23 2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 23 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 23 2.3.2 Hóa chất 24 2.4 Phương pháp nghiên cứu xác đinh ADN mã vạch 26 2.4.1.Tách chiết DNA tổng số 26 2.4.2 Phương pháp nhân gen đích kỹ thuật PCR 28 2.4.3.Tinh sản phẩm PCR 29 2.4.4 Phương pháp đọc trình tự 30 2.4.5 Xử lý số liệu 30 2.5 Phương pháp nhân giống Phi điệp tím Hịa Bình kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào 30 2.5.1 Phương pháp khử trùng tạo mẫu nuôi cấy khởi động 30 2.5.2 Phương pháp nhân nhanh thể chồi 31 2.5.3 Phương pháp nhân nhanh chồi 32 2.5.4 Phương pháp nghiên cứu rễ - tạo hoàn chỉnh .34 2.5.5 Phương pháp huấn luyện 35 2.5.6 Điều kiện thí nghiệm 36 2.5.7.Chỉ tiêu theo dõi, đánhgiá 36 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Kết xác định số đoạn ADN mã vạch 37 3.1.1 Kết tách chiết ADN tổng số 37 3.1.2 Kết nhân vùng gen nghiên cứu kỹ thuật PCR 37 3.1.3 Phân tích kết 38 3.2 Kết nhân giống Phi điệp tím Hịa Bình ni cấy mơ tế bào 52 3.2.1 Phương pháp khử trùng tạo mẫu nuôi cấy khởi động 52 3.2.2 Phương pháp nhân nhanh thể chồi 55 v 3.2.3 Phương pháp nhân nhanh chồi 57 3.2.4 Phương pháp nghiên cứu rễ - tạo hoàn chỉnh 63 3.2.5 Phương pháp huấn luyện 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 vi BẢNH DANH MỤC VIẾT TẮT TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 TT 21 22 23 24 25 26 … Hình 3.15 Ảnh hưởng nồng độ BAP, Kinetin NAA đến nhân nhanh chồi 62 Kết bảng 3.9 biểu đồ 3.5 cho thấy, bổ sung đồng thời BAP, NAA Kinetin vào môi trường nuôi cấy, cơng thức thí nghiệm cho tỷ lệ tạo cụm chồi cao Với giá trị tỷ lệ tạo cụm chồi đạt 81,7% đến 96,8%, số chồi trung bình/mẫu đạt từ 8,2 đến 13,3 Đặc biệt cơng thức NN3 đạt giá trị cao nhất, tỷ lệ tạo cụm chồi, số chồi trung bình mẫu 96,8% 13,3 chồi/cụm (Hình 3.11 a,3.11b, 3.11c) Kết tương ứng với kết nhân giống lan Hồng thảo vơi (Tỷ lệ tạo cụm chồi 96,7%, 12,3 chồi/cụm) tác giả Nguyễn văn Việt (2017) Theo công bố Vũ Kim Dung cộng (2016) nhân nhanh lan Hoàng thảo ý thảo ba mầu cho kết 96,67% tạo cụm chồi, số chồi tạo 9,53 chồi/cụm Như vậy, chọn mơi trường nhân nhanh Phi Điệp tím Hồ Bình mơi trường dinh dưỡng MS bổ sung 0,8 mg/L BAP, 0,5 mg/L Kinetin 0,2 mg/L NAA Kết phân tích thống kê cho thấy khác biệt rõ rệt cơng thức thí nghiệm hệ số nhân chồi (Sig < 0,05) a b c Hình 3.16 Hình ảnh lan Phi điệp tím Hịa Bình qua giai đoạn nuôi cấy a) Cụm chồi NN2; b) Cụm chồi NN3; c) Cụm chồi NN4 63 3.2.4 Phương pháp nghiên cứu rễ - tạo hoàn chỉnh Ra rễ tạo hoàn chỉnh in vitro khâu quan trọng trước cho ngồi huấn luyện Thí nghiệm tiến hành với việc cấy chuyển chồi lan đủ tiêu chuẩn (chồi đạt - 4cm, mập, xanh) vào mơi trường khống MS bổ sung (0,1 đến 0,4mg/L) IBA, (0,2 đến 0,4mg/L) NAA, 20g/L sucrose, 6,5g/L agar, 100g/L khoai tây nghiền, 100ml/L nước dừa Kết thí nghiệm trình bày bảng 3.10 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nồng độ IBA NAA tới khả rễ (sau tuần nuôi cấy) CTTN IBA ĐC RR1 RR2 RR3 RR4 RR5 RR6 RR7 RR8 RR9 64 Hình 3.17 Ảnh hưởng nồng độ IBA NAA tới khả rễ Kết bảng 3.10 biểu đồ 3.6 cho thấy, cơng thức thí nghiệm bổ sung chất điều hoà sinh trưởng thực vật (IBA NAA) cho tỷ lệ rễ thấp Môi trường bổ sung 0,2 đến 0,4 mg/L IBA, tỷ lệ rễ đạt 67,3 đến 81% số rễ đạt 7,4 đến 8,3 Với công thức môi trường bổ sung 0,2 đến 0,4 mg/L NAA, tỷ lệ rễ số rễ cao 83,3% 9,5% Các công thức môi trường bổ sung phối hợp hai chất ĐHST (0,1 đến 0,3) mg/L IBA (0,2 đến 0,4mg/L) NAA, cho kết cao so với bổ sung hai chất trên, cụ thể công thức RR8, với môi trường dinh dưỡng MS bổ sung 0,2 mg/L IBA 0,3 mg/L NAA cho kết cao tỷ lệ chồi rễ số rễ 94,3% 10,5 (Hình 3.12a, 3.12b) Kết đạt tương tự tác giả Vũ Kim Dung cộng (2016) dùng mơi trường khống MS bổ sung NAA 0,3 mg/L, IBA 0,2 mg/L nghiên cứu rễ lan Hoàng thảo ý thảo ba mầu, tỷ lệ rễ đạt 93,33% Tác giả Nguyễn Văn Việt (2017) nghiên cứu mơi trường rễ lan Hồng thảo kèn mơi trường khống Knops bổ sung NAA 0,3 mg/L, IBA 0,1 mg/L cho tỷ lệ chồi rễ cao đạt 100%, số rễ TB/cây 4,8 chiều dài TB/rễ đạt 3,6 cm, số rễ 17,3 Kết phân tích thống kê cho thấy, nồng độ chất điều hoà sinh trưởng thực vật khác ảnh hưởng rõ rệt tới khả rễ Phi điệp tím Hồ Bình (Sig < 0,05) 65 a) Cây lan hoàn chỉnh RR8 b) Cây lan hồn chỉnh Hình 3.18 Hình ảnh lan Phi điệp tím Hịa Bình qua giai đoạn ni cấy 3.2.5 Phương pháp huấn luyện ngơi Khi có chiều cao lớn 4,5 cm, có khoảng rễ, cứng cáp, tiến hành đem bình huấn luyện điều kiện ánh sáng tán xạ Thí nghiệm này, được bố trí với cơng thức khác thời gian, sau huấn luyện đem trồng giá thể hỗn hợp dương xỉ xơ dừa qua xử lý Kết nghiên cứu trình bày bảng 3.11 Bảng 3.11 Ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chất lượng (sau tuần ngôi) CTTN ĐC TG1 TG2 TG3 Ghi chú: +) Cây nhỏ, thân yếu, rễ bám giá thể kém; ++) Cây cao, xanh đậm, cứng cáp, rễ bám giá thể tốt; +++) Cây to, khỏe, xanh đậm, rễ bám giá thể tốt xuất rễ mới, tăng chiều cao 66 Hình 3.19 Ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chất lượng Kết thu (Bảng 3.11và biểu đồ 3.7), cho thấy tỷ lệ sống có sai khác rõ rệt cơng thức đối chứng (Khơng huấn luyện) với cơng thức cịn lại có trải qua huấn luyện khả thích ứng với mơi trường tự nhiên tốt Thời gian huấn luyện 10 ngày, tỷ lệ sống trồng giá thể đạt 98,03% (Hình 3.13) Kết phân tích thống kê cho thấy, Sig < 0,05, chứng tỏ có khác biệt rõ rệt tỷ lệ sống cơng thức thí nghiệm a TG huấn luyện ngày b.TG huấn luyện 10 ngày Hình 3.20 Hình ảnh lan Phi điệp tím Hịa Bình giai đoạn lan huấn luyện 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận a) Đối với xây dựng sở liệu ADN mã vạch Phi điệp tím Hịa Bình Đã tách chiết ADN tổng số 03/03 mẫu loài Phi điệp tím Hịa Bình (Dendrobium anosmun) Đã nhân thành công gen ycf, trnH-psbA rbcL kỹ thuật PCR từ ADN tổng số mẫu thu Đã xác định trình tự đoạn gen ycf, trnH-psbA rbcL 4.Đã xây dựng phát sinh chủng loại Phi điệp tím Hịa Bình (Dendrobium anosmun) với dòng Phi điệp khác ngân hàng gen quốc tế Đoạn ycf có khả phân biệt cao so với đoạn trnH-psbA rbcL so sánh loài Dendrobium anosmunvới loài Dendrobium tosaense Kết phân tích đoạn gen ycf phù hợp với kết hình thái cho thấy lồi Dendrobium anosmun có quan hệ gần với loài Dendrobium tosaense Mặc dù cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự để xác định xác lồi cần định danh b) Đối với nhân giống lan Phi điệp tím Hịa Bình (Dendrobium anosmun) kỹ thuật ni cấy mô tế bào Xác đinh công thức khử trùng mẫu dung dịch HgCl2 0,1% 10 phút đạt tỷ lệ 94,6%, tỷ lệ tạo thể chồi 9,3% Xác định công thức nhân nhanh chồi mơi trường khống MS bổ sung 0,8 mg/L BAP, 0,2mg/L NAA, 0,5mg/L Kinetin, 30g/L sucrose, 6,5g/L agar, 100g/L khoai tây nghiền, 100ml/L nước dừa Tỷ lệ tạo cụm chồi 96,8% hệ số nhân chồi đạt 13,7 lần; Xác định công thức rễ - tạo hồn chỉnh mơi trường khống MS bổ sung 0,2mg/L IBA 0,3mg/L NAA, 100mg/L khoai tây 68 nghiền, 20 g/L sucrose, 6,5 g/L agar Đạt tỷ lệ rễ 93,3%, số rễ trung bình 3,5 rễ/cây, chiều dài rễ trung bình 3,0cm, số rễ 10,5 Xác định công thức huấn luyện 10 ngày ánh sáng tán xạ, sau đưa trồng giá thể, tỷ lệ sống đạt 98,03% sau tuần theo dõi Kiến nghị - Sử dụng đoạn gen ycf, trnH-psbA rbcL vào việc giám định loài Phi điệp Việt Nam, đồng thời Đưa trình tự đoạn gen ycf, trnH-psbA rbcL lên ngân hàng Gen Quốc tế để phục vụ nghiên cứu sau này, tiến hành nghiên cứu với mồi khác để tìm dấu hiệu xác định lồi khác nhằm phân loại cách xác cụ thể Nhân mã vạch ADN khác đối tượng Phi điệp tím - Có thêm thời gian điều kiện để tiếp tục hoàn thiện nội dung quy trình nhân giống Phi điệp tím Hịa Bình (Dendrobium anosmun) như: Nghiên cứu mơi trường thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh chồi giai đoạn rễ, nghiên cứu chế độ huấn luyện lan từ ống nghiệm vườn ươm, giá thể trồng, chế độ chăm sóc ngồi vườn ươm để quy trình nghiên cứu hồn thiện kỹ thuật ni cấy mơ tế bào để đưa vào sản xuất 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan (2013) Nhân giống in vitro loài Lan địa Dendrobium nobile Lindley Tạp chí khoa học phát triển, (11): 917-925 Nguyễn Thị Lý Anh, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Thị Lý Sơn, Nguyễn Quang Thạch, Từ Bích Thủy (2014) Nhân giống in vitro lan Dendrobium officinle Kimura et Migo (Thạch Hơc Thiết Bì) Tạp chí khoa học phát triển (12): 1274-1282 Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Quỳnh Nga, Trần Ngọc Lân, Nguyễn Thị Thu, Ninh Thị Phíp, Đồn Thị Thanh Nhàn, Lê Thị Thu Hiền, Nguyễn Nhật Linh (2018), “Đặc điểm hình thái mã vạch DNA loài Bảy hoa Paris vietnamensis (Takht.) H.Li” Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2018, 16(4):282-289 Vũ Kim Dung, Bùi văn Thắng, Nguyễn Văn Việt (2016) Nhân giống Lan Hoàng Thảo Ý thảo ba màu (Dendrobium gratiosissimun Reichenb.f), tạp chí khoa học công nghệ số -2016 Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong (2015), “Xác định mã vach cho Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis)”, Tạp chí Nơng Nghiệp PTNT, số 5/2015, trang 123 -124 Lê Thanh Hương, Nguyễn Nhật Linh, Bùi Mạnh Minh, Hà Hồng Hạnh, Huỳnh Thị Thu Huệ, Nông Văn Hải, Hà Văn Huân, Lê Thị Thu Hiền (2017), “Ứng dụng mã vạch DNA hỗ trợ định danh loại loài số mẫu sâm thuộc chi nhân Sâm” Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, số 15 Nguyễn Thu Hường (2016) Nghiên cứu nhân giống in vitrolan Hồng Thảo phi điệp tím(Dendrobium anosmum Lindley) Luận văn thạc sỹ sinh học ứng dụng, Đại học Thái Nguyên 70 Nguyễn Thị Lài, Vũ Mạnh Hải, Phạm Hương Sơn, Tống Xuân Trung (2018) Nghiên cứu nhân giống Lan Hoàng Thảo Nghệ Tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe), tạp chí khoa học cơng nghệ 60(5) 5.2018 Nguyễn Quang Thạch (2000) Giáo trình sinh lý thực vật Nxb Nông nghiệp Hà Nội 10 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2000) Bài giảng môn học Công nghệ sinh học thực vật Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội 11 Nguyễn Đức Thành (2017).Tìm hiểu kỹ thuật nhân giống chăm sóc lan phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindley) Khóa luận tốt nghiệp Đại học Lâm Nghiệp 12 Nguyễn Quỳnh Trang, Vũ Thị Huệ, Khuất Thị Hải Ninh, Nguyễn Thị Thơ (2013) Nhân giống in vitro lan Phi điệp tím (Dendrobium anosum) Tạp chí khoa học công nghệ Lâm nghiệp, 3(1): 16-21 13 Nguyễn Văn Uyển (1993) Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng Nxb Nông nghiệp, 23-44 14 Nguyễn Văn Việt (2017).Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro nhân giống lan Hoàng thảo kèn (Dendrobium lituiflorum Lindley) Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Lâm nghiệp, 4/2017: 39-45 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 15 Baharum S.N (2012) Application of 16s rDNA DNA cytochrome b ribosomal markers in studies of lineage DNA fish populations structure of aquatic species Molecular biology reports, 39 (5):52255232 16 Balaraju K, Agastian P, Preetamraj J.P, Arokiyaraj S, Ignaciumthu S (2008) Micropropagation of Vitex agnuscatus (Verbenaceae) Avaluable medicinal plant In vitroCellular & Developmental Biology 71 - Plant, 44(5): 436-411 17 Brown B, Emberson R.M, and Paterson A.M (1999) Mitochondrial COI DNA II provide useful markers for Wiseana (Lepidoptera: Hepialidae) species identification”, Bulletin of Entomological Research, 89 (04): 287-293 18 Casiraghi M, Labra M, Ferri E, Galimberti A, and Mattia D.F (2010) DNA barcoding: theoretical aspects DNA practical applications Brief Bioinform,11(4):440-453 19 Chase M.W, Robyn S Cowan , Peter M Hollingsworth , Cassio van den Berg , Santiago Madriñán , Gitte Petersen , Ole Seberg , Tina Jørgsensen , Kenneth M Cameron6 , Mark Carine , Niklas Pedersen , Terry A.J Hedderson , Ferozah Conrad , Gerardo A Salazar, James E Richardson , Michelle L Hollingsworth , Timothy G Barraclough, Laura Kelly & Mike Wilkinson (2007) A proposal for a st and ardised protocol to barcode all DNA plants Taxon, 56 (2): 295-299 20 Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J, Shi L, Zhu Y, Ma X, Gao T, Pang X, Luo K, Li Y, Li X, Jia X, Lin Y, Leon C (2010) Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species PloS one, (1): e8613 21 Chen SY, Zhao R, Xu L, Feng QJ, Wang B, Kang TQ(2016), “DNA barcoding of Mongolian Medicinal Plant Scutellaria Scordifolia” Zhong Yao cao (Journal of chinese medicinal materials) , 39(7):14837 22 Chiou, S.-J., Yen J.-H., Fang C.-L., Chen H.-L., DNA Lin T.Y (2007) Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers Planta medica, 73 (13):1421-1426 23 Fazekas A.J, Burgess K.S, Kesanakurti P.R, Graham S.W, Newmaster S.G, Husband B.C, Percy D.M, Hajibabaei M, Barrett S.C (2008) 72 Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well.PLoS One, (7): e2802 24 Hebert, P.D., Cywinska A., and Ball S.L (2003) Biological identifications through DNA barcodes.Proceedings of the Royal Society of London B: 25 Biological Sciences, 270 (1512): 313-321 Hebert P.D, Ratnasingham S and De Waard J.R (2003).Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit divergences among closely related species Proceedings of the Royal Society of London B Biological Sciences, 270 (1): 96-99 26 Hollingsworth, P.M (2011) Refining the DNA barcode for DNA plants Proceedings of the National Academy of Sciences, 108 (49):1945119452 27 Hollingsworth M.L, and Clark A., et al (2009) Selecting barcoding loci for plants: evaluation of seven candidate loci with species-level sampling in three divergent groups of land plants Molecular Ecology Resources, (2): 439-457 28 Lee H-L, Yi D-K, Kim J-S, Kim K-J (2007) Development of plant DNA barcoding markers from the variable noncoding regions of chloroplast genome The Second International Barcode of Life Conference Academia Sinica, Taipei, Taiwan September 18–20, 2007 29 Logacheva, M., Penin A., Samigullin T., Vallejo-Roman C., DNA Antonov A (2007) Phylogeny of flowering plants by the chloroplast genome sequences: in search of a “lucky gene” Biochemistry (Moscow), 72 (12): 1324-1330 30 Park SU, Kim YK, Lee SY (2009), Improvedin vitro plant regeneration DNA micropropagation of Rehmannia glutinosa L Journal of Medicial Plants Research, 3(1): 031-034 31 Pereira AM, Amui SF, Bertoni BW, Moraes RM, Franca SC (2003) 73 Micropropagation of Anemopaegma arvense: Conservation of an endangered madicinal plant Plant Med, 69(6): 571-573 32 Peter M Hollingsworth, Laura L Forrest, John L Spouge, Mehrdad Hajibabaei, Sujeevan Ratnasingham,et al (2009) A DNA barcode for land plants.Proceedings of the National Academy of Sciences, 106 (31): 12794-12797 33 Scharaschklin T., Doyle J.A.( 2005) Phylogeny and historical biogeography of Anaxagorea (Annonaceae) using morphology and noncoding chloroplast sequence data Syst Bot 30: 712–735 34 Schoch C.L, Seifert K.A, et al (2012) Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi Proceedings of the National Academy of Sciences, 109 (16): 6241- 6246 35 Shigematsu N, Asano R, Shimosaka M, Okazaki M (2001) Effect of administration with the extract of Gymnema sylvestre R Br leaves on lipid metabolism in rats Biol Pharm Bull,24(6):713-717 36 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3): 14 37 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources 9: 1086-1091 38 Vijayan K and Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective” Current science, 99: 1530 – 1540 39 Wang DY., Wang Q.,Wang YL., Xiang XG., Huang LQ., Jin 74 XH(2017), “Evaluation of DNA bacorde in Codonpsis (Campanulaceae) and in some large angiosperm plant genera” Plos one 12(2): e0170286: 1-14 40 Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R (2010) “DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots” BMC Plant Biology 10: 205 41 Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single-copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade” Genetics, 174: 1407-1420 42 Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2010), “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals” PLoS ONE, 5: 13102 43 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L and Hui Y (2010) “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique” Journal of Medicinal Plants Research, 4(24): 2706-2709 WEBSITE 44 http://www.barcodinglife.org/ 45 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ... Xác định số đoạn ADN mã vạch nhân giống Phi điệp tím Hịa Bình phương pháp nuôi cấy mô tế bào 2.1.2 Mục tiêu cụ thể - Xác định số trình tự ADN mã vạch cho Phi điệp tím Hịa Bình - Xây dựng kỹ thuật. .. thực đề tài ? ?Nghiên cứu xác định số đoạn ADN mã vạch nhân giống lan Phi điệp tím Hịa Bình (Dendrobium anosmun Lindley) kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào” để phân loại, lựa chọn, nuôi cấy xây dựng liệu... thuật nhân giống Phi điệp tím Hịa Bình phương pháp ni cấy mơ tế bào 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Xác định số trình tự ADN mã vạch - Tách chiết ADN tổng số Phi điệp tím Hịa Bình - Nhân đoạn gen