Nghiên cứu xác định các đoạn DNA barcode cho loài tràm năm gân melaleuca quinquenervia phục vụ giám định loài

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, với lịng biết ơn sâu sắc nhất, tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp- Trường Đại học Lâm nghiệp giúp đỡ bảo tận tình tơi q trình thực khóa luận trường, đặc biệt giúp đỡ thầy cô bên môn Công nghệ gen Di truyền phân tử Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Hà V n Huân TS i Th M i Hương trực tiếp hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi thực đề tài khóa luận tốt nghiệp Đặ iệt, kh luận nhận hỗ trợ từ Đề tài cấp Nhà nước "Xây dựng sở liệu mã vạch DNA (DNA barcode) cho số loài lâm nghiệp gỗ lớn, lâm sản ngồi gỗ có giá tr kinh tế" PGS TS Hà V n Huân làm Chủ nhiệm Cuối xin gửi lời cảm ơn hân thành đến thầy , gi đình, ạn bè - người động viên, khích lệ tơi suốt q trình học tập, rèn luyện thực khóa luận tốt nghiệp Do q trình thực cịn có nhiều hạn chế mặt thời gian, kiến thức kinh nghiệm khơng tránh khỏi thiếu sót đ nh Tôi mong nhận ý kiến đ ng g p thầy bạn để khóa luận tốt nghiệp củ t i hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 24 tháng n m 2019 Sinh viên thực Vũ Thị Huyền Dịu MỤC LỤC Lời cảm ơn MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG .6 DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Nguồn gốc phân bố Tràm năm gân .2 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Giá trị sử dụng 1.2 Tổng quan mã vạch DNA (DNA barcode) 1.2.1 Giới thiệu mã vạch DNA 1.2.2 C c đặc điểm ản tr n t 1.2.3 t ố c CHƯƠNG 2: ụng tr ng N arc ương N arc t c t ỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 12 2.2 N i dung nghiên cứu 12 2.3 P ương ng iên cứu 12 2.3.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.3.2 V t liệu nghiên cứu 12 2.2.3 Dụng cụ, hóa chất sử dụng 13 2.3.4 Tách chiết DNA tổng số 14 2.3.5 Tiến hành phản ứng PCR 16 2.3.6 Tinh sản phẩm PCR 18 2.3.7 P ương đọc trình t 18 2.3.8 Xử lý số liệu 19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số 20 3.2 Kết nhân vùng gen nghiên cứu kỹ thu t PCR 20 3.3 Phân tích kết 21 3.3.1.Trình t đ ạn gen matK 21 3.3.3 Trình t đ ạn gen trnH-psbA 25 3.3.3 Trình t đ ạn gen ITS2 29 3.3.4 So sánh khả ân iệt đ ạn trình t matK, trnH-psbA, ITS2 31 CHƯƠNG KẾT UẬN VÀ KIẾN NGH 33 4.1 Kết n 33 4.2 Kiến nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO .1 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Các chữ viết Nghĩa tiếng Anh tắt Nghĩa tiếng Việt ATP Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat BME β-mereaptoethanol β-mereaptoethanol BOLD Barcode of Life data Barcode of Life data Base pair Cặp base Consortium for the Barcode of Consortium for the Barcode Life of Life bp CBOL Convention on International CITES Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora cpDNA C ng ước buôn bán quốc tế loài nguy cấp Chloroplast DNA gen lục lạp Cetyl trimethylammonium Cetyl trimethylammonium bromide bromide Cytochrome b Cytochrome b Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleotide Deoxyribonucleotid triphosphate triphosphate EBA Extraction Buffer A Đệm tách A EBB Extraction Buffer B Đệm tách B CTAB Cytb DNA (DNA) dNTP EDTA F-Primer Ethylenediaminetetraacetic acid axit ethylenediamine tetraacetic Foward-Primer Mồi xuôi IGS Intergenic Spacer vùng liên gen ITS Internal Transcribed Spacer kb Kilobase (1000 base) 1000 cặp base mtDNA Mitochondrial DNA DNA ty thể vùng DNA nằm gen NAD(P)H NCBI Nicotinamide adenine Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate dinucleotide phosphate National Center for Biotechnology Information Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ sinh học ORF Open Reading Frame Khung đọc mở PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase PVP Polyvinyl pyrrolidone Polyvinyl pyrrolidone Restriction fragment length Phân tí h đ hình trình tự polymorphism DNA RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome SDS Sodium Dodecyl Sulphate Sodium Dodecyl Sulphate Reverse primer Mồi ngược RFLP R-Primer TAE Tris-Acetate-EDTA tRNA Transfer RNA ARN vận chuyển Untraviolet Tia cực tím UV Tris-Acetate-EDTA DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Kí hiệu mẫu tràm n m gân 12 Bảng 2.2 Thành phần đệm tách A( 100ml) 13 Bảng 2.3 Thành phần đệm tách B (100ml) 13 Bảng 2.4 Thành phần đệm TE 13 Bảng 3.1 Một số lồi có trình tự gen m tK tương đồng với loài Melaleuca quinquenervia ngân hàng gen NCBI 23 Bảng 3.2 Một số lồi có trình tự gen trnH- ps A tương đồng với loài Melaleuca quinquenervia ngân hàng gen NCBI 26 Bảng 3.3 Một số lồi có trình tự gen ITS2 tương đồng với loài Melaleuca quinquenervia ngân hàng gen NCBI 29 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số mẫu Tràm n m gân 20 Hình 3.2 Kết nhân gen matK, trnH-pbsA, ITS2 21 Hình 3.3 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn matK tạo NCBI 23 Hình 3.4 Sự sai khác trình tự đo n gen m tK lồi Melaleuca quinquenervia lồi Melaleuca viridiflora(các v trí s i kh đượ i đỏ) 25 Hình 3.5 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn trnH-psbA tạo NCBI 27 Hình 3.6 Sự sai khác trình tự đoạn gen trnH-psbA lồi Melaleuca quinquenervia lồi Melaleuca viridiflora (các v trí s i kh đượ i đỏ) 28 Hình 3.6 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn gen ITS2 tạo NCBI 30 Hình 3.7 Sự sai khác trình tự đoạn gen ITS2 loài Melaleuca quinquenervia loài Melaleuca viridiflora(các v trí s i kh đượ i đỏ) 31 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam quốc gia có nguồn tài nguyên đ dạng phong phú với nhiều loại động vật, thực vật nấm có giá tr kinh tế vật o Trong đ , giới thực tính đ dạng cao lồi Đến có khoảng 350.000 lồi thực vật đượ đ nh dạng Từ thời x xư nhà kho họ iết cách xếp thực vật theo trật tự đ nh để nhận biết cách dễ dàng Tuy nhiên, việc xếp thực vật vào nhóm chủ yếu dự vào đặ điểm sinh hình thái đặ điểm sinh lí hóa bên nhờ vào bảng hướng dẫn đ nh loại có sẵn Phương ph p nhiều trường hợp gặp nhiều kh kh n hạn chế nhiều loài có hình thái giống nh u lại khác hệ thống phân loại (hệ gen giống nhau) Ngoài với mẫu phân biệt loài mẫu có nguồn gốc sinh vật iến đổi sinh th i hế, b vùi đất hoặ qu hế biến khơng thể x đ nh th hình thái Nhờ vào phát triển nhanh chóng cơng nghệ khoa học nói chung ũng kĩ thuật sinh học phân tử n i riêng ho phép húng t khắc phục hạn chế kể đồng thời òn ho phép x đ nh khác biệt lồi chí cá thể lồi cách xác Tràm n m gân (Melaleuca quinquenervia) (Cav.) S.T Blacke, đượ đ nh gi lồi có giá tr kinh tế o, đồng thời ũng ây khả n ng h u mặn Tràm đ ng sử dụng để chiết xuất tinh dầu tràm Và loài đ ng khai thác nhiều, húng đ ng nằm danh sách loài thực vật cần bảo tồn quốc gia Do đ , t i thực đề tài “Nghiên ứu x đ nh đoạn DNA barcode ho loài Tràm n m gân (Melaleuca quinquenervia) phục vụ gi m đ nh loài ” CHƢƠNG : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1 Nguồn gốc phân bố Tràm năm gân Tràm n m gân (Melaleuca quinquenervia) (Cav.) S.T Blacke loài thuộ hi Tràm( mel leu ) Tràm n m gân mặt phần lớn Úc (230 loài) Việt N m Tràm n m gân trồng nhiều Vì, Th nh H ,… Song ịn nghiên cứu mặt thực vật hóa học Giới (regnum) plantae (thực vật) Bộ (ordo) Myrtales Họ (familia) Myrtaceae Chi (genus) Melaleuca Lòai (species): M.quinquenervia Tràm n m gân phân ố tự nhiên Papua New Guinea (PNG) ven biển phí đ ng Austr li bang Queesland (Qld) New South Wales (NSW), từ 8o 16’ vĩ độ N m đến 33o 52’ vĩ độ Nam Ở Việt N m Tràm n m gân trồng nhiều Thanh Hóa, Ba Vì, Thừa Thiên Huế[23] 1.1.2 Đặc điểm hình thái Tràm n m gân ây gỗ nhỏ h y trung ình, thường xanh, cao 10-15m (đ i tới 20-25m), đường kính đạt 50-60 m Đ i ây ụi, cao 0,5-2m, mọc v ng đồi cằn cỗi thân thường khơng thẳng; vỏ ngồi mỏng, xốp, màu trắng x m, thường bong thành nhiều lớp Hệ rễ phát triển mạnh Lá đơn, mọc so le; phiến hình mác hay hình trái xoan hẹp, thường kh ng ân đối, kí h thước 4-8(-10)x1-2,0(¬2,5) m; đầu nhọn tù, gốc trịn hoặ hình nêm; dày; lúc non có lơng mềm màu trắng bạc, sau nhẵn, màu xanh lục; gân hính (đ i 6), hình ung; uống ngắn, có lơng Cụm hoa bơng mọc đầu cành hay nách Hoa nhỏ, màu trắng, trắng xanh nhạt, trắng vàng nhạt trắng kem; đài hợp gốc thành ống hình trụ hay hình trứng, thuỳ đài ngắn; cánh tràng 5, có móng ngắn (các thuỳ đài nh tràng sớm rụng); nh nhiều, hợp thành bó, xếp đối diện với thuỳ đài; đĩ mật chia thuỳ, có lơng mềm; bầu ẩn ống đài, Quả nang gần hình chén hình bán cầu hình cầu, kí h thước 3¬3,5x3,5-4mm, chín nứt thành mảnh Hạt hình nêm hình trứng Sau hoa nở, tạo quả; trục cụm hoa tiếp tụ sinh trưởng, phát triển tạo thành đoạn mang hoa mang xen kẽ Cây sống thích hợp iên độ sinh thái, sống khỏe loại đất th t, t, đồi, ẩm, vùng ngập nước v ng đất đồi khơ hạn, khí hậu khắc nghiệt Sau gần h i n m đư vào trồng thử, ây tràm trồng Lộc Bổn ph t triển tốt, mặt cao 2,5 - 3m, nhiều cao lên tới 4m, nhiều, lượng tinh dầu cao Để phát triển tốt, xuyên, n ng xuất cao, yêu cầu phải h m s thường n phân quy trình, ây sinh trưởng nhanh, tỷ lệ sống o, đạt đến 90% Đối với hộ gi đình h m s , ây phát triển tự nhiên, n ng xuất chất lượng khơng cao Cây sống thọ 25 - 30 n m[24] 1.1.3 Giá trị sử dụng Đây loài ây mà hàm lượng tinh dầu l tươi thể đạt 1,3- 2,4%, tỷ lệ 1,8- ineole đạt 0,2-65% nữa, 5-50%, coi lồi có triển vọng sản xuất tinh dầu tinh dầu tràm n m gân giàu 1,8-cineole có tác dụng diệt khuẩn, kháng virus, sử dụng ngành công nghiệp dượ thuốc chống xung huyết, chống ho, tác dụng giảm đ u hống viêm Ngoài ra, 1,8-cineole òn d ng hương liệu, chữa bệnh hen suyễn, viêm xoang bệnh phi tắc nghẽn mạn tính, hí người cho 1,8-cineole góp phần kiểm sốt viêm tụy cấp tính Với khả n ng kh ng khuẩn mạnh, tràm n m gân sử dụng để h m s d , làm da nhờn, hỗ trợ tr mụn, mẩn ngứa, nhọt, trầy xướt vết côn trùng cắn tốt Tinh dầu đẩy nhanh tố độ thay mô tế bào da, giúp làm mờ xóa vết sẹo nám da, làm da trở nên tươi tương tự tinh dầu tràm trà Bên thể, tinh dầu có khả n ng hỗ trợ ng n hặn nhiễm khuẩn đường ruột hệ tiêu h ng n hặn giun sán phát triển Tràm n m gân đồng thời khả n ng làm th ng mũi, hống nghẹt mũi đường hô hấp, long đờm giảm ho Tinh dầu có tác dụng làm 5’TCCATCTCGAAATCTTGGTTCAAACCCTTCGTTACTGCTTGAAAGAT GCCTCTTCTTTGCATTTATTACGTTTCTTTCTCCACGAGTATTGGAATA GTCTTATTACTCCAAAGAAAGATATTCCCTTTTTTTCAAAAGGGAATC CCAGATTATTGTTGTTCCTATATAATTCTCATATATGTGAATACGAAT CCATCTTTCTTTTTCTCCGTAATCAATCTTCTCATTTACGGTCAACATC TTCTGGAATCTTTTTTGAGCGAATACATTTCTATGTAAAAATAGAACA TTTTGTCAAAGTCCTATTTGAGAATGATTTTCAGTGCATCCTATGGTT CTTCAAAGATCCTTTCATGCATTATGTTAGATATCAAGGAAAATCAA TTCTGGCTTCAAAAGATACGCCTCTTCTGATGAATAAATGGAAATAT TACCTTGTTAATTTATGGCAATATCATTTTTACGCGTGGTTTCAACCA GGAAGGATCGATATAAACCAATTATGCAAGTATTCTCCTGACTTTTG GGGCTATCGTTTAAGCGTGCGACTAAATTCTTTAGTGGTACGAAGTC AAATGCTAGAAAATTCATTTCTAATAAATAATGCTATGAAGAAGTTC GAGACAATAGTTCCAATTATTCCTCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCG AATTTTTGTAACACATTCGGGCATCCCATTAGTAAACCGACCCGGGC TGATTCATCAGATTCTGATATTATCGACCGTTTTTTGCGTCTATGTAG AAATCTTTTTCATTATCACAGTGGATCCTCAAAAAAAAAGAGTTTAT ATCGAGTAAAATATATACTTCGACTTTCTTGTGTTAAAACTTTGGCTC GTAAACACAAAAGGACTGTACG’ Từ tương đồng trình tự, chúng tơi nhận thấy khơng có khác cấp độ cá thể loài Tràm n m gân Do đ t i hỉ lấy trình tự ây để phân tích Các trình tự s u đ xử lý ngân hàng gen quốc tế NC I để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi có trình tự tương đồng theo đoạn gen matK loài Tràm n m gân ằng cách sử dụng cơng cụ BLAST Một số lồi có trình tự gen tương đồng dùng so sánh với loài Hoàng đàn trình bày bảng 3.1 22 B ng 3.1 M t số lồi có trình t g n matK t ng đồng với loài Melaleuca quinquenervia ngân hàng gen NCBI STT Tên loài Mã số Tỷ lệ t ng đồng Melaleuca viridiflora AF184708.1 99.89% Melaleuca cajuputi AB924992.1 100% Melaleuca nesophila KM065221.1 99.28% Melaleuca diosmifolia KM065193.1 99.28% Melaleuca aff.nesophila cray AY525135.1 98.98% Melaleuca glomerata KM065281.1 99.26% Melaleuca alternifolia KM065337.1 97.84% Beaufortia orbifolia AY521530.1 100% Dự vào kết húng t i xây dựng ây ph t sinh hủng loại đượ thể hình 3.3 Hình 3.3 Cây phân loại d a vào trình t đoạn matK tạo b i NCBI Từ phát sinh chủng loại dựa trình tự gen matK, ta thấy lồi Melaleuca quinquenervia có quan hệ gần gũi với loài Melaleuca cajuputi xa với loài Beaufortia orbifolia 23 S u đ húng t i so s nh cấp độ loài theo đoạn gen matK lồi Melaleuca quinquenervia với trình tự gen loài Melaleuca viridiflora AF184708.1 ngân hàng gen quốc tế, nhận sai khác đoạn gen thể s u: Score Expect Identities Gaps Strand 1620 bits(877) 0.0 879/880(99%) 0/880(0%) Plus/Plus Query TCCATCTCGAAATCTTGGTTCAAACCCTTCGTTACTGCTTGAAAGATGCCTCTTCTTTGC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 470 Query 61 TCCATCTCGAAATCTTGGTTCAAACCCTTCGTTACTGCTTGAAAGATGCCTCTTCTTTGC 529 ATTTATTACGTTTCTTTCTCCACGAGTATTGGAATAGTCTTATTACTCCAAAGAAAGATA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 530 ATTTATTACGTTTCTTTCTCCACGAGTATTGGAATAGTCTTATTACTCCAAAGAAAGATA 589 Query 121 TTCCCtttttttCAAAAGGGAATCCCAGATTATTGTTGTTCCTATATAATTCTCATATAT 180 Sbjct 590 TTCCCTTTTTTTCAAAAGGGAATCCAAGATTATTGTTGTTCCTATATAATTCTCATATAT 649 Query 181 GTGAATACGAATCCATCTTTCTTTTTCTCCGTAATCAATCTTCTCATTTACGGTCAACAT 240 ||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 650 Query 241 GTGAATACGAATCCATCTTTCTTTTTCTCCGTAATCAATCTTCTCATTTACGGTCAACAT 709 CTTCTGGAATCTTTTTTGAGCGAATACATTTCTATGTAAAAATAGAACATTTTGTCAAAG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 710 Query 301 CTTCTGGAATCTTTTTTGAGCGAATACATTTCTATGTAAAAATAGAACATTTTGTCAAAG 769 TCCTATTTGAGAATGATTTTCAGTGCATCCTATGGTTCTTCAAAGATCCTTTCATGCATT 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 770 TCCTATTTGAGAATGATTTTCAGTGCATCCTATGGTTCTTCAAAGATCCTTTCATGCATT 829 Query 361 ATGTTAGATATCAAGGAAAATCAATTCTGGCTTCAAAAGATACGCCTCTTCTGATGAATA 420 Sbjct 830 ATGTTAGATATCAAGGAAAATCAATTCTGGCTTCAAAAGATACGCCTCTTCTGATGAATA 889 Query 421 AATGGAAATATTACCTTGTTAATTTATGGCAATATCATTTTTACGCGTGGTTTCAACCAG 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 890 Query 481 AATGGAAATATTACCTTGTTAATTTATGGCAATATCATTTTTACGCGTGGTTTCAACCAG 949 GAAGGATCGATATAAACCAATTATGCAAGTATTCTCCTGACTTTTGGGGCTATCGTTTAA 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 950 GAAGGATCGATATAAACCAATTATGCAAGTATTCTCCTGACTTTTGGGGCTATCGTTTAA 1009 Query 541 GCGTGCGACTAAATTCTTTAGTGGTACGAAGTCAAATGCTAGAAAATTCATTTCTAATAA 600 Sbjct 1010 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGTGCGACTAAATTCTTTAGTGGTACGAAGTCAAATGCTAGAAAATTCATTTCTAATAA 24 1069 Query 601 ATAATGCTATGAAGAAGTTCGAGACAATAGTTCCAATTATTCCTCTGATTGGATCATTGT 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1070 Query 661 ATAATGCTATGAAGAAGTTCGAGACAATAGTTCCAATTATTCCTCTGATTGGATCATTGT 1129 CTAAAGCGAATTTTTGTAACACATTCGGGCATCCCATTAGTAAACCGACCCGGGCTGATT 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1130 CTAAAGCGAATTTTTGTAACACATTCGGGCATCCCATTAGTAAACCGACCCGGGCTGATT 1189 Query 721 CATCAGATTCTGATATTATCGACCGTTTTTTGCGTCTATGTAGAAATCTTTTTCATTATC 780 Sbjct 1190 CATCAGATTCTGATATTATCGACCGTTTTTTGCGTCTATGTAGAAATCTTTTTCATTATC 1249 Query 781 ACAGTGGATCCTCaaaaaaaaaGAGTTTATATCGAGTAAAATATATACTTCGACTTTCTT 840 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1250 Query 841 ACAGTGGATCCTCAAAAAAAAAGAGTTTATATCGAGTAAAATATATACTTCGACTTTCTT GTGTTAAAACTTTGGCTCGTAAACACAAAAGGACTGTACG 1309 880 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1310 GTGTTAAAACTTTGGCTCGTAAACACAAAAGGACTGTACG 1349 Hình 3.4 S sai khác trình t đoan gen matK lồi Melaleuca quinquenervia lồi Melaleuca viridiflora(các vị trí kh c đ Từ hình chúng tơi nhận thấy c ôi đỏ) điểm sai khác trình tự đoạn gen matK lồi Melaleuca quinquenervia với trình tự đoạn gen matK loài Melaleuca viridiflora Thay C A v trí 146 3.3.3 Trình t đoạn gen trnH-psbA Trình tự gen trnH-psbA đượ phân tí h kí h thước 568 p, đ khơng có sai khác mẫu nghiên cứu, kết tương đồng 100% Kết giải trình tự đoạn gen trnH-psbA mẫu Tràm n m gân sau: 5’CGCGCATGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTGATCCACTTGGCTAC ATCCGCCCCTATCTATTACTAGTATTTATATTTATTTTGATAACATTTT GAATTAAATTCAAAATAATGGAAAATATTTCATTTCGATTGTTAATTT TTAACATTTTTTTATCTTACTTATGAGATATAAGAAGCAGAAAATGAT AACCTTTCTAATTTATTCAAAAGAAACTAGAAGATAATAATCTCACA AAATATTCCAAAGGGTTGAAAAGAATGGATATAAATTCGAAATTCAT ATATAAGGAAAAAGGATGATACACAATAATAAACCAATCCCTAAGA CTAGACTACTTTTTTTCTTATGTTGAAGTAAAGAAAAACGGAAAAGA 25 GCACTAAATAAAGGAACAATAACCAATTTCTTATTCTATCAAGAGTG TTGGTTATTGCTCCTTTACTTTCCAATCAAAAAATCGCCTACACTTAT ACTAAGACCAAAGTCTTATCCATTTGTAGATGGAGCTTCAATAGCAG CTAGGTCTAGAGGGAAATTATGAGCATTACGTTCATGCATAAC’3 Các trình tự s u đ xử lý ngân hàng gen quốc tế NC I để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi có trình tự tương đồng theo đoạn gen trnH-psbA loài Tràm n m gân ằng cách sử dụng cơng cụ BLAST Một số lồi có trình tự gen tương đồng dùng so sánh với loài Tràm n m gân trình bày bảng 3.2 B ng 3.2 M t số lồi có trình t gen trnH- p t ng đồng với loài Melaleuca quinquenervia ngân hàng gen NCBI STT Tên loài Mã số Melaleuca cornucopiae Melaleuca argentea Melaleuca viridiflora Melaleuca nervosa Melaleuca acacioides Melaleuca glomerata Melaleuca arcana Melaleuca leucadendra EU410220.1 EU410224.1 EU410242.1 EU410231.1 EU410219.1 EU410221.1 EU410222.1 EU410229.1 Tỷ lệ t ng đồng 96.73% 97,76% 97.51% 97.51% 98.24% 97.22% 100% 100% Dự vào kết húng t i xây dựng ây ph t sinh hủng loại đượ thể hình 3.5 26 Melaleuca quinquenervia (GU135332.2) Hình 3.5 Cây phân loại d a vào trình t đoạn trnH-psbA tạo b i NCBI Từ phát sinh chủng loại dựa trình tự đoạn gen trnH-psbA, ta thấy lồi Melaleuca quinquenervia có quan hệ gần gũi với loài Melaleuca arcana xa với loài Melaleuca cornucopiae S uđ húng t i so s nh cấp độ loài theo đoạn gen trnH-psbA loài Melaleuca quinquenervia với trình tự gen lồi Melaleuca viridiflora AF184708.1 ngân hàng gen quốc tế, nhận sai khác đoạn gen thể s u: 27 Score Expect Identities Gaps Strand 682 bits(369) 0.0 392/402(98%) 5/402(1%) Plus/Minus Query CGCGCATGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTGATCCACTTGGCTACATCCGCCCCTATCT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 402 CGCGCATGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTGATCCACTTGGCTACATCCGCCCCTATCT 343 Query 61 ATTACTAGTATTTATATTT -ATTTTGATAACATTTTGAATTAAATTCAAAATAATG 115 Sbjct 342 ATTACTAGTATTTATATTTTAAATATTTTGATAACATTTTGAATTTAATTCAAAATAATG 283 Query 116 GAAAATATTTCATTTCGATTGTTAATTTTTAACAtttttttATCTTACTTATGAGATATA 175 ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| |||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| Sbjct 282 GAAAATATTTCATTTCGATTGTTAATTTTTAACAATTTTTTATCTTACTTATGAGATATA 223 Query 176 AGAAGCAGAAAATGATAACCTTTCTAATTTATTCAAAAGAAACTAGAAGATAATAATCTC 235 |||||||||||||||||||||||||| ||||||| ||| ||||||||||||||||||||| Sbjct 222 Query 236 AGAAGCAGAAAATGATAACCTTTCTAGTTTATTCGAAAAAAACTAGAAGATAATAATCTC 163 ACAAAATATTCCAAAGGGTTGAAAAGAATGGATATAAATTCGAAATTCATATATAAGGAA 295 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 162 ACAAAATATTCCAAAGGGTTGAAAAGAATGGATATAAATTCGAAATTCATATATAAGGAA 103 Query 296 AAAGGATGATACACAATAATAAACCAATCCCTAAGACTAGACTACtttttttCTTATGTT 355 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 102 AAAGGATGATACACAATAATAAACCAATCCCTAAGACTAGACTACTTTTTTTCTTATGTT Query 356 GAAGTAAAGAAAAACGGAAAAGAGCACTAAATAAAGGAACAA 43 397 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 42 GAAGTAAAGAAAAACGGAAAAGAGCACTAAATAAAGGAACAA Hình 3.6 S sai khác trình t đoạn gen trnH-psbA lồi Melaleuca quinquenervia lồi Melaleuca viridiflora (các vị trí kh c đ Từ hình chúng tơi nhận thấy c đỏ) điểm sai khác trình tự gen nghiên cứu với trình tự gen trnH-psbA lồi Melaleuca quinquenervia biết trước Thay A T v trí 100 Thay A G v trí 203 Thay A G v trí 211 Thay G A v trí 215 28 3.3.3 Trình t đoạn gen ITS2 Trình tự đoạn gen ITS2 đượ phân tí h kí h thướ 372 p, đ khơng có sai khác mẫu nghiên cứu, kết tương đồng 100% Kết giải trình tự đoạn gen ITS2 mẫu Tràm n m gân s u: 5’CTGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTC TTTGAACGCAAGTTGCGCCCATAACCATCTGGTGAGGGCACGTTTGC CTGGGTGTCACACATGGCGTTGCCCCGAATCACTTGCCCTTAATGTG GGCGGGAGGAATTTGGGCGCGTAAGTTGGCCTCCCGTGATGACTTGT CTCGGTTGGCCCAAAATCGAGCGTCGGAGCGACTAGCACCACGACAT TCGGTGGTTGATAAGACCCCAATGATCAATGTCGYGTGTGCCGCTCA ATCGCGCGCTTTGCGAATCTATTATTTACCAACGCGACCCCAGGTCA AGCGGGGCTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA’3 Các trình tự s u đ xử lý ngân hàng gen quốc tế NC I để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi có trình tự tương đồng theo đoạn gen ITS2 loài Tràm n m gân ằng cách sử dụng cơng cụ BLAST Một số lồi có trình tự gen tương đồng dùng so sánh với lồi tràm n m gân trình bày bảng 3.3 B ng 3.3 M t số lồi có trình t g n ITS2 t ng đồng với loài Melaleuca quinquenervia ngân hàng gen NCBI STT Tên loài Mã số Tỷ lệ t Melaleuca leucadendra MG757258.1 99.10% Melaleuca glomerata KM064819.1 94.51% Melaleuca bracteata KM064860.1 93.37% Melaleuca armillaris KM064887.1 93.70% Melaleuca viridiflora MH731227.1 99.00% Melaleuca stenostachya MH731199.1 99.00% Melaleuca saligna MH731185.1 99.00% Melaleuca clarksonii MH731096.1 93.70% 29 ng đồng Dự vào kết húng t i xây dựng ây ph t sinh hủng loại đượ thể hình 3.7 Hình 3.6 Cây phân loại d a vào trình t đoạn gen ITS2 tạo b i NCBI Từ phát sinh chủng loại dựa trình tự đoạn gen ITS2, ta thấy lồi Melaleuca quinquenervia có quan hệ gần gữi với lồi Melaleuca leucadendra có quan hệ xa với loài Melaleuca glomerata S u đ Melaleuca quinquenervia (GU135332 húng t i so s nh cấp độ loài theo đoạn gen ITS2 loài Melaleuca quinquenervia với trình tự gen lồi Melaleuca viridiflora AF184708.1 ngân hàng gen quốc tế, nhận sai khác đoạn gen thể s u: Score Expect Identities Gaps Strand 542 bits(293) 4e-150 298/301(99%) 0/301(0%) Plus/Plus Query CTGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 277 CTGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTT 336 Query 61 GCGCCCATAACCATCTGGTGAGGGCACGTTTGCCTGGGTGTCACACATGGCGTTGCCCCG 120 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 337 GCGCCCATAACCATCTGGTGAGGGCACGTTTGCCTGGGTGTCACACATGGCGTTGCCCCT 396 Query 121 AATCACTTGCCCTTAATGTGGGCGGGAGGAATTTGGGCGCGTAAGTTGGCCTCCCGTGAT 180 Sbjct 397 AATCACTTGCCCTTAATGTGGGCGGGAGGAATTTGGGCGCGTAAGTTGGCCTCCCGTGAT 456 Query 181 GACTTGTCTCGGTTGGCCCAAAATCGAGCGTCGGAGCGACTAGCACCACGACATTCGGTG 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 30 Sbjct 457 GACTTGTCTCGGTTGGCCCAAAATCGAGCGTCGGAGCGACTAGCACCACGACATTCGGTG 516 Query 241 GTTGATAAGACCCCAATGATCAATGTCGYGTGTGCCGCTCAATCGCGCGCTTTGCGAATC 300 |||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||| |||||||| Sbjct 517 Query 301 GTTGATAAGACCCCAATGATCAATGTCGCGTGTGCCGCTCAATCGCGCGCTCTGCGAATC T 576 301 | Sbjct 577 T 577 Hình 3.7 S sai khác trình t đoạn gen ITS2 lồi Melaleuca quinquenervia lồi Melaleuca viridiflora(các vị trí kh c đ Từ hình chúng tơi nhận thấy c ôi đỏ) điểm sai khác trình tự đoạn gen ITS2 nghiên cứu với trình tự gen ITS2 lồi Melaleuca viridiflora Thay Y C v trí 270 Thay T C v trí 293 3.3.4 So sánh kh phân iệt đoạn trình t matK, trnH-psbA, ITS2 đoạn gen matK, trnH-psbA, ITS2 Dựa vào kết so sánh trình tự trình tự gen loài, ta lập bảng so sánh khả n ng phần biệt củ đoạn trình tự matK, trnH-psbA, ITS2 s u: T n đoạn gen matK trnH-psbA ITS2 Số điểm sai khác 568bp 372bp 0.7% 0.53% Kí h thƣớc trình 880bp t Tỷ lệ sai khác 0.11% Nh n xét: Kết phân tích cho thấy so sánh trình tự matK, rbcL trnH-psbA củ loài Tràm n m gân (Melaleuca quinquenrvia) với lồi Melaleuca viridiflora Trình tự đoạn gen matK có điểm sai khác, trình tự đoạn gen ITS2 có điểm sai khác trình tự đoạn gen trnH-psbA có điểm sai khác Tỉ lệ sai khác trình tự trnH-psbA cao (0 7%) đ khả n ng phân iệt loài gen trnHpsbA ũng tốt tỉ lệ sai khác trình tự matK thấp (0.11%) đồng nghĩ với khả n ng phân iệt loài gen Tỉ lệ sai khác trình tự ITS2(0.53%) thấp trnH-psbA (0 7%) kh ng đ ng kể (0,17%) 31 o matK nên đoạn gen ITS2 cho kết tương qu n độ xác khơng nhỏ Kết tương qu n loài mà gen ITS2 th hoàn toàn phù hợp với phân loại lồi trướ đ dựa vào hình thái Mặc dù vậy, cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự matK, ITS2 trnH-psbA để x đ nh xác lồi cần đ nh danh 32 CHƢƠNG KẾT UẬN VÀ KIẾN NGH Kết n Đã t h hiết tinh thành công DNA tổng số mẫu Tràm n m gân Đã nhân ản thành công gen matK, ITS2 trnH-psbA kỹ thuật PCR từ DNA tổng số mẫu thu Đã x đ nh trình tự đoạn gen matK, ITS2 trnH-psbA Tràm n m gân Đã xây dựng đượ dòng Tràm kh ây ph t sinh hủng loại ủ Tràm n m gân với ngân hàng gen quố tế Đoạn trnH-psbA có khả n ng phân iệt o so với đoạn matK, ITS2 so sánh loài psbA củ loài Tràm n m gân (Melaleuca quinquenrvia) với loài Melaleuca viridiflora Mặc dù cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự để x đ nh xác lồi cần đ nh danh 4.2 Kiến nghị • C ng ố trình tự gen matK, ITS2 trnH-psbA lên Ngân hàng Gen Quốc tế để phục vụ nghiên cứu sau • Tiếp tụ x đ nh đoạn DNA r ode kh đối tượng Tràm n m gân • Tiếp tục thu thập mẫu Tràm n m gân v ng đ lý kh nh u để đ nh gi tồn diện tính đ dạng di truyền lồi • Nghiên ứu ứng dụng mã vạ h DNA để xây dựng sở liệu DNA barcode cho loài thực vật Việt Nam • Sử dụng gen matK, ITS2 trnH-psbAvào việ gi m đ nh loài Tràm n m gân Việt N m, đồng thời tiến hành nghiên cứu với mồi kh dấu hiệu x để tìm đ nh loài khác nhằm phân loại cách xác cụ thể 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT PGS.TS Triệu V n Hưng (2007 L n ng i g i t , Dự án Hỗ trợ Chuyên ngành Lâm sản gỗ Việt Nam – Phần II, trang 724-727 Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, NX Đại học Quốc Gia Hà Nội PGS.TS Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Hồ Huỳnh Th y Dương (2005), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục – Hà Nội, trang 191-198 Nguyễn Đứ Lượng (2002), Công ngh gen NX Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Đinh Hồng Long, Đỗ Lê Th ng (2008), “Cơ di truyền học phân tử tế b ”, NX Đại học Quốc Gia Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H , Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-inv sive rel tives”, Molecular Ecology Resources(9), pp.1086-1091 Vij y n K nd Tsou C H (2010), “DNA r oding in pl nts: t xonomy in new perspe tive”, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W (2003), “Non oding pl stid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of s l ngiosperms”, J Evol Biol, (6), pp 558-576 10 Sh w J , Li key E , S hilling E E , Sm ll R L (2007),” Comp rison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogeneti studies in ngiosperms”, The tortoise and the hare III Amer J Bot, (94), pp 275-288 11 Van den Berg C., Higgins W E., Dressler R L., Whitten W M., Soto Aren s M A , Culh m A , Ch se M W (2000), “A phylogeneti n lysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed sp ers (ITS) of ri osom l DNA”, Lindleyana (15), pp.96114 12 Kress W J , Eri kson D L (2008), “DNA r odes: Genes, genomi s, nd ioinform ti s”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp 2761-2762 13 Ole S nd Gitte P (2009), “How m ny lo i does it t ke to DNA r ode ro us?”, PLoS ONE, 4(2), pp 4598 14 Y o H , Song J , Liu C , Luo K , H n J (2010), “Use of ITS2 region s theunivers l DNA r ode for pl nts nd nim ls”, PLoS ONE (5), pp.13102 15 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L and Hui Y (18 December, 2010) “Authenti tion of T xillus hinensis using DNA r oding te hnique”, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(24), pp 2706-2709 16 W ng W , Wu Y , Y n Y , Erm kov M , Kerstetter R (2010) “DNA r oding of the Lemn e e, f mily of qu ti mono ots”, BMC Plant Biology (10), pp.205 17 Stor hov H , M S Olson (2007), “The r hite ture of the hloropl st psbA-trnH non oding region in ngiosperms” Plant systematic and evolution Biomedical and life sciences, Vol 268, No 1-4, pp 235-256 18 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V , Gér rd C , Christi n , nd Eske W (2007),” Power nd limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA r oding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14 19 Hollings worth Pm, G S Little Dp (2011), “Choosing and using a Plant DNA Barcode”, PloS ONE, 65 20 Miwa H, O.I Matsui a, Hascgawa M, Akiyama H, Et, Al (2009),”Adaptive evolution of rbcL in Conocephalum (Hepaticae, bryophytes)”, Gene, 441, pp 169 – 175 WEBSITE 21.https://vi.wikipedia.org/w/index.php?search=Melaleuca+quinquenervia&title =%C4%90%E1%BA%B7c+bi%E1%BB%87t%3AT%C3%ACm+ki%E1%BA %BFm&profile=advanced&fulltext=1&advancedSearchcurrent=%7B%7D&ns0=1 22.http://baothuathienhue.vn/hy-vong-moi-tu-cay-tram-nam-gan-a10125.html 23 https://khoahocvacongnghevietnam.com.vn/file_pdf/12b-31-36.pdf 24 http://www.caycongtrinh.com.vn/cay-cong-trinh/cay-tram 25 tinhdautram.com.vn ngày 23/5/1019 ... barcode ho loài Tràm n m gân (Melaleuca quinquenervia) phục vụ gi m đ nh loài ” CHƢƠNG : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1 Nguồn gốc phân bố Tràm năm gân Tràm n m gân (Melaleuca. .. củ loài Tràm n m gân (Melaleuca quinquenervia) dựa th mã vạch DNA Phƣơn pháp n hi n ứu 2.3.1 Đối t ng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Tràm n m gân (Melaleuca quinquenervia) 2.3.2 V t liệu nghiên. .. n m gân (Melaleuca quinquenervia) +X đ nh mối quan hệ di truyền loài Tràm n m gân (Melaleuca quinquenervia) với loài Tràm khác ngân hàng gen NCBI 2.2 Nội dung nghiên cứu - Tách chiết tinh DNA