Nghiên cứu khả năng kháng salmonella gây bệnh tiêu chảy ở gà của một số dịch chiết dược liệu

LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài làm khố luận tốt nghiệp tơi nhận đƣợc giúp đỡ tận tình từ thầy giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - trƣờng Đại học Lâm nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Hồng Gấm ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn, giúp đỡ đóng góp ý kiến q báu để tơi hồn thành đề tài Đồng thời, xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo thuộc môn Cơng nghệ Vi sinh - Hóa sinh tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Thơng qua q trình thực đề tài, học đƣợc nhiều điều rút đƣợc nhiều học kinh nghiệm quý báu Vì kiến thức thân cịn hạn chế nên khóa luận khơng tránh khỏi sai sót, kính mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp thầy Sinh viên thực Cấn Thị Nhung i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Salmonella Lịch sử phát 1.1.2 Phân loại Đặc điểm hình thái Cấu trúc Salmonella Điều kiện sinh trƣởng 1.1.6 Yếu tố độc lực Cơ chế gây bệnh 1.2 Các bệnh nhiễm Salmonella gia cầm 10 1.2.1 Bệnh bạch lị 10 1.2.2 Bệnh thƣơng hàn gà 11 1.2.3 Bệnh thƣơng hàn gà cấp mãn tính 11 1.2.4.Bệnh phó thƣơng hàn gà 12 1.3 Một số dƣợc liệu có khả kháng khuẩn 13 1.3.1 Cây trầu không 13 1.3.2 Cây cỏ sữa nhỏ 14 1.3.4 Nấm linh chi 16 1.3.5 Lá ổi 17 ii 1.3.6 Lan kim tuyến 19 Đông trùng hạ thảo 20 Lá mơ 21 1.4 Tình hình ngiên cứu 22 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 22 1.4.2 Tình hình ngiên cứu nƣớc 23 CHƢƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG, ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 25 2.2 Nội dung nghiên cứu 25 Đối tƣợng nghiên cứu 25 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.4.1 Phân lập vi khuẩn Salmonella từ phân gà 25 Các Phƣơng pháp tạo dịch chiết dƣợc liệu 30 Phƣơng pháp thử tính kháng khuẩn khuếch đại qua giếng thạch 31 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Kết phân lập vi khuẩn Salmonella 32 3.2.Kết thử tính kháng Salmonella dịch chiết dƣợc liệu 36 3.2.1 Kết thử tính kháng Salmonella dịch chiết từ thảo dƣợc tƣơi 36 3.2.2 Tính kháng Salmonella Dịch chiết dƣợc liệu đun sôi 1000C 37 3.2.3 Khả kháng Salmonella cao chiết dƣợc liệu 40 KẾT LUẬN 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 : Phân biệt kháng nguyên O,K,H Bảng 1.2 Các tính chất hóa sinh Salmonella [13] Bảng Môi trƣờng thành phần môi trƣờng 26 Bảng 3.1: Các phản ứng hóa sinh 33 Bảng 3.2: Kết thử phản ứng hóa sinh 35 Bảng 3.3 Kết thử tính kháng Salmonella dịch chiết từ thảo dƣợc tƣơi chủng C1 chủng C2 36 Bảng 3.4 Kết thử nghiệm tính kháng Salmonella dịch chiết dƣợc liệu đun sôi 1000C chủng C1 37 Bảng 3.5 Kết thử nghiệm tính kháng Salmonella dịch chiết dƣợc liệu đun sôi 1000C chủng C2 38 Bảng 3.6 Kết thử tính kháng Salmonella cao chiết dƣợc liệu 40 chủng C1 40 Bảng 3.7 Kết thử tính kháng Salmonella cao chiết dƣợc liệu chủng C2 41 Bảng 3.8 Kết thử tính kháng khuẩn cao chiết Đông trùng hạ thảo Linh chi 42 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1.Hình ảnh trầu không 13 Hình 1.2 Hình ảnh cỏ sữa 14 Hình 1.3 Hình ảnh diếp cá 15 Hình 1.4 Hình ảnh nấm Linh chi 16 Hình 1.5 Hình ảnh ổi 17 HÌnh 1.6 Hình ảnh lan Kim tuyến 19 Hình 1.7 Hình ảnh đơng trùng hạ thảo 20 Hình 1.8 Hình ảnh mơ 21 Hình 3.2: Hình ảnh nhuộm gram chủng C1 (A), chủng C2 (B) dƣới kính hiển vi (X100) 35 Hình 3.3: Tính kháng Salmonella số dịch chiết tƣơi chủng C1 chủng C2 36 Hình 3.4 Tính kháng Salmonella dịch chiết trầu không đun sôi 39 Hình 3.5: Tính kháng Salmonella dịch chiết cỏ sữa đun sơi 39 Hình 3.6.Tính kháng Salmonella ổi đun nóng 39 Hình3.7 : Tính kháng Salmonella diếp cá với dịch chiết đƣợc đun sơi 39 Hình 3.8: Khả kháng Salmonella cao chiết trầu khơng 43 Hình 3.9: Khả kháng Salmonella cao chiết ổi 43 Hình 3.10: Khả kháng Salmonella cao chiết cỏ sữa 43 Hình 3.11: Khả kháng Salmonella cao chiết diếp cá 43 Hình 3.12 Sự khác tính kháng Salmonella thu dịch chiết phƣơng pháp khác trầu không 44 Hình 3.13 Sự khác tính kháng khuẩn thu dịch chiết phƣơng pháp khác cỏ sữa 44 Hình 3.14 Sự khác tính kháng Salmonella thu dịch chiết phƣơng pháp khác ổi 44 Hình 3.15 Sự khác tính kháng Salmonella thu dịch chiết phƣơng pháp khác diếp cá 44 Hình 3.16 So sánh nhóm kháng Salmonella tốt- Trung bình- Kém 45 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Giải nghĩa Từ viết tắt BPW Buffered pepton water CHO Chinese Hamster Ovary cell CT Choleratoxin like enterotoxin DCA Deoxycholate citrate agar DPF Độc tố thẩm xuất chậm (Delayed permeability factor) HE Hektoen Entric Agar KIA Kliger Iron Agar LPS Lipopolysaccharide LT Heat- Labile toxin MIC MR-VP both Nồng độ ức chế tối thiểu Glucose phosphate RPF Độc tố thẩm xuất nhanh (Rapid permeability factor) RSU Rustigian - Stuart Urea borth RV Rappaport- Vassiliadis soya pepton TSA Tryptone soya agar XLD Xylose Lysine desoxycholate vi ĐẶT VẤN ĐỀ Gà vật nuôi phổ biến Việt Nam, nhiên việc ni gà thƣờng theo mơ hình tự phát nhỏ lẻ, đàn gà mắc bệnh ngƣời dân thƣờng chữa bệnh theo kinh nghiệm tự ý mua thuốc nhƣ sử dụng thuốc không theo liều lƣợng dẫn đến việc điều trị bệnh không hiệu Việc sử dụng loại hoá chất kháng sinh ph ng trị bệnh cho vật nuôi không quy cách liều lƣợng gây ảnh hƣởng lớn tới môi trƣờng, tạo điều kiện phát sinh d ng vi khuẩn kháng thuốc, không loại trừ khả chủng vi khuẩn kháng thuốc gây bệnh ngƣời Một bệnh thƣờng xuất gà bệnh ỉa chảy vi khuẩn Salmonella gây [2,8] Việt Nam vốn đƣợc biết đến đất nƣớc với nguồn tài nguyên dƣợc liệu dồi dào, phong phú thuận lợi việc nghiên cứu điều chế loại thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên để phục cho nhu cầu chăm sóc sức khỏe ngƣời vật ni Trong có nhiều loại có hoạt tính kháng khuẩn đƣợc nhân dân ta sử dụng để chữa bệnh có bệnh liên quan đến đƣờng ruột nhƣ tiêu chảy, kiết lỵ,… Việc sử dụng loại dƣợc liệu điều trị bệnh hiệu không cao nhƣng chúng khắc phục đƣợc số nhƣợc điểm kháng sinh thơng thƣờng nhƣ tính kháng thuốc, hạn chế việc phát sinh d ng vi khuẩn kháng kháng sinh, không gây ảnh hƣởng tới sức khỏe ngƣời vật ni Do đó, chúng tơi thực đề tài :“Nghiên cứu khả kháng Salmonella gây bệnh tiêu chảy gà số dịch chiết dược liệu”nhằm xác định đƣợc khả ức chế Salmonella gây bệnh Tiêu chảy gà số dịch chiết dƣợc liệu CHƢƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Salmonella ịch s phát Salmonella đƣợc lấy tên từ nhà khoa học ngƣời Mỹ, Daniel Elmer Salmonmột nhà nghiên cứu bệnh lý động vật Nhƣng thực chất ông phát mà nhà khoa học Theobald Smith D E Salmon công bố trƣớc T Smith bạn đồng nghiệp D E Salmon, làm việc Bureau of Animal Industry (BAI) vào năm 884 Salmonella vi khuẩn nguy hiểm Loại vi khuẩn sống ống ruột ngƣời động vật khác Giống vi khuẩn có nhiều loại khác nhau, loại phổ biến mà nhà khoa học mỹ tìm thấy nƣớc chủng S.typhimurium S.enteritidis gây bệnh Samonellosis Vi sinh vật gây bệnh đƣờng ruột quan trọng khía cạnh bệnh học, dịch tễ học, vi sinh mơi trƣờng, vi sinh an tồn thực phẩm Vi khuẩn phân bố rộng khắp tự nhiên, xâm nhiễm gây bệnh cho ngƣời, động vật máu nóng, động vật máu lạnh dƣới nƣớc cạn 11] h n o i Về phân loại khoa học, Salmonella đƣợc xếp vào: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Salmonella Đặc điểm hình thái Salmonella vi sinh vật thuộc họ vi khuẩn đƣờng ruột Enterobacteriaceae Salmonella vi khuẩn gram (-) (khi nhuộm kĩ thuật gram vi khuẩn bắt màu đỏ hồng), hình que, kích thƣớc khoảng ,6 x 2, mm, hiếu khí kị khí tùy nghi, có tiên mao, di động (trừ u v u u ) không tạo bào tử, k m đề kháng với giới bên ngoài, sinh hơi, lên men dextrosa, sinh khí dihydrosunfua H2S [9] 1.1 C u tr c củaSalmonella Có ba loại kháng nguyên chất xuất thể tạo kích thích đáp ứng miễn dịch kết hợp đặc hiệu với sản phẩm kích thích gồm: kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H kháng nguyên vỏ K Vi khuẩn thƣơng hàn (S.typhi) có kháng nguyên V (Virulence) yếu tố chống thực bào giúp cho vi khuẩn thƣơng hàn phát triển bên tế bào bạch cầu 9] Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O): Thành phân vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm lớp Trong lớp peptidoglycan mỏng, cách lớp không gian chu chất tới lớp màng (outer membrane) phức hợp lipid polysaccharide gồm lipoprotein lipopolysaccharide Bao bên lớp peptidoglycan lớp phospholipid A B (quyết định độc tố Nội độc tố), sau hai lớp polysaccharide khơng mang tính đặc hiệu Kháng nguyên nội độc tố có chất hóa học lypo polysaccharide (LPS) Tính đặc hiệu kháng nguyên O LPS một, nhƣng tính miễn dịch khác nhau: kháng nguyên O LPS c n bao gồm lớp peptidoglycan nên tính sinh miễn dịch mạnh LPS Màng ngồi có cấu trúc gần giống tế bào chất nhƣng phospholipid hầu nhƣ gặp lớp trong, c n lớp lipopolysaccharide dày khoảng 8-10 nm gồm thành phần: - Lipid A - Polysaccharide lõi - Kháng nguyên O Màng cịn có thêm protein: - Protein chất: protein vi khuẩn c n gọi protein lỗ xuyên màng với chức cho ph p số loại phân tử qua chúng nhƣ dipeptide, disaccharide, ion vơ - Protein màng ngồi: chức vận chuyển số phân tử riêng biệt đƣa qua màng ngồi - Lipoprotein: Đóng vai tr liên kết lớp peptidoglycan bên với lớp màng Kháng nguyên vỏ (kháng nguyên K - kapsule): Bản chất hóa học vỏ vi khuẩn polypeptid polysaccharide Vỏ vi khuẩn gây miễn dịch không mạnh nhƣng gắn với tế bào vi khuẩn vỏ gây đƣợc miễn dịch Kháng nguyên vỏ đƣợc dùng để phân loại chủng Salmonella [11] Kháng nguyên lông (kháng nguyên H) : Đƣợc tổng hợp từ acid amin dạng D (dạng gặp tự nhiên) Do việc xử lý kháng nguyên tế bào miễn dịch không thuận lợi đáp ứng kháng thể không mạnh Khi sợi lông bị kết hợp khángthể đặc hiệu,lông bị bất động, vi khuẩn di chuyển đƣợc Kháng nguyên vỏ đƣợc dùng để phân loại số chủng Salmonella [11] Bảng Kháng nguyên O K H 1.1 : h n biệt kháng nguyên O, K, H Tính chịu nhiệt Tác động alcohol 50% Formol 50% Kháng Bị ngăn trở ngƣng kết Nhạy cảm kháng Nhạy cảm kháng Ổn nhiệt 2h3 ’ 1000C Biến nhiệt 5’ 6” C Biến nhiệt 2h 1000C Đi u kiện sinh trưởng Salmonella phát triển đƣợc môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng Trên môi trƣờng thích hợp, vi khuẩn phát triển sau 24 Có thể mọc Bảng 3.2: Kết th phản ứng hóa sinh Phản ứng hóa sinh Chủng C1 Chủng C2 Chủng C3 + + + VP - - - Thử nghiệm urea - - - Sự khử nitrate + + - Sử dụng sucrose - - - Catalase + + + Khử citrat + + + Phản ứng thử nghiệm sinh H2S Từ kết bảng bảng đối chiếu theo khóa phân loại Bergey’s ( 994) chiếu theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 39-5:2 Phụ gia thực phẩm đặc tính sinh hóa Salmonella loại bỏ chủng C3 khơng phải Salmonella Hình ảnh 3.2 cho thấy hình ảnh dƣới kính hiển vi hai chủng C chủng C2 cho thấy hai chủng trực khuẩn gram âm bắt màu hồng A B Hình 3.2: Hình ảnh nhuộm gram chủng C1 (A), chủng C2 (B) dƣới kính hiển vi (X100) 35 Từ kết phản ứng hóa sinh theo hình thái vi khuẩn chiếu theo theo khóa phân loại Bergey’s ( 994) Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11039-5:2015 Phụ gia thực phẩm - Phƣơng pháp phân tích vi sinh vật - Phần 5: Phát Salmonella [9] ta bƣớc đầu nhận định đƣợc hai chủng vi khuẩn Salmonella kí hiệu C1 C2 3.2 Kết thử tính kháng Salmonella dịch chiết dƣợc liệu 3.2.1 Kết th tính kháng Salmonella dịch chiết từ thảo dược tươi Sau tiến hành thử nghiệm tính kháng Salmonella loại dịch chiết trực tiếp từ trầu không, diếp cá, mơ, lan kim tuyến, ổi cỏ sữa ta thu đƣợc kết nhƣ sau: Bảng 3 Kết th tính khángSalmonella dịch chiết từ thảo dược tươi chủng C chủng C Đƣờng kính vịng kháng khuẩn (mm) C1 C2 Trầu không 18,7 ± 1,1 22,3 ± 0,9 Lá ổi 15,0 21,0 ± 1,3 Diếp cá Cỏ sữa 12 ± 0,67 14,6 ± 0,47 Lan kim tuyến Lá mơ Từ bảng 3.3 cho thấy có loại dƣợc liệu có khả kháng Salmonella Tên dƣợc liệu Trong dịch chiết trầu khơng cho kết kháng Salmonella tốt với đƣờng kính vịng kháng khuẩn trung bình 18,7 mm chủng C1 22,3 mm chủng C2 a b c Hình 3.3 Tính kháng Salmonella số dịch chiết tƣơi chủng C chủng C2 36 Hình 3.3.a: Tính kháng Salmonella số dịch chiết tƣơi chủng C (1- ổ , 2-lá ơ, 3- d ế cá, 4- t ầu khô , 5- cỏ sữ , 6- L K tuyế ) Hình 3.3.b: Tính kháng Salmonella số dịch chiết tƣơi chủng C2 (1- ổ , 2-lá ơ, 3- d ế cá, 4- t ầu khô , 5- cỏ sữ ) Hình 3.3.c: Tính kháng Salmonella dịch chiết lan kim tuyến chủng C2 So với kết thu đƣợc tác giả Võ Thị Thùy Linh thử khả kháng Salmonella dịch chiết tỏi, hẹ húng quế trầu khơng,lá ổi, cỏ sữa cho kết tốt Khả kháng Salmonella trầu khơng (đƣờng kính v ng kháng khuẩn 18,7 ± 1,1mm/chủng C1 22,3±0,9mm/chủng C2 ) tốt so với dịch chiết tỏi (đƣờng kính vịng kháng khuẩn 19,33±0,5mm) Dịch chiết ổi (đƣờng kính v ng kháng khuẩn 15mm/chủng C1 21±1,3mm/chủng C2), cỏ sữa (đƣờng kính vịng kháng khuẩn 12 ± 0,67/chủng C1 14,6±0,47/chủng C2) tốt so với dịch chiết hẹ (đƣờng kính v ng kháng khuẩn 8,33 ± 0,5mm) Lan kim tuyến, mơ, diếp cá khả ức chế Salmonella phƣơng pháp thu dịch chiết 3.2.2 Tính kháng Salmonella Dịch chiết dược iệu đun sôi 000C Khi đun nóng dƣợc liệu với nƣớc để thu dịch chiết đem thử tính kháng khuẩn chúng với chủng vi khuẩn phân lập đƣợc bƣớc ta thu đƣợc kết nhƣ bảng dƣới đây: Bảng Kết th nghiệm tính kháng Salmonella dịch chiết dược iệu đun sôi 1000C chủng C Tên dƣợc liệu Trầu không ổi Diếp cá Lan kim tuyến Cỏ sữa Lá mơ Đông trùng hạ thảo Linh chi Vịng kháng khuẩn Dịch đun sơi 15 Dịch đun sôi 30 Dịch đun sôi 45 phút (A1) phút (A2) phút (A3) 17,67± 0,44 20,67± 0,44 23,33± 0,44 17,67± 0,44 21,0 20,67± 0,44 12,67± 0,44 13,67± 0,44 12,67± 1,22 - 37 - Đánh giá kết quả: - Dịch chiết trầu không công thức A3 cho kết kháng chủng C tốt nhấtvới v ng kháng trung bình 23,33±0,44mm gấp ,33 lần so với cơng thức A1 gấp , lần so với công thức A2 - Dịch chiết ổi công thức A2 cho kết kháng chủng C tốt nhấtvới v ng kháng khuẩn trung bình 21mm gấp 1, lần so với công thức A 1,01 lần so với công thức A3 - Dịch chiết cỏ sữa công thức A2 cho kết kháng chủng C tốt với v ng kháng khuẩn trung bình 13,67±0,44mm gấp , lần so với công thức A1 A3 Dịch chiết lan kim tuyến, mơ, diếp cá, đông trùng hạ thảo, Linh chi phƣơng pháp hiên khả kháng chủng C Bảng Kết th nghiệm tính kháng Salmonella dịch chiết dược iệu đun sôi 000C chủng C Tên dƣợc liệu Vịng kháng khuẩn (mm) Dịch đun sơi 15 Dịch đun sôi 30 Dịch đun sôi 45 phút (A1) phút (A2) phút (A3) 13,67± 0,44 17 22,67± 1,11 21,33± 0,44 22,67± 0,44 21 18,67± 0,44 17 14,67± 1,11 - Trầu không ổi Diếp cá Lan kim tuyến Cỏ sữa Lá mơ Đông trùng hạ thảo Linh chi Kết cho thấy : - - - - Dịch chiết trầu không công thức A3 cho kết kháng chủng C2 tốt với v ng kháng trung bình 22,67±1,11mm gấp ,7 lần so với công thức A gấp 1,3 lần so với công thức A2 - Dịch chiết ổi công thức A2 cho kết kháng chủng C2 tốt với v ng kháng khuẩn trung bình 22,67±0,44mm gấp 1,06 lần so với công thức A 1.08 lần so với công thức A3 38 - Dịch chiết cỏ sữa công thức A cho kết kháng chủng C2 tốt với v ng kháng khuẩn trung bình 18,67±0,44 mm gấp , lần so với cơng thức A2 gấp ,27 lần so với công thức A3 Dịch chiết lan kim tuyến, mơ, diếp cá, đông trùng hạ thảo, Linh chi khả kháng chủng C2 Với phƣơng pháp thu dịch chiết này, loại dƣợc liệu khác thời gian đun sôi khác cho kết kháng Salmonella khác Trong phƣơng pháp nhận thấy có loại dƣợc liệu trầu không, ổi cỏ sữa có khả kháng Salmonella Lan kim tuyến, mơ, diếp cá, đông trùng hạ thảo, Linh chi với phƣơng pháp thu dịch chiết cách đun sôi C khả kháng Salmonella Một số hình ảnh ảnh hƣởng nhiệt độ đến tính kháng khuẩn dƣợc liệu A B A Hình 3.4 Tính kháng Salmonella dịch chiết trầu khơng đun sôi (Achủ C , B- chủ C2) A B B Hình 3.5: Tính kháng Salmonella dịch chiết cỏ sữa đun sôi (A- chủng C1, B- chủng C2) A B Hình 3.6.Tính kháng Salmonella Hình3.7 : Tính kháng Salmonella diếp cá với dịch chiết đƣợc đun sơi (Aổi đun nóng (A- chủ C , Bchủ C , B- chủ C2) chủ C2) 39 3.2.3 Khả kháng Salmonella cao chiết dược iệu Sau tiến hành thử nghiệm tính kháng Salmonella loại cao chiết từ trầu không, diếp cá, mơ, lan kim tuyến,lá ổi cỏ sữa thu đƣợc kết nhƣ bảng 6: Bảng Kết th tính kháng Salmonellacủa cao chiết dược iệu chủng C Tên dƣợc liệu Trầu không Lá ổi Diếp cá Lan kim tuyến Cỏ sữa Lá mơ Vòng kháng khuẩn (mm) Cao chiết ngày Cao chiết ngày Cao chiết ngày B1 B2 B3 17,67± 0,44 29,00 ± 0,67 28,00± 0,67 17,00 ± 0,67 19,00 ± 1,33 21,67±1,11 6,33±1,11 7,67± 1,22 10,33± 1.11 3,00 ±0,67 4,00 ± 0,67 3,00 ± 0.67 7,67± 0,89 13,00 ± 0,67 16,67± 0,67 - Kết cho thấy: Trầu không cho kết kháng chủng C1 tốt công thức B2 với vòng kháng khuẩn 29,00± 0,67 mm gấp ,64 lần so với công thức B gấp ,04 so với công thức B3 Lá ổi cho kết kháng chủng C1 tốt công thức B3 với v ng kháng khuẩn21,67± 1,11 mm gấp ,27 lần so với công thức B 1, lần so với công thức B2 Diếp cá cho khả kháng chủng C1 tốt công thức B3 với v ng kháng khuẩn 10,33± 1,11mm gấp 1,63 lần so với công thức B gấp ,35 lần so với công thức B2 Lan kim tuyến cho kết kháng tốt công thức B2 với v ng kháng khuẩn 4,00±0,67mm gấp ,33 lần so với công thức B B3 Cỏ sữa cho kết kháng chủng C tốt công thức B3 với v ng kháng khuẩn 16,67± 0,67 mm gấp 2, lần so với công thức B gấp 1,28 lần so với công thức B2 40 Lá mơ với công thức B , B2, B3 khả kháng chủng C1 Bảng Kết th tính kháng Salmonella cao chiết dược iệu chủng C2 Tên dƣợc liệu Trầu không Lá ổi Diếp cá Lan kim tuyến Cỏ sữa Lá mơ Vòng kháng khuẩn (mm) Cao chiết ngày Cao chiết ngày Cao chiết ngày B1 B2 B3 18,67± 0,56 31,33± 1,11 24,33± 0,89 16,33±0,89 17,33± 1,11 21,00 ±0,67 6,33± 1,11 7,67± 0,89 12,00 ± 1.67 4,00± 0,67 7,33± 0,44 1,67±0,33 7,33± 0,44 8,33± 0,89 17,00 ± 0,67 - Kết cho thấy: Trầu không cho kết kháng chủng C2 tốt công thức B2 với v ng kháng khuẩn ,33± 1,11mm gấp ,68 lần so với công thức B gấp ,28 lần so với công thức B3 Lá ổi cho kết kháng chủng C2 tốt công thức B3 với v ng kháng khuẩn 21± 0,67 mm gấp ,33lần so với công thức B ,25 lần so với công thức B2 Diếp cá cho khả kháng chủng C tốt công thức B3 với v ng kháng khuẩn 12 ± 1,67mm gấp ,90 lần so với công thức B gấp ,56 lần so với công thức B2 Lan kim tuyến cho kết kháng chủng C2 tốt công thức B2 với v ng kháng khuẩn 7,33 ± 0,44 mm gấp ,83 lần so với công thức B gấp 4,4 lần so với công thức B3 Cỏ sữa cho kết kháng chủng C2 tốt công thức B3 với v ng kháng khuẩn 17± 0,67mm gấp 2,69 lần so với công thức B gấp 2,31 lần so với công thức B2 Lá mơ với công thức B1, B2, B3 không kháng chủng C2 41 Bảng Kết th tính kháng khuẩn cao chiết Đơng trùng h thảo Linh chi Tên thảo dƣợc Chủng vi khuẩn Vòng kháng khuẩn (mm) Cao chiết Cao chiết Cao chiết ngày (B1) ngày(B3) ngày (B4) C1 - - - C2 C1 Linh chi C2 - Đánh giá kết quả: - - - Đông trùng hạ thảo Kết cho thấy Linh chi đông trùng hạ thảo công thức B , B3, B4, khơng có khả kháng hai chủng C C2 Tóm lại với phƣơng pháp sử dụng dịch cao chiếtdƣợc liệu cho thấy có loại dƣợc liệu có khả kháng Salmonella Trầu không, ổi, cỏ sữa, diếp cá, lan kim tuyến Trong trầu khơng loại có khả kháng Salmonella tốt So với loại dịch cao chiết huyền diệp đƣợc thử tính kháng Salmonella tác giả Nguyễn Bá phƣớc với dịch cao chiết ethanol cho đƣờng kính vịng kháng Salmonella trung bình 20,33± ,58 mm dịch cao chiết trầu khơng cơng thức B2 (đƣờng kính v ng kháng khuẩn 29mm/chủng C1, 31,33mm/chủng C2)và cao chiết ổi công thức B3( đƣờng kính v ng kháng khuẩn 21,67mm/chủng C1, 21mm/chủng C2) cho kết kháng Salmonella tốt Do đó, ta hồn tồn sử dụng trầu khơng ổi việc điều trị bệnh Salmonella gây thay sử dụng huyền diệp hai loại trầu không ổi phổ biến Việt Nam Lá mơ, đông trùng hạ thảo linh chi thí nghiệm khơng kháng Salmonella Một số hình ảnh : 42 A B A Hình 3.8 Khả kháng Salmonella cao chiết trầu không (A- chủ C1, B- chủ C2) A B Hình 3.9 Khả kháng Salmonella cao chiết ổi (A- chủ C , Bchủ C2) A B B Hình 3.10 Khả kháng Salmonella Hình 3.11 Khả kháng Salmonella cao chiết diếp cá (A- chủ cao chiết cỏ sữa (A- chủ C , C1, B- chủ C2) B- chủ C2) Qua kết nhận thấy : + Với phƣơng pháp thu dịch chiết dƣợc liệu khác cho ta kết kháng Salmonella khác + Nhiệt độ thời gian đun nóng có ảnh hƣởng nhiều đến hoạt tính kháng Salmonella + Với phƣơng pháp sử dụng cao chiết thời gian ngâm kiệt có ảnh hƣởng tới khả kháng Salmonella loại dƣợc liệu Theo Huỳnh Kim Diệu Nguyễn Thành Văn (2 ), Cao chiết trầu khơng (MIC=256-512 µg/ml) có tác động mạnh đến vi khuẩn Salmonella Theo Đỗ tất Lợi (2 6), trầu khơng có khả kháng khuẩn, ổi từ lâu đƣợc nhân dân ta sử dụng nhƣ loại thuốc điều trị bệnh tiêu chảy, điều tƣơng tự nhƣ kết thí nghiệm với Salmonella tác nhân gây tiêu chảy 43 Từ kết thu đƣợc thí nghiệm so sánh với kết hai tác giả cho thấy trầu khơng ổi có khả kháng Salmonella tốt, đƣa vào nghiên cứu tạo chế phẩm kháng Salmonella Một số hình ảnh so sánh phƣơng pháp thu dịch chiết: A B A Hình 3.12 Sự khác tính kháng Salmonella thu dịch chiết phƣơng pháp khác trầu không (A- chủ C , B- chủ C2) A B Hình 3.14 Sự khác tính kháng Salmonella thu dịch chiết phƣơng pháp khác ổi (Achủ C , B- chủ C2) Chú thích : a- Dịch ch ết thu ược bằ b- C ch ết; B Hình 3.13 Sự khác tính kháng khuẩn thu dịch chiết phƣơng pháp khác cỏ sữa (A- chủ C , B- chủ C2) A B Hình 3.15 Sự khác tính kháng Salmonella thu dịch chiết phƣơng pháp khác diếp cá (A- chủ C , B- chủ C2) cách u 30 hút c - Dịch ch ết từ tươ Trong phƣơng pháp thu dịch chiết đƣợc thử nghiệm phƣơng pháp sử dụng dịch cao chiết cho kết kháng Salmonella dƣợc liệu tốt Trong loại dƣợc liệu thử nghiệm Trầu khơng, ổi loại dƣợc liệu có khả kháng Salmonella tốt phƣơng pháp thu dịch chiết thử nghiệm 44 Dựa vào tính kháng Salmonella dƣợc liệu thí nghiệm chi làm nhóm: Nhóm kháng Salmonella tốt với đƣờng kính v ng kháng khuẩn ≥2 mm (trầu khơng ổi), Nhóm kháng Salmonella trung bình với đƣờng kính v ng kháng khuẩn ≥ 10mm (Diếp cá cỏ sữa) nhóm kháng k m khơng kháng với đƣờng kính vịng kháng khuẩn ≤ mm (lan kim tuyến, đông trùng hạ thảo, linh chi, mơ) A B Hình 3.16 So sánh nhóm kháng Salmonella tốt- Trung bình- Kém (A- chủ Chú thích : 1- hó C , B- chủ C2) tốt 2- Nhóm kháng trung bình 4- hó ké h ặc khô Từ kết cho thấy hồn tồn sử dụng dịch chiết từ trầu không ổi để điều trị bệnh Salmonella gây Khuyến nghị nên sử dụng dịch cao chiết để có đƣợc hiệu tốt 45 KẾT LUẬN Phân lập nhận định đƣợc hai chủng Salmonella từ phân gà bị tiêu chảy phân trắng kí hiệu chủng C1 chủng C2 Với phƣơng pháp thu dịch chiết dƣợc liệu trực tiếp từ tƣơi cho thấy có ba loại có khả kháng Salmonella Trầu không, ổi, cỏ sữa Với phƣơng pháp thu dịch chiết dƣợc liệu cách đun nóng có loại có hoạt tính kháng khuẩn Trầu không, ổi, cỏ sữa Với phƣơng pháp sử dụng cao chiết dƣợc liệu cho thấy loại dƣợc liệu có khả kháng Salmonella Trầu khơng, ổi, cỏ sữa, diếp cá, lan kim tuyến Qua kết thử nghiệm nhận thấy với phƣơng pháp khác cho kết tính kháng khuẩn dƣợc liệu khác sử dụng cao chiết cho kết kháng khuẩn tốt Trầu không ổi hai loại dƣợc liệu có khả kháng Salmonella tốt 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nƣớc: Bùi Thị Mai Anh (2005) Bƣớc đầu nghiên cứu thành phần hóa học ổi (Psidium guajaval), Kỷ yếu hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học, trƣờng đại học sƣ phạm Hà Nội Trần Quan Diên (2 2) h ê cứu tì h hì h Salmonellagallinarum pullorum gà chuẩ h ễ , ặc tí h ây bệ h củ hệ v chế uyê - Luận án tiến sỹ nông nghiệp, Trƣờng đại học Nơng nghiệp I, Hà Nội Định tính Salmonella thực phẩm theo NMKL : 999 Nguyễn Văn Minh Hồng - Tình hình lƣu hành tỷ lệ kháng kháng sinh Salmonella spp phân lập từ phân heo rừng, cầy hƣơng vịt tỉnh Đắk Lak Tạp chí phát triển KH&CN, tập 8, sốt 5-2015 Đỗ Tất Lợi (2006) Những thuốc Vị thuốc Việt Nam (NXB y học) Nguyễn Hữu Liêm (2 6) Tìm Hiểu Vi Khuẩn Salmonella-Khóa luận tốt nghiệp Võ Thị Thùy Linh (2011) Khảo sát hoạt tính kháng sinh dịch chiết tỏi, hẹ húng quế vi khuẩn Salmonella - Khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Nơng lâm TP Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Ngọc Lan (2 3) Nghiên cứu tách chiết xác định thành phần hóa học hợp chất ổi non Khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Đà nẵng Đoàn Thị Nguyện (2 9) Vi Sinh vật NXB Giáo dục 10 Nguyễn Bá Phƣớc (2014) Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitrocủa dịch chiết huyền diệp vi khuẩn E.coli, Salmonella Spp phân lập từ phân chó tiêu chảy thử nghiệm điều trị - Luận văn thạc sĩ, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 11 Trần Lê Đỗ Quyên (2011) Bước ầu Salmonella t thủy sả ô h ê cứu quy t ì h hát h ệ h Khóa luận tốt nghiệp, trƣờng đại học Kỹ thuật cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh 12 Đồn Thị Tuyến (2009) Bƣớc đầu nghiên cứu thành phần hóa học đơng trùng hạ thảo nghệ An Luận văn thạc sĩ Trƣờng Đại học Vinh 13 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 39-5:2 Phụ gia thực phẩm - Phƣơng pháp phân tích vi sinh vật - Phần 5: Phát Salmonella Tài liệu nƣớc ngoài: 14 Bradley S.G (1979) Cellular and molecular mechanisms of action of bacterial endotoxins Ann Rev Microbiol, 33, p 67-94 15 Bergey’s ( 994), Manual of determinative bacteriology, 9th Edition, by the Williams and wikings company 16 Clarke G.J, Wallis T.S, Staekey W.J, Collins J, Spencer A.J, Daddton G.J, Osborne M.P, Candy D.C and Stephen I (1988) Expression of an antigen in strains of Salmonella typhymurium with antibodies tocholeratoxin Med Microbiol, 25, p 139-146 17 Duke J A (1985) Handbook of medicinal herbs (CRC Press, Inc Boca Raton, Fla) 18 Finlay B.B and Falkow (1988) Virulence factors asociated with Salmonella species Microbiological Sciences Vol.5, No.11 19.Gao, Y.; Tang, W.; Dai, X.; Gao, H.; Chen, G.; Ye, J.; Chan, E.; Koh, H.L.; Li, X.; Zhou, S (2005) Effects of water-soluble Ganoderma lucidum polysaccharides on the immune functions of patients with advanced lung cancer J Med FoodTimo H J (2): 159-168 20 Ivan Dinev & CEVA Santé (2007) Diseases of poultry - A colour atlasFaculty of Veterinary Medicine Trakia University Stara Zagora 21 Kadota S., Basnet P., Ishii E., Tamura T., Namba T (1997) Antibacterial activity of trichorabdal from Rabdosia trichocarpa against Helicobacter pylori Zentbl Bakteriol 286:63-67mal, 2010 22 Marjorie Murphy Cowan (1999) , Plant Products as Antimicrobial Agents, department of microbiology, miami university, oxford, ohio 45056 23 Meyer J J M., Afolayan A J., Taylor M B., Erasmus D (1997) Antiviral activity of galangin from the aerial parts of Helichrysum aureonitens J Ethnopharmacol 56:165-169 24 Müller, C I ; Kumagai, T ; O’kelly, J ; Seeram, N P ; Heber, D ; Koeffler, H.P (2006) Ganoderma lucidum causes apoptosis in leukemiia, lymphoma and multiple myeloma cells Leukemiia Research 30 (7): 841-848 25 Martinez M J ,Betancourt J ,Alonso-Gonzalez N ,Jauregui A (1996) Screening some Cuban medicinal plants for antibacterial activity J Ethnopharmacol 52 : 171 - 174 26.Ooshima T., Minami T., Aono W., Izumitani A., Sobue S., Fujiwara T., Kawabata S., Hamada S (1993) Oolong tea polyphenols inhibit experimental dental caries in SPF rats infected with mutans streptococci Caries Res 27:124129 27 Peteron J.W (1980) Salmonella toxin Pharm Ather, VII, p.719-724 28 Rojas A., Hernandez L., Pereda-Miranda R., Mata R (1992) Screening for antimicrobial activity of crude drug extracts and pure natural products from Mexican medicinal plants J Ethnopharmacol 35:275–283 29 Selbitz H.J (1995) Grundsaetzliche sicherheisanfornderungen bein einsatz von lebendimpfstoffen bei lebensmittelliefernden Tieren Berl much Tieruzl Wschr,144,p.428-423- Selbitz H.J (1995) 30 Wan J ,Wilcock A ,Coventry M J (1998) Effect of basil oil on the development of Aeromonas hydrophila and Pseudomonas fluorescens J Appl Microbiol 84 : 152 - 158 ... ng vi khuẩn kháng kháng sinh, không gây ảnh hƣởng tới sức khỏe ngƣời vật nuôi Do đó, chúng tơi thực đề tài :? ?Nghiên cứu khả kháng Salmonella gây bệnh tiêu chảy gà số dịch chiết dược liệu? ??nhằm xác... khuẩn Salmonella phân gà bị tiêu chảy phân trắng - Xác định đƣợc khả kháng Salmonella số loại dịch chiết dƣợc liệu 2.2 Nội dung nghiên cứu - Phân lập chủng vi khuẩn Salmonella gây bệnh tiêu chảy gà. .. tính kháng Salmonella dịch chiết dƣợc liệu 36 3.2.1 Kết thử tính kháng Salmonella dịch chiết từ thảo dƣợc tƣơi 36 3.2.2 Tính kháng Salmonella Dịch chiết dƣợc liệu đun sôi 1000C 37 3.2.3 Khả kháng