Nghiên cứu điều kiện thu nhận chlorogenic acid CGA từ quả cà phê xanh bằng enzyme pectinase

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP o0o KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN THU NHẬN CHLOROGENIC ACID (CGA) TỪ QUẢ CÀ PHÊ XANH BẰNG ENZYME PECTINASE NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : TS Vũ Kim Dung Sinh viên thực : Hồng Mạnh Đạt Lớp : K61 – CNSH Khóa học : 2016 - 2020 Hà Nội, 2020 LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực đề tài khóa luận tốt nghiệp, nhận nhiều giúp đỡ, tạo điều kiện từ nhà trường thầy cô Bộ mơn Cơng nghệ Vi sinh - Hóa sinh, giảng viên, cán phòng ban chức Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam Tôi xin cảm ơn bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc giúp đỡ Tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè ln ln khích lệ, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho học tập, nghiên cứu khoa học hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Kim Dung - người trực tiếp hướng dẫn bảo tận tình cho tơi suốt q trình làm đề tài khóa luận tốt nghiệp Giúp cho tơi có thêm kiến thức chuyên môn, xây dựng tảng vững phục vụ cho việc học tập nghiên cứu Với cố gắng thực nghiên cứu cách nghiêm túc hạn chế kiến thức nên báo cáo chưa thể hoàn thiện Rất mong nhận đóng góp đưa ý kiến quý thầy giáo, cô giáo để báo cáo hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 07 tháng 07 năm 2020 Sinh viên thực Hoàng Mạnh Đạt MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan chlorogenic acid 1.1.1 Tổng quan giới thiệu chlorogenic acid 1.1.2 Công dụng chlorogenic acid 1.2.3 Thành phần hóa học cà phê 1.3 Tổng quan enzyme pectinase 1.3.1 Giới thiệu enzyme pectinase 1.3.2 Ứng dụng enzyme pectinase 1.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất chlorogenic acid từ cà phê giới Việt Nam 10 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 14 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Vật liệu nghiên cứu môi trường nuôi cấy 14 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 14 2.3.2 Hoá chất thiết bị 14 2.4 Phương pháp nghiên cứu 15 2.4.1 Phương pháp xác định yếu tố ảnh hưởng tới trình chiết xuất CGA 15 2.4.2 Phương pháp định tính CGA sắc ký mỏng (TLC) 19 2.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng CGA máy đo quang phổ 20 2.4.4 Xác định hàm lượng CGA phương pháp sắc ký lỏng HPLC 21 2.4.5 Phương pháp tối ưu hố q trình chiết xuất CGA 22 2.4.6 Phương pháp sấy chân không 23 2.4.7 Phương pháp thu thập xử lý số liệu 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Kết xác định yếu tố ảnh hưởng tới trình chiết xuất CGA 26 3.1.1 Kết ảnh hưởng tỉ lệ chất - dung môi 26 3.1.2 Kết ảnh hưởng nồng độ enzyme 28 3.1.3 Kết ảnh hưởng pH 30 3.1.4 Kết ảnh hưởng nhiệt độ 31 3.1.5 Kết ảnh hưởng tốc độ lắc 33 3.2 Kết mô hình hố tối ưu hố q trình chiết xuất CGA 36 3.2.1 Kết ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố 37 3.2.2 Phân tích phương sai 39 3.2.3 Phương trình hồi quy 40 3.2.3 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân cà phê xanh enzyme pectinase 41 3.2.4 Kết xác định hàm lượng CGA HPLC 43 3.3 Kết q trình sấy chân khơng 45 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 4.1 Kết luận 49 4.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Cs Cộng CGA Chlorogenic acid TLC Thin Layer Chromatography HPLC High Performance Liquid Chromatography DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Ảnh hưởng tỉ lệ chất - dung mơi đến q trình chiết CGA 16 Bảng 2.2 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến trình chiết xuất CGA 16 Bảng 2.3 Ảnh hưởng pH đến trình chiết xuất CGA 17 Bảng 2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình chiết xuất CGA 18 Bảng 2.5 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến trình chiết xuất CGA 18 Bảng 2.6 Ảnh hưởng thời gian đến trình chiết xuất CGA 19 Bảng 2.7 Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn CGA 20 Bảng 2.8 Thiết kế chế độ hệ thống HPLC cho xác định hàm lượng CGA 21 Bảng 2.9 Bố trí thí nghiệm xây dựng dường chuẩn CGA HPLC 22 Bảng 2.10 Các biến số khoảng chạy 22 Bảng 2.11 Ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố hàm lượng CGA thu điều kiện thuỷ phân khác 23 Bảng 2.12 Thí nghiệm xác định điều kiện sấy chân không 24 Bảng 3.1 Giá trị nồng độ CGA đo bước sóng 324 nm 25 Bảng 3.2 Ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố hàm lượng CGA thu điều kiện thuỷ phân khác 38 Bảng 3.3 Kết phân tích phương sai mơ hình tối ưu phần mềm Design Expert 10.0.3 (Bảng Anova) 39 Bảng 3.4 Kiểm tra mô hình thí nghiệm tối ưu hố tách chiết CGA 42 Bảng 3.5 Diện tích peak CGA nồng độ 43 Bảng 3.6 Kết xác định hàm lượng CGA HPLC 45 Bảng 3.7 Nhiệt độ thời gian sấy mẫu để thu nhận chế phẩm CGA 46 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Công thức cấu trúc chlorogenic acid [33] Hình 1.2 Một số sản phẩm thực phẩm chức chứa chlorogenic acid Hình 1.3 Cấu tạo cà phê [34] Hình 3.1 Quả cà phê xanh sau xử lý (A), sấy (B), nghiền rây (C) 25 Hình 3.2 Đồ thị đường chuẩn CGA 26 Hình 3.3 Đồ thị kết ảnh hưởng tỷ lệ chất – dung môi tới trình chiết xuất CGA 27 Hình 3.4 Kết sắc ký đồ CGA thí nghiệm ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu tới trình chiết xuất CGA 27 Hình 3.5 Đồ thị kết ảnh hưởng nồng độ enzyme tới trình chiết xuất CGA 28 Hình 3.6 Kết sắc ký đồ CGA thí nghiệm ảnh hưởng nồng độ enzyme tới trình chiết xuất CGA 29 Hình 3.7 Đồ thị kết ảnh hưởng pH dung mơi tới q trình chiết xuất CGA 30 Hình 3.8 Kết sắc ký đồ CGA thí nghiệm ảnh hưởng pH tới trình chiết xuất CGA 31 Hình 3.9 Đồ thị kết ảnh hưởng nhiệt độ tới chiết xuất CGA 32 Hình 3.10 Kết sắc ký đồ CGA thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ tới trình chiết xuất CGA 33 Hình 3.11 Đồ thị kết ảnh hưởng tốc độ lắc tới trình chiết CGA 34 Hình 3.12 Kết sắc ký đồ CGA thí nghiệm ảnh hưởng tốc độ lắc tới trình chiết xuất CGA 34 Hình 3.13 Đồ thị kết ảnh hưởng thời gian thuỷ phân tới trình chiết xuất CGA 35 Hình 3.14 Kết sắc ký đồ CGA thí nghiệm ảnh hưởng thời gian thuỷ phân tới trình chiết xuất CGA 36 Hình 3.15 Hàm kỳ vọng điều kiện tối ưu thuỷ phân cà phê xanh thu CGA 41 Hình 3.16 Bề mặt đáp ứng hàm lượng CGA 41 Hình 3.17 Sắc ký đồ kết trước sau tối ưu hoá 42 Hình 3.18 Đồ thị đường chuẩn CGA 43 Hình 3.19 Sắc ký đồ chất chuẩn CGA 44 Hình 3.20 Sắc ký đồ mẫu thử CGA 44 Hình 3.21 Chế phẩm CGA dạng bột 46 Hình 3.22 Quy trình thu nhận CGA từ cà phê xanh 47 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, nhu cầu sống ngày cao, loại sản phẩm chức đời với mục đích hỗ trợ, cải thiện, nâng cao sức khỏe người vấn đề xã hội đặc biệt quan tâm Nhiều nghiên cứu việc sử dụng bột chiết cà phê xanh có nhiều tác dụng sức khỏe người như: hạ huyết áp, ức chế tích tụ chất béo, hạn chế tăng trọng lượng thể điều chỉnh hàm lượng đường máu [7] Các tác dụng tích cực bột chiết cà phê xanh có mặt chlorogenic acid Chất có tác dụng kháng oxi hóa, kháng viêm, kháng ung thư, chống béo phì, hạ huyết áp chống co giật [8] Đặc biệt nữa, nghiên cứu cho thấy tác dụng có lợi chlorogenic acid hội chứng chuyển hóa (Metabolic syndrome) Hội chứng định nghĩa bao gồm loạt yếu tố sinh lý, hóa sinh, lâm sàng chuyển hóa làm tăng nguy mắc bệnh tim mạch tiểu đường type Các biểu hội chứng bao gồm: rối loạn chuyển hóa lipid máu (tăng cholesterol tổng số máu, tăng hàm lượng LDL - cholesterol, triglycerid, giảm hàm lượng HDL - cholesterol), huyết áp cao, đường máu cao, dễ viêm, gan nhiễm mỡ ngưng thở ngủ Hội chứng coi hội chứng mang tính tồn cầu chi phí chữa trị cao số người mắc ngày tăng niên trẻ em [8] Cà phê xanh nguồn chlorogenic acid quan trọng thực phẩm người với tổng lượng chlorogenic acid lên đến 41 – 113 mg/g chất khô tùy thuộc giống Việc thu nhận CGA từ cà phê xanh làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức phòng hỗ trợ điều trị bệnh mãn tính đặc biệt hội chứng chuyển hóa giúp đa dạng hóa sản phẩm từ cà phê tăng giá trị kinh tế cà phê Pectinase enzyme dùng không giới hạn thực phẩm khơng ảnh hưởng đến sức khỏe người Ở phản ứng thuỷ phân loại chế biến nước ép , nhờ tác dụng pectinase mà trình ép, làm lọc dịch dễ dàng, làm tăng hiệu suất sản phẩm Ngồi ra, pectinase ảnh hưởng tới đặc tính sinh – hố sản phẩm chiết xuất, từ lựa chọn nhiều sản xuất thực phẩm Bằng ưu điểm dễ nuôi cấy, sinh trưởng phát triển nhanh, cho nhiều enzyme thời gian ngắn, vi sinh vật lựa chọn hàng đầu nhà sản suất công nghiệp với mong muốn giảm giá thành, tăng suất sản xuất lên cao Sự sản xuất pectinase quy mô công nghiệp thực chủ yếu từ Aspergillus niger [9] Với nhiều kết khả quan tác dụng dược lý tiềm ứng dụng công nghiệp thực phẩm acid chlorogenic từ cà phê xanh, việc tách chiết chlorogenic acid từ nguyên liệu cung cấp chế phẩm hoạt chất tự nhiên quý, làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức dùng phòng hỗ trợ điều trị bệnh mãn tính tăng huyết áp, tiểu đường đặc biệt hội chứng chuyển hóa, bệnh lý tăng nhanh Từ lí trên, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu điều kiện thu nhận chlorogenic acid (CGA) từ cà phê xanh enzyme pectinase” 3.2.4 Kết xác định hàm lượng CGA HPLC  Kết xây dựng đường chuẩn CGA Thực thiết bị HPLC Agilent 1260 trì nhiệt độ 20oC detector UV-VIS, bước sóng phát 325 nm, kết biểu diễn bảng 3.5 sau: Bảng 3.5 Diện tích peak CGA nồng độ Nồng độ CGA (µg/ml) 10 20 50 100 200 Diện tích peak 1367,5 1387,5 1565,5 1726,6 2248,9 2500 y = 4.6287x + 1307.4 R² = 0.9938 Diện tích pic 2000 1500 1000 500 0 50 100 150 200 250 Nồng độ CGA µg/ml Hình 3.18 Đồ thị đường chuẩn CGA Đường chuẩn CGA xác định là: Y = 4,6287x + 1307,4 R2 = 0,9938  Kết xác định hàm lượng CGA dịch thủy phân phương pháp HPLC 43 Hình 3.19 Sắc ký đồ chất chuẩn CGA Hình 3.20 Sắc ký đồ mẫu thử CGA Kết sắc ký đồ hình 3.20 cho thấy chất chuẩn sử dụng 5-CGA phân tích 29 phút, CGA xuất phút thứ 3, thời gian lưu khoảng phút So sánh với kết mẫu thử hình 3.21, nhận thấy có trùng khớp phút thứ có đường sắc ký lên lưu lại đến qua phút thứ Điều rằng, mẫu thử tồn phân tử có cấu tạo giống với mẫu chuẩn 44 Bảng 3.6 Kết xác định hàm lượng CGA HPLC TN Hàm lượng CGA (mg/g) Máy đo quang phổ (324nm) Hệ thống HPLC 37,44 35,07 63,81 61,40 58,25 56,19 61,83 59,03 Chú thích: TN1- Dịch thủy phân từ thí nghiệm thứ ma trận thực nghiệm Box-Behnken; TN2- Dịch thủy phân từ thí nghiệm thứ 13 ma trận thực nghiệm Box- Behnken; TN3- Dịch thủy phân trước tối ưu; TN4- Dịch thủy phân sau tối ưu Kết bảng 3.6 cho thấy hàm lượng CGA dịch thủy phân xác định phương pháp HPLC cho kết thấp phương pháp đo máy quang phổ Điều tương tự với kết Belay Cs nghiên cứu cho thấy lượng CGA thu đo máy quang phổ (6,05 - 6,25%) cao so với phương pháp đo HPLC (5,6 – 6,1%) [32] 3.3 Kết q trình sấy chân khơng Sấy chân không phương pháp sấy môi trường áp suất cực thấp, gần chân không Trong môi trường này, nước sôi nhiệt độ thấp nhiều so với nhiệt độ sôi thông thường Khi nước sôi, phân tử nước hoạt động mạnh đồng nghĩa với bốc diễn nhanh làm tăng tốc độ sấy lên nhiều lần so với sấy khơ thơng thường Sấy chân khơng có nhiều ưu điểm giữ nguyên màu sắc, hương vị, chất dinh dưỡng tính chất đặc trưng sản phẩm, khơng làm biến đổi tính chất vật lý, hóa học vật sấy, sản phẩm sấy chân khơng có độ ẩm thấp (khoảng - 3%) nên bảo quản lâu Vì sản phẩm chế phẩm CGA hướng tới cho mục đích phục vụ sức khỏe nên sấy chân không phương pháp lựa chọn thích hợp Nhiệt độ sấy quan 45 trọng, thí nghiệm chúng tơi khảo sát điều kiện nhiệt độ sấy dịch chiết cô đặc để thu sản phẩm chứa CGA có hàm lượng cao Thí nghiệm xác định điều kiện sấy chân khơng thu nhận chế phẩm CGA cho kết biểu diễn bảng 3.7 Bảng 3.7 Nhiệt độ thời gian sấy mẫu để thu nhận chế phẩm CGA Chế độ Nhiệt độ Thời gian Độ ẩm sấy (oC) (giờ) (%) thu (g) (mg/g) 50 13 6,9 9,15 43,51 60 10 6,52 9,34 43,21 70 4,19 9,61 46,01 Chân không Khối lượng mẫu Hàm lượng CGA Ở chế độ sấy chân không, nhiệt độ 50 60oC độ ẩm sản phẩm thu đạt 6,5%, hàm lượng chế phẩm chứa CGA đạt 43,51 mg/g 43,21 mg/g, thời gian sấy từ 10 - 13 Ở 70oC, sau sản phẩm đạt độ ẩm theo yêu cầu (4,41 – 5%), khối lượng mẫu thu 9,61g hàm lượng CGA vượt hẳn so với sấy nhiệt độ thấp (46,01 mg/g) Vì chúng tơi chọn nhiệt độ sấy 70oC để sấy làm giàu sản phẩm CGA Trong điều kiện sấy chân khơng, chế phẩm thu hồi có độ xốp mịn, màu xanh vàng sáng đẹp, dễ dàng thu hồi chế phẩm Hình 3.21 Chế phẩm CGA dạng bột 46  Sơ đồ thu nhận CGA từ cà phê xanh Sau tiến hành nghiên cứu điều kiện thủy phân cà phê xanh, đưa quy trình cơng nghệ thu nhận chế phẩm CGA pectinase hình 3.22 sau Quả cà phê xanh Xử lý (Sấy khô, nghiền d < 2mm) Thuỷ phân (Tỷ lệ R/L – 60 g/ml, pH 5,5; nồng độ enzyme 44 o U/g, 50 C, 80 vịng/phút, 55 phút) Lọc Cơ đặc o (Cơ chân khơng 20 lần, 50 C) Sấy chân không o (70 C, giờ) Chế phẩm CGA Hình 3.22 Quy trình thu nhận CGA từ cà phê xanh 47 Quy trình cụ thể sau: Bước 1: Xử lý nguyên liệu Quả cà phê sau thu hái loại bỏ tạp chất, rửa với nước đem sấy nhiệt độ 50oC tới độ ẩm 15% Nghiền nhỏ cà phê thành bột mịn bảo quản lạnh (nhiệt độ 4oC) Bước 2: Chiết CGA từ cà phê xanh pectinase Bột cà phê hòa vào dung dịch đệm phosphate pH 5,5 có bổ sung 44U/g pectinase Đem ủ hỗn hợp tủ lắc nhiệt độ 50oC với tốc độ lắc 80 vòng/phút Sau 55 phút, dừng phản ứng cách gia nhiệt hỗn hợp lên 100oC phút Bước 3: Thu nhận dịch cô đặc Hỗn hợp dịch sau thủy phân lọc bỏ bã, thu dịch CGA thô tiến hành cô đặc 20 lần phương pháp cô quay chân không 50C Bước 4: Sấy thu chế phẩm CGA dạng bột Đóng gói bảo quản 48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận  Đã xác định yếu tố ảnh hưởng tới trình thu nhận CGA từ cà phê xanh, hàm lượng CGA thu là: 58,250 mg/g - Tỷ lệ chất – dung môi: – 50 g/ml - pH dung dịch đệm: 5,5 - Nồng độ enzyme: 40 U/g - Nhiệt độ: 50oC - Tốc độ lắc: 80 vòng/phút - Thời gian: 60 phút  Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất CGA cà phê xanh: tỷ lệ chất – dung môi: – 60 g/ml, nồng độ enzyme 44 U/g thời gian 54,4 phút, hàm lượng CGA thu 62,3077 mg/g  Điều kiện sấy chân khơng thích hợp là: nhiệt độ 70oC, cho sản phẩm đạt độ ẩm 4,41 – 5%, khối lượng mẫu thu 9,61g hàm lượng CGA đạt 46,01 mg/g 4.2 Kiến nghị Do hạn chế thời gian nghiên cứu nên thí nghiệm xác định thành phần dịch chiết chưa triển khai đề tài Vì tơi đưa kiến nghị sau: Nghiên cứu phương pháp tinh thu nhận CGA cà phê xanh Xác định hoạt tính sinh hoá CGA cà phê xanh Nghiên cứu ảnh hưởng dung môi khác trình tách chiết CGA 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Hồng Phú, Nguyễn Đức Lượng, Đỗ Đại Nghĩa (2008) Nghiên cứu chế tạo chế phẩm Biocoffee-1 từ Aspergilus niger ứng dụng lên men loại cà phê Tạp chí phát triển KH&CN, tập 11, số 12 Nguyễn Việt Phương Vũ Kim Dung (2017) Tuyển chọn Aspergillus Niger sinh tổng hợp Pectinase cao để tách chiết axit chlorogenic từ hạt cà phê xanh Vietnam Biological Industries Vũ Kim Dung (2015) Nghiên cứu thu nhận pectic oligosaccharide từ pectin vỏ chanh leo endopolygalacturonase Luận án tiến sĩ Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Lê Tự Hải, Nguyễn Thị Lan Anh, Lưu Vũ Diễm Hằng (2011) Nghiên cứu chiết tách xác định thành phần hóa học hợp chất Polyphenol nhóm Tanin từ vỏ keo tràm Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Đại học Đà Nẵng, 44(3): 142-149 Đỗ Biên Cương, Nguyễn Thị Hoa, Lê Thị Huyền, Đặng Thị Thu (2010) Nghiên cứu chuyển hóa bã cơm dừa tạo prebiotic Mannooligosacharit Endo-β-1,4-mannanase từ Aspergillus niger BK01 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 46(3): 43-49 Nguyễn Hồng Ly (2014), Nghiên cứu chuyển hóa pectin tạo Pectic oligosaccharide (POS) Endo-polygalacturonase khảo sát số hoạt tính sinh học Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Tài liệu tiếng Anh Farah, A., de Paulis, T., Trugo, L C., Martin, P R (2005) Effect of roasting on the formation of chlorogenic acid lactones in coffee Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(5) 215-236 Santana-Gálvez, J., Cisneros-Zevallos, L., Jacobo-Velázquez, D A (2017) Chlorogenic acid: Recent Advances on Its Dual Role as a Food Additive and a Nutraceutical against Metabolic Syndrome Molecules, 22, 358-379 Yogesh Khairnar , Vamsi Krishna K , Amol Boraste , Nikhil Gupta , Soham Trivedi Cs (2009) Study of pectinase production in submerged fermentation using different strains of Aspergillus Niger International Journal of Microbiology Research, 1: 13-17 10.Boerjan, Wout; Ralph, John; Baucher, Marie (2003) "Lignin biosynthesis" Annual Review of Plant Biology 54: 519–546 11 Barnes, H M.; Feldman, J R.; White, W V (1950) "Isochlorogenic acid Isolation from Coffee and Structure Studies" J Am Chem Soc 12 Corse, J.; Lundin, R E.; Waiss, A C (May 1965) "Identification of several components of isochlorogenic acid" Phytochemistry (3): 527– 529 13 Vogt, T (2010) "Phenylpropanoid Biosynthesis" Molecular Plant (1): 2–20 14 Kweon, Mee-Hyang; Hwang, Han-Joon; Sung, Ha-Chin (2001) "Identification and Antioxidant Activity of Novel Chlorogenic acid Derivatives from Bamboo (Phyllostachys edulis)" Journal of Agricultural and Food Chemistry 39 (8): 162–172 15 Jalal, Mahbubul A F.; Read, David J.; Haslam, E (1982) "Phenolic composition and its seasonal variation in Calluna vulgaris" Phytochemistry 21 (6): 1397–1401 16 Clifford, M N (2003) "14 The analysis and characterization of chlorogenic acids and other cinnamates" In Santos-Buelga, C.; Williamson, G (eds.) Methods in Polyphenol Analysis Cambridge: Royal Society of Chemistry pp 314–337 17 Zhen, Jing; Villani, Thomas S.; Guo, Yue; Qi, Yadong; Chin, Kit; Pan, Min-Hsiung; Ho, Chi-Tang; Simon, James E.; Wu, Qingli (2016) "Phytochemistry, antioxidant capacity, total phenolic content and anti- inflammatory activity of Hibiscus sabdariffa leaves" Food Chemistry 190: 673–680 18 Carlos Tello, PhD (2020) “6 Health Benefits of Chlorogenic acid + Side Effects” Molecular Biology 20-26 19 Muhammad Naveed, Veghar Hejazi et al (2018) “Chlorogenic acid (CGA): A pharmacological review and call for further research” Biomedicine & Pharmacotherapy 97: 67-74 20 C.Campa et al (2005) “Diversity in bean Caffeine content among wild Coffea species: Evidence of a discontinuous distribution” Food Chemistry 91: 633-637 21 Rohit Upadhyay, L Jagan Mohan Rao (2013) “Critical Reviews in Food Science and Nutrition” Medicine, Chemistry 22 Santana Cs (2006) “Selectivity in the extraction of 2- quinolone alkaloids with supercritical CO2” Brazilian Journal of Chemical Engineering 23 (4) 23 Siti Machmudah, Kiwa Kitada, Mitsuru Sasaki (2008) “Caffeine and chlorogenic acid separation from raw coffee beans using supercritical CO2 in water” 24 Carmen M Topală, Lavinia D Tătaru, Targu d.Vale (2015) “Infrared Spectra of Green Arabica Coffee Extraction using Supercritical Carbon Dioxide and Soxhlet Technique” Chemistry 1128-1131 25 Coffee Edited by R J Clarke and R Macrae Volume Chemistry (1985), pp 306 Volume Technology (1987), pp 321 26 Yang sun (2017) Ionic liquid-based enzyme-assisted extraction of chlorogenic acid from Flos Lonicera Japonicae 27 D.R Kashyap, P.K Vohra, S Chopa, R Tewari “Applications of pectinases in the commercial sector: a review” Bioresource Technology 77 (2001) 215-227 28 Agnan Marie Michel Combo, Mario Aguedo “Enzymatic production of pectic oligosaccharides from polygalacturonic acid with commercial pectinase preparations” Food and Bioproducts Processing 90 (2012) 588596 29 Rosana Chirinos, Herve Rogez, David Campos, Romia Pedreschi, Yvan Larondelle (2007) Optimization of extraction conditions of antioxidant phenolic compounds from mashua (Tropaeolum tuberosum Rz & Pavón) tubers Separation and Purification Technology, 55(2):217-225 30 Elias Kiassos, Stefania Mylonaki, Dimitris P Makris, Panagiotis Kefalas (2009) Implementation of response surface methodology to optimise extraction of onion (Allium cepa) solid waste phenolics Innovative Food Science & Emerging Technologies, 10(2): 246-252 31 Abebe Belay and A V Gholap, “Characterization and determination of chlorogenic acids (CGA) in coffee beans by UV-VỈS spectroscopy”, African Journal of Pure and Applied Chemistry Vol 3(11), pp 234-240, November, 2009 32 S.L.C Ferreira, E.G.P da Silva, H.S Ferreira, R.E Bruns et al (2007) Box-Behnken design: An alternative for the optimization of analytical methods Analytica Chimica Acta, 597(2): 179-186 Tài liệu trang web 33 https://coffeenews.vn/axit-chlorogenic-cga-co-trong-ca-phe/ 34.https://primecoffea.com/cau-tao-hat-cafe-va-thanh-phan-hoa-hoc-tronghat-ca-phe.html 35.https://www.foodnk.com/pectin-va-cac-ung-dung.html PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng kết ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu chất - dung mơi đến q trình chiết xuất CGA TT Tỉ lệ chất - dung môi Hàm lượng CGA (g/ml) (mg/g) 1 - 10 23,22 ± 0,4 - 20 27,10 ± 0,6 - 30 27,75 ± 0,4 - 40 31,05 ± 1,0 - 50 34,38 ± 1,0 - 60 33,46 ± 0,5 - 70 31,37 ± 0,5 - 80 28,57 ± 0,5 Bảng kết ảnh hưởng nồng độ enzyme đến trình chiết CGA Nồng độ enzyme Hàm lượng CGA (U/g) (mg/g) 33,678 ± 0,5 10 33,685 ± 0,9 20 35,674 ± 0,7 30 40,803 ± 1,4 40 44,642 ± 1,1 50 37,593 ± 1,0 60 35,186 ± 1,0 TT Bảng kết ảnh hưởng pH đến trình chiết xuất CGA TT pH Hàm lượng CGA (mg/g) 5,0 44,153 ± 1,1 5,5 51,690 ± 0.7 6,0 48,864 ± 0,9 6,5 46,630 ± 0,8 7,0 45,270 ± 0,7 7,5 40,664 ± 0,7 Bảng kết ảnh hưởng nhiệt độ đến trình chiết xuất CGA TT Nhiệt độ (oC) Hàm lượng CGA (mg/g) 20 32,492 ± 0,4 30 49,910 ± 0,6 40 51,236 ± 0,5 50 53,818 ± 0,5 60 46,840 ± 0,7 Bảng kết ảnh hưởng tốc độ lắc đến trình chiết xuất CGA TT Tốc độ lắc (vòng/phút) Hàm lượng CGA (mg/g) 46,526 ± 1,0 40 53,190 ± 0,9 80 58,250 ± 1,0 120 51,376 ± 0,7 160 43,839 ± 0,7 Bảng kết ảnh hưởng thời gian thuỷ phân đến trình chiết CGA TT Thời gian (phút) Hàm lượng CGA (mg/g) 32,440 ± 0,6 30 42,932 ± 0,9 60 58,180 ± 0,9 90 52,946 ± 0,7 120 49,561 ± 0,7 ... tiêu nghiên cứu Xác định điều kiện tối ưu để thu nhận CGA cà phê xanh 2.2 Nội dung nghiên cứu - Xác định điều kiện thích hợp thu nhận CGA cà phê xanh: + Tỷ lệ chất - dung môi + pH dung dịch đệm thu? ??... nhanh Từ lí trên, chúng tơi tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu điều kiện thu nhận chlorogenic acid (CGA) từ cà phê xanh enzyme pectinase? ?? CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan chlorogenic. .. hình nghiên cứu, sản xuất chlorogenic acid từ cà phê giới Việt Nam  Trên giới có nhiều nhà khoa học nghiên cứu CGA cà phê thấy hàm lượng CGA cà phê phụ thu? ??c vào nhiều yếu tố, hàm lượng CGA thay