Khảo sát khả năng đối kháng nấm phytophthora của vi khuẩn bacillus phân lập từ đất vườn

ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH BÌNH DƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NĂM HỌC 2015-2016 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM PHYTOPHTHORA CỦA VI KHUẨN BACILLUS PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN TÊN SINH VIÊN: NGUYỄN THỊ HỒNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN: THS NGUYỄN ANH DŨNG Bình Dương, tháng năm 2016 UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Độc lập – Tự – Hạnh phúc THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung - Tên đề tài: : Khảo sát khả đối kháng nấm Phytophthora vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất vườn - Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hồng Đỗ Thị Cẩm Tuyên - Lớp: C14SH02 - Khoa: Tài nguyên Môi trường - Chuyên ngành đào tạo: Sư phạm Sinh học - Năm thứ: - Số năm đào tạo: - Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Anh Dũng Mục tiêu đề tài Tìm chủng vi khuẩn Bacillus có khả đối kháng mạnh với nấm Phytophthora Tính sáng tạo Sử dụng chất kháng sinh từ vi khuẩn Bacillus không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe người, vật nuôi, trồng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học, có khả kháng lại nấm Phytophthora trồng Kết nghiên cứu Qua trình phân lập từ đất vườn, làm thu 11 chủng Bacillus chọn chủng nấm Với thí nghiệm khảo sát khả đối kháng nấm Phytophthora vi khuẩn Bacillus Chúng tiến hành khảo sát chủng Bacillus với chủng nấm chọn, có chủng đối kháng mạnh - B1 ∆D = 9,75mm - B3 ∆D = 10,75mm - B5 ∆D = 11,75mm Đóng góp mặt kinh tế - xã hội, giáo dục đào tạo, an ninh, quốc phòng khả áp dụng đề tài Tìm chủng vi khuẩn có khả kháng nấm phytophthora , làm nguồn nguyên liệu sản xuất chế phẩm sinh học kháng lại nấm bệnh, góp phần hạn chế nhiễm mơi trường Cơng bố khoa học sinh viên từ kết nghiên cứu đề tài (ghi rõ họ tên tác giả, nhan đề yếu tố xuất có) nhận xét, đánh giá sở áp dụng kết nghiên cứu (nếu có) Ngày tháng năm 2016 Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài (ký, họ tên) Nguyễn Thị Hồng Nhận xét người hướng dẫn đóng góp khoa học sinh viên thực đề tài Nhóm nghiên cứu thực hiên đề tài tinh thần trách nhiệm cao, có nổ lực, nhiệt tình tìm tòi học hỏi, chủ động thường xuyên liên lạc trao đổi với GVHD để thực đề tài tiến độ Kết đề tài chủ yếu dựa vào vùng đất lấy nên chưa đưa chủng vi khuẩn có tinh kháng nấm cao Tuy nhiên, cách để sinh viên tiếp cận với thực tế phù hợp với trình độ sinh viên Ngày Xác nhận lãnh đạo khoa (Ký,họ tên) tháng năm 2015 Người hướng dẫn (Ký,họ tên) UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Độc lập – Tự – Hạnh phúc THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH Ngày tháng năm 2016 THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN - (ký, họ tên) Họ tên: Nguyễn Thị Hồng - Ngày, tháng, năm sinh: 18/05/1995 - Nơi sinh: Bình Thuận - Lớp: C14SH02 - Chuyên ngành đào tạo: Sư phạm Sinh học - Khóa học: 2014 – 2017 - Khoa: Tài nguyên Môi trường - Địa liên hệ: phường Phú Hịa, Thành phố Thủ Dầu Một, Tỉnh Bình Nguyễn Thị Hồng Dương - Điện thoại: 0962746576 - Email: kennyhong1801@gmail.com QUÁ TRÌNH HỌC TẬP  Năm thứ - Ngành học: Sư phạm Sinh học - Khoa: Khoa học Tự nhiên - Kết xếp loại học tập: Trung bình Ngày tháng năm 2016 Xác nhận lãnh đạo Khoa (ký, họ tên) THUYẾT MINH ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN Năm học 2015 - 2016 Tên đề tài: Khảo sát khả đối kháng nấm Phytophthora vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất vườn Mã số: (do cán quản lý ghi) Loại hình nghiên cứu:  Cơ  Ứng dụng Lĩnh vực nghiên cứu:  Khoa học Xã hội Nhân văn  Triển khai  Khoa học Kỹ thuật Công nghệ  Kinh tế  Khoa học Tự nhiên  Khoa học Giáo dục Thời gian thực hiện: tháng Từ tháng năm 2015 đến tháng năm 2016 Đơn vị quản lý chuyên môn: Khoa: Tài Nguyên Môi Trường Bộ môn: Sinh học Ứng Dụng Giáo viên hướng dẫn: Họ tên: Nguyễn Anh Dũng Học vị: Thạc sĩ Đơn vị cơng tác (Khoa, Phịng): Khoa Tài Ngun Môi Trường Địa nhà riêng: Điện thoại nhà riêng: Di động: 090 786 03 88 E-mail: Nhóm sinh viên thực đề tài: Sinh viên chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Thị Hồng kennyhong1801@gmail.com SĐT: 0962 746 576 Email: MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn Bacillus 1.1.1 Đặc điểm sinh học vi khuẩn Bacillus .3 1.1.2 Khả đối kháng vi khuẩn Bacillus 1.2 Nấm Phytophthora 1.2.1 1.3 Vị trí phân loại .6 Tình hình bệnh hại trồng 1.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Bacillus công tác bảo vệ trồng 12 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .15 2.1 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 15 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 15 2.1.2 Hóa chất thiết bị 15 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 15 2.1.4 Môi trường nghiên cứu 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu: 17 2.2.1 Lấy mẫu 17 2.2.2 Phương pháp phân lập 18 2.2.3 Phương pháp khảo sát khả đối kháng vi khuẩn Bacillus với nấm Phytophthora 19 2.2.4 Phương pháp xử lý số liê ̣u .19 2.2.5 Phương pháp nhuộm Gram 19 2.2.6 Thử nghiệm Catalase .21 2.2.7.Phương pháp giữ giống cấy chuyền 21 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus 22 3.2 Phân lập nấm .24 3.3 Khảo sát khả đối kháng nấm vi khuẩn Bacillus .25 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28 4.1 Kết luận 28 4.2 Kiến nghị 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO .29 PHỤ LỤC 32 2.2.6 Thử nghiệm Catalase[21] - Nguyên tắc: Catalase enzyme có khả phân hủy hydrogen peroxide(H 2O2) thành nước (H2O) oxygen (O) 2H2O2 + catalase → 2H2O + O2 - Cách tiến hành:  Lấy khuẩn lạc 18-24h  tuổi đặt lên lam kính Nhỏ giọt H 2O2 3% phủ lên vi khuẩn quan sát tạo thành bọt khí  Kết quả: Bọt khí sủi mạnh nhanh catalase (+) Một số vi khuẩn khơng có catalase có khả phân hủy H 2O2 tạo thành bọt khí nhỏ chậm 30 giây, khơng phải catalase (+) 2.2.7.Phương pháp giữ giống cấy chuyền[21] Các chủng vi khuẩn phân lập nhiều lần cấy môi trường thạch nghiêng ống nghiệm môi trường giữ giống Cách tiến hành: Đổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm (MT2), để nghiêng ống nghiệm để chờ thạch đông Tiếp theo dùng que cấy vô trùng cấy zich zắc bề mặt thạch nghiêng Nút ống nghiệm lại để tủ ấm 370C, sau 24h thấy xuất khuẩn lạc chuyển ống nghiệm vào tủ lanh 40C giữ giống 22 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus Từ mẩu đất vườn thu thập vùng Dầu Tiếng, Phú Lợi tỉnh Bình Dương phân lập theo phương pháp mục 2.2.2 chúng tơi phân lập tiến hành khảo sát chủng 11 chủng phân lập với đặc điểm trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Một số đặc điểm vi khuẩn Chủng Khuẩn lạc Tế bào Màu vàng đục, mép Tế bào Gram hình que, + B1 khơng liền, bề mặt đứng riêng rẽ nhăn nheo xếp thành chuỗi Màu vàng đục, bề Tế bào hình que, + B2 khơng liền, có xếp thành chuỗi, mép khơng liền, có nhăn nheo, + mép nằm riêng lẽ hay xếp không liền, khuẩn thành chuỗi lạc khô Khuẩn lạc khô, bề Tế B6 + bề mặt nhăn nheo, nằm riêng lẽ đường rãnh Màu trắng, bề mặt Tế bào hình bầu dục, + B5 + mặt nhăn nheo, khơ, đứng riêng lẽ mép không liền, thành chuỗi Màu vàng đục, khơ, Tế bào hình que, dài, + B4 + mặt nhăn nheo, mép đứng riêng lẽ đường rãnh Màu vàng đục, bề Tế bào hinh bầu dục, + B3 Catalase + mặt nhăn, khơng liền, bào hình que, + mép đứng riêng lẽ màu thành chuỗi vàng đục 23 + Khuẩn lạc khô, mép Tế B7 bào hình que, + khơng liền, có đứng riêng lẽ nếp nhăn, thanhn chuỗi Khuẩn lạc khô, màu Tế bào hinh que, + B8 + + xám nhạt, có mép đứng riêng lẽ nhăn, mép lồi lõm thành chuỗi Qua kết nghiên cứu kết hợp với khóa phân loại Lương Đức Phẩm (2011) chúng tơi kết luận chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus 3.2 Phân lập nấm 24 Thu mẫu vỏ cao su bị loét miê ̣ng cạo và tiến hành phân lâ ̣p nấm Phytophthora theo phương pháp ở mục 2.2.2 Kết quả đã phân lâ ̣p được mô ̣t chủng nấm với đă ̣c điểm sau: - Khuẩn lạc nấm màu trắng, không hình thành bào tử trần - Khi quan sát dưới kính hiển vi thì thấy sợi nấm không có vách ngăn, có những túi hình quả chanh có núm So sánh với mô tả của Nguyễn Văn Bá và Cs (2005) chúng kết luâ ̣n là A Hình 3.1 chủng nấm th ̣c chi Phytophthora Cũng Phytopthora theo Nguyễn Văn Bá và Cs (2005) thì A Hùng (Túi tinh) tiếp hợp với những túi hình chanh có núm chính là túi những túi đô ̣ng bào tử bên có chứa B Túi động bào tử hình chanh có đô ̣ng bào tử Khi những túi này vỡ sẽ núm B Ảnh vi thể của nấm giải phóng đô ̣ng bào tử và phát tán theo dòng nước Bên cạnh đó quan sát vi thể kĩ thì chủng Phytophthora này là chủng đồng tản có nghĩa là có hùng (túi tinh) và noãn sào (trứng) nằm cùng tản Hùng sau thụ tinh với noãn sào sẽ phát triển thành túi đô ̣ng bào tử 25 3.3 Khảo sát khả đối kháng nấm vi khuẩn Bacillus Từ chủng vi khuẩn phân lập mục 3.1 chủng nấm Chúng tiến hành đối kháng môi trường PGA, thu kết sau: Bảng 3.2 Khảo sát khả đối kháng chủng Bacillus NT ∆D B1 ∆D B2 ∆D B3 ∆D B4 ∆D B5 ∆D B6 ∆D B7 ∆D B8 10 10 13 10 10 10 13 10 10 12 10 11 10 10 13 10 10 TB 9,75 8,25 10,75 7,5 11,75 8,5 8,75 9,5 NT: Nghiệm thức ∆D(mm): khoảng cách vô khuẩn TB: Trung bình Từ chủng chúng tơi chọn chủng có khả đối kháng mạnh 26 Hình 3.3 Khả đối kháng chủng B5 nấm Phytophthora Hình 3.5 Phytophthora ( đối chứng) 27 Với chủng Bacillus phân lập hầu hết chủng có khả đối kháng với nấm Phytophthora Trong có chủng Bacillus có khả đối kháng mạnh với nấm Phytophthora tạo khoảng cách vơ khuẩn cao Ba chủng B1,B3,B5 Chủng Bacillus B1 khoảng cách vô khuẩn tạo 9,75mm, chủng Bacillus B3 khoảng cách vô khuẩn tạo 10,75mm, chủng Bacillus B5 khoảng cách vô khuẩn tạo 11,75mm Khi so sánh kết với nghiên cứu Wan Gyu Kim cộng (2007), nhóm tác giả tuyển chọn chủng Bacillus M34 M47 có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm Phytophthora capsici, khoảng cách vô khuẩn mà chủng M34 M47 tạo với nấm bệnh 14,8mm 14,9mm Đoàn Lê Minh Hiền (2013) tác giả tuyển chọn chủng Bacillus B14 B34 có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm Phytophthora palmiora với khoảng cách vô khuẩn tạo lần lược 10,6mm 11,7mm Khoảng cách vô khuẩn mà chủng Bacillus B1,B2 B5 tạo với nấm Phytophthora nhỏ khoảng cách vô khuẩn mà chủng Bacillus M34 M47 tạo với nấm Phytophthora capsici nghiêm cứu Wan Gyu Kim cộng (2007) Tuy nhiên, chủng Bacillus B1,B3,B5 mà chúng em tìm có khoảng cách vơ khuẩn gần với chủng Bacillus B14 B34 nghiên cứu Đoàn Lê Minh Hiền (2013) 28 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình phân lập từ đất vườn, làm thu 11 chủng Bacillus chọn chủng nấm Với thí nghiệm khảo sát khả đối kháng nấm Phytophthora vi khuẩn Bacillus Chúng tiến hành khảo sát chủng Bacillus với chủng nấm chọn, có chủng đối kháng mạnh - B1 ∆D = 9,75mm - B3 ∆D = 10,75mm - B5 ∆D = 11,75mm Có thể thấy vi khuẩn Bacillus có khả đối kháng chủng nấm bệnh nấm Phytophthora gây 4.2 Kiến nghị - Nghiên cứu tiếp số chủng có khả đối kháng với nấm - Tiếp tục định danh đến loài - Nuôi cấy dịch lấy dịch chống bệnh loét sọc miệng cạo cao su 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Viêṭ Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đồn Xn Mượu, PhạmVăn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học (tập 3), NXB Khoa học Kĩ Thuật, Hà Nội Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000), Nấm mốc phương pháp phòng chống, NXB Khoa học Kĩ Thuật, trang 69-111 Đoàn Lê Minh Hiền (2013).Tuyển chọn chủng Bacillus spp Có khả kháng nấm Fusarium sp Và Phytophthora Palmivora gây bệnh bắp(Zea maysl.), Luận văn tốt nghiệp, Trường ĐH Sư Phạm TP.HCM,tr.4-tr.18 Đinh Vũ Thắng (2006), Bước đầu tạo tiêu (Diper nigrum) in vitro kháng nấm Phytophthorasp., Luận văn tốt nghiệp, Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM, tr.9 Nguyễn Đức Lượng cs, Thí Nghiệm Vi Sinh Vật Học, Thí Nghiệm Cơng Nghệ Sinh học Tập 2,2006, NXB ĐHQG TP Hồ Chí Minh Nguyễn Hồng Trí, Phan Nguyên Hồng (1995), “ Rừng ngập mặn Việt Nam, người HST phát triển bền vững ”, NXB Nông nghiệp Hà Nội, trang 189-204 Nguyễn Huỳnh Hoàng Minh (2006), Định danh nấm Phytophthora spp kĩ thuật sinh học phân tử, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đh Nông Lâm TP.HCM, tr.3-tr.5, tr.7-tr.9 Nguyễn Lý Nhơn, Nguyễn Như Nhứt (2008), “Tiềm ứng dụng Bacillus subtilis để kiềm soát nấm bệnh Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani Phytophthora capsici”, Báo cáo Khoa học, Trường Đại Học Cần Thơ 30 Nguyễn Thị Trần Thụy (2009), Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đh Sư phạm TP.HCM, tr.3-tr.10 10 Lê Tấn Lợi (2011), “Ảnh hưởng dạng lập địa tần số ngập triều lên tính chất lí hóa học đất khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ”, Tạp chí khoa học, Trường ĐH Cần Thơ, 7tr 11 Lương Đức Phẩm (2011), Sản xuất sử dụng chế phẩm sinh học nông nghiệp, NXB Giáo dục Việt Nam 12.Lương Đức Phẩm (2007), chế phẩm sinh hocdungf chăn nuôi nuôi trồng thủy sản, NXB Nông Nghiệp, tr.143-tr.147 13 Trần Thị Bích Quyên (2012), nghiên cứu tuyển chọn số chủng Bacillus làm probiotic chăn nuôi, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm TP.HCM, tr.13-tr.20, tr.37, tr.48 Tiếng Anh 14 A.D.Agate C.V Subramania M Vannucci (1988), Mangrove microbiology, UNDP/UNESCO Regional Project RAS/86/1988, pp 9-18 15 Islam M.R., Yong Tea Jeong, Yong Se Lee, Chi Hyun Song (2010), “Isolation anh identification of antifungal compound from Bacillus subtilis C9 inhibiting the growth of plant pathogenicfungi”, Mycobiologi, 40 (1), p 61 16 Wan Gyn Rim, Hang Yeon Woen, Sang Yeob Lee (2007), In vitro Antagonistic Effect of Bacilli Isolates againts Four Soiborne Plant Pathogenic Fungi”, PlantPathologi Journal, 24(1), pp 52-56 31 17 Hai Kuan Wang, Rui Feng Xiao, Wei Qi (2012), “Antifungal Activity of Bacillus coagulans TQ33, Isolated from Skimmed Milk Powder, Againsnt Botrytis cinerea” Original Scientific,pp.2-3 Tài liêụ từ internet 18 Bệnh tiêu sầu tiêu, http://tailieuvn.com.vn/qui-trinh-xu-ly-phong-va-tri-benhdo-nam-phytopthora-gay-hai-tren-cay-tieu-bang-thuoc-agri-fos-400.html (13h, 17/09/1015) 19 http://tailieuvn.com.vn/tai-qui-trinh-xu-ly-phong-va-tri-benh-do-nam-phytopthora- gay-hai-tren-cay-sau-rieng-bang-thuoc-agri-fos-400.htm (13h, 17/09/2015) 20 http://kythuatnhanong.com/phong-nam-benh-phytopthora-cho-cacao-trong-mua-mua/ (13h, 17/09/2015) 21.Nguyễn Thị Trần Thụy (2009), Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất vườn sinh ptotease kiềm http://www.zbook.vn/ebook/nghien-cuu-tuyen-chonchung-vi-khuan-bacillus-phan-lap-tu-dat-vuon-sinh-protease-kiem-44653/ (20h, 18/09/2015) 22 Lê Xuân Phương, Thí nghiêm vi sinh vật https://www.lhu.edu.vn/Data/News/388/files/ThinghiemVisinh_lazk0.pdf học, (10h, 18/09/2015) 23 Lê Huy Hoàng (2015), Quy trình thử nghiêm http://www.visinhyhoc.net/qui-trinh-thu-nghiem-catalase/ (14h30, 18/09/2015) 32 Catalase, PHỤ LỤC Hình 3.5 Khả kháng Hình 3.6.đối Khả năngcủa đối kháng chủng B1 nấm Phytophthora chủng B2 nấm Phytophthora 33 Hình 3.8.của Khả đối kháng Hình 3.7 Khả đối kháng chủng B6 nấm Phytophthora chủng B4 nấm Phytophthora Hình 3.10 Khả đối kháng 34 Hình 3.9 Khả đối kháng Hình thái Hình 3.12 Hình thái Hình tế bào3.12 chủng B1 tế bào chủng B2 Hình 3.11 Hình thái tế bào chủng B1 Hình 3.13 Hình tháiHình tế bào củaHình chủng B3tế bào chủng B5 3.14 thái 35 Hình 3.15 Hình tháiHình tế bào3.16 Hình chủngthái B4 tế bào chủng B6 Hình Hình3.17 3.17.Hình Hìnhthái tháitếtếbào bàocủa củachủng chủngB8 B7 36 Hình 3.18 Hình thái tế bào chủng B8 ... 3.3 Khảo sát khả đối kháng nấm vi khuẩn Bacillus Từ chủng vi khuẩn phân lập mục 3.1 chủng nấm Chúng tiến hành đối kháng môi trường PGA, thu kết sau: Bảng 3.2 Khảo sát khả đối kháng chủng Bacillus. .. trình phân lập từ đất vườn, làm thu 11 chủng Bacillus chọn chủng nấm Với thí nghiệm khảo sát khả đối kháng nấm Phytophthora vi khuẩn Bacillus Chúng tiến hành khảo sát chủng Bacillus với chủng nấm. .. 3.5 Khả kháng Hình 3.6 .đối Khả năngcủa đối kháng chủng B1 nấm Phytophthora chủng B2 nấm Phytophthora 33 Hình 3.8 .của Khả đối kháng Hình 3.7 Khả đối kháng chủng B6 nấm Phytophthora chủng B4 nấm Phytophthora