Biểu tượng trong bộ ba tác phẩm xứ tuyết ngàn cánh hạc cố đô của yasunari kawabata

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Phạm Thị Lệ Quyên NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ LÊN MEN TẠO POLY-βHYDROXYBUTYRATE LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Phạm Thị Lệ Quyên NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ LÊN MEN TẠO POLY-βHYDROXYBUTYRATE Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN HOÀNG DŨNG TS CHUNG ANH DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu riêng tơi Kết trình bày luận văn trung thực chưa tác giả cơng bố cơng trình Các trích dẫn bảng biểu, kết nghiên cứu tác giả khác; tài liệu tham khảo luận văn có nguồn gốc rõ ràng theo quy định TP Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 03 năm 2015 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Phạm Thị Lệ Quyên LỜI CÁM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn giáo viên hướng dẫn tơi, TS Trần Hồng Dũng TS Chung Anh Dũng – người tận tình giúp đỡ hướng dẫn tơi q trình học tập, nghiên cứu hồn thiện luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn Giáo sư, Phó giáo sư, Tiến sĩ Hội đồng cấp đọc góp ý cho luận văn tơi Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ths Huỳnh Văn Hiếu, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành cho nhiều ý kiến q báu q trình làm luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Q thầy Trường, Phịng Sau đại học, Khoa Sinh học, môn công nghệ sinh học - Trường Đại học Sư phạm TP HCM , Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp miền Nam Trường Đại học Nguyễn Tất Thành tạo điều kiện thuận lợi cho thực luận văn Qua đây, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè giúp đỡ suốt thời gian thực luận văn TP Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 03 năm 2015 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Phạm Thị Lệ Quyên MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cám ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình MỞ ĐẦU .1 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Công nghệ lên men 1.1.1 Khái quát trình lên men 1.1.2 Phương pháp lên men 1.2 Nhựa phân hủy sinh học 1.3 Poly-β-hydroxybutyrate (PHB) 1.3.1 Cấu trúc đặc tính lí hóa PHB 1.3.2 Quá trình sinh tổng hợp PHB 1.3.3 Vi sinh vật sản xuất PHB 1.3.4 Lược sử ngành công nghiệp sản xuất PHB 11 1.3.5 Phương hướng cải thiện sản xuất PHB 12 1.3.6 Tách thu hồi PHB 15 1.3.7 Ứng dụng PHB 17 1.4 Những nghiên cứu nước 18 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Địa điểm – Thời gian thực 20 2.2 Vật liệu 20 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.2.2 Hóa chất thiết bị 20 2.3 Bố trí thí nghiệm 23 2.3.1 Kiểm tra số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn 23 2.3.2 Khảo sát số điều kiện thích hợp để lên men R eutropha tạo PHB 23 2.3.3 Thí nghiệm lên men theo mẻ R eutropha để tạo PHB 25 2.4 Phương pháp phân tích thí nghiệm 26 2.4.1 Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn 26 2.4.2 Kiểm tra hoạt tính tạo PHB R eutropha phương pháp nhuộm SBB 26 2.4.3 Xác định khối lượng khô tế bào 27 2.4.4 Xác định PHB tế bào phương pháp nhuộm huỳng quang 27 2.4.5 Tách chiết PHB sodium hypochlorite chloroform 27 2.4.6 Định lượng PHB phương pháp quang phổ hấp thu tử ngoại 28 2.4.7 Phương pháp xử lí số liệu 29 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .30 3.1 Kết khảo sát số đặc điểm sinh học giống vi khuẩn 30 3.2 Kết xây dựng đường chuẩn PHB 31 3.3 Kết khảo sát số điều kiện thích hợp để lên men R eutropha tạo PHB 32 3.3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ mật rỉ 32 3.3.2 Kết khảo sát nguồn nitrogen thích hợp 35 3.3.3 Kết khảo sát nồng độ nitrogen thích hợp 37 3.3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu 39 3.4 Kết lên men theo mẻ R eutropha để tạo PHB 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Chú giải CoA Coenzyme A cs cộng PHA Polyhydroxyalkanoate PHB Poly–β–hydroxybutyrate rpm Revolutions per minute (số vòng phút) SBB Sudan Black B UV UltraViolet DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 So sánh đặc tính hóa lí PHB PP Bảng 1.2 Thành phần mật rỉ mía mật rỉ củ cải đường .14 Bảng 1.3 Một số phương pháp thu hồi PHB .16 Bảng 2.1 Các hóa chất phân tích 21 Bảng 2.2 Danh mục thiết bị sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 3.1 Tương quan hàm lượng PHB chuẩn giá trị OD235 31 Bảng 3.2 Kết lượng sinh khối khô tế bào thu sau 96 lên men 43 Bảng 3.3 Kết đo OD235 xác định hàm lượng PHB sinh khối tế bào 44 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Công thức cấu trúc tổng quát PHB Hình 1.2 Cơ chế sinh tổng hợp PHB Hình 2.1 Thiết bị lên men 150 mL 22 Hình 2.2 Sơ đồ phương pháp xử lí mật rỉ đường 24 Hình 2.3 Sơ đồ phương pháp tách PHB NaClO chloroform .28 Hình 2.4 Sơ đồ phương pháp định lượng PHB 29 Hình 3.1 Khuẩn lạc R eutropha hình dạng tế bào R eutropha 30 Hình 3.2 Kết nhuộm Sudan Black B 30 Hình 3.3 Đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan quan tuyến tính hàm lượng PHB giá trị OD235 .31 Hình 3.4 Hệ thống lên men R eutropha 150 mL 32 Hình 3.5 Đồ thị thể thay đổi sinh khối tế bào theo thời gian ảnh hưởng nồng độ mật rỉ khác 33 Hình 3.6 Đồ thị thể hàm lượng PHB tế bào nồng độ mật rỉ khác 34 Hình 3.7 Đồ thị thể ảnh hưởng nguồn nitrogen khác lên sinh trưởng tế bào 35 Hình 3.8 Đồ thị thể ảnh hưởng nguồn nitrogen khác đến hàm lượng PHB sinh khối tế bào 36 Hình 3.9 Đồ thị biễu diễn sinh trưởng vi khuẩn mơi trường có nồng độ nitrogen khác 37 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn hàm lượng PHB sinh khối tế bào nồng độ nitrogen khác 38 Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sinh khối khô tế bào môi trường có độ pH khác .39 Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn hàm lượng PHB sinh khối tế bào mơi trường có độ pH khác .40 Hình 3.13 Bình chứa mơi trường lên men .41 Hình 3.14 Hệ thống lên men BioFlo 110 41 Hình 3.15 Kết nhuộm Nile blue A .42 Hình 3.17 Sản phẩm PHB thu từ 30 mg sinh khối vi khuẩn 43 Hình 3.18 Dung dịch H2SO4 đậm đặc chứa sản phẩm PHB .43 42 Nhuộm 10 µL mẫu với Nile blue A quan sát kính hiển vi huỳnh quang với bước sóng 460 nm, độ phóng đại 60X để xác định diện PHB tế bào Vết nhuộm có màu cam sáng cho thấy diện hạt PHB tế bào vi khuẩn Hình 3.15 Kết nhuộm Nile blue A Phần sinh khối lại đem ly tâm sấy khô Kết khối lượng khơ tế bào thể bảng 3.1 Hình 3.16 Sinh khối khô vi khuẩn R eutropha 43 Bảng 3.2 Kết lượng sinh khối khô tế bào thu sau 96 lên men Lần thực nghiệm Khối lượng khơ tế bào (g/L) Trung bình (g/L) Lần Lần Lần 1,28 1,34 1,25 1,29 ± 0,05 Để xác định hàm lượng PHB tế bào, xử lí tách PHB 30 mg sinh khối khơ vi khuẩn NaClO chloroform, dùng phương pháp đo mật độ quang bước sóng 235 nm để định lượng PHB Kết thể bảng 3.3 Hình 3.17 Sản phẩm PHB thu từ 30 mg sinh khối vi khuẩn Hình 3.18 Dung dịch H2SO4 đậm đặc chứa sản phẩm PHB 44 Bảng 3.3 Kết đo OD235 xác định hàm lượng PHB sinh khối tế bào Lần thực nghiệm Lần Lần Lần Hệ số pha loãng 104 104 104 OD235 0,077 0,076 0,076 0,682 0,674 0,674 6,82 6,74 6,74 Hàm lượng PHB suy từ đường chuẩn (µg/mL) Hàm lượng PHB 30mg 6,773 ± 0,025 sinh khối (mg) % PHB/Sinh khối khô 22,73% Trung bình (%) 22,5% 22,5% 22,6% ± 0,05 Sau 96 lên men, thu lượng sinh khối khô 1,29 g/L, hàm lượng PHB tế bào đạt xấp xỉ 22,6% Việc lên men R eutropha để tạo PHB nghiên cứu nhiều nơi giới Kim cộng (1994) tiến hành lên men theo mẻ có bổ sung R eutropha NCIMB 11599 Sau 50 giờ, sinh khối khô tế bào, khối lượng PHB hàm lượng PHB sinh khối tế bào đạt 164 g/L, 121 g/L, 76% [20] Suwannasing cộng (2011) sử dụng nước mía đường làm nguồn carbon để lên men theo mẻ R eutropha TISTR 1095 hệ thống lên men L, sau 60 lên men, lượng sinh khối đạt 5,88 g/L, hàm lượng PHB đạt 21,8% khối lượng khô tế bào (1,28 g/L) [38] Có thể thấy, so với nghiên cứu trước đây, kết chúng tơi cịn thấp Tuy nhiên, Kim cộng sử dụng nguồn carbon tinh glucose làm chất, Suwannasing cộng sử dụng nước mía, chúng tơi sử dụng mật rỉ, vốn có thành phần gồm nhiều loại đường tự nhiên, tổng lượng đường chiếm khoảng 50% mật rỉ, ngồi cịn chứa chất hữu vơ khác [20, 38] Do đó, lượng sinh khối vi khuẩn mà thu thấp Chúng nhận thấy sử dụng phương pháp lên men theo mẻ có bổ sung (Kim cộng sự, 1994) cho kết thu sinh khối PHB cao so với phương pháp 45 lên men theo mẻ mà Suwannasing áp dụng Như việc lựa chọn phương pháp lên men ảnh hưởng đến hiệu sản xuất PHB Giải thích việc kết hàm lượng PHB tích lũy tế bào thấp (22,8%), cho chất lượng mật rỉ ảnh hưởng đến sinh trưởng sinh tổng hợp PHB vi khuẩn Phương pháp lên men theo mẻ không đem lại hiệu cao phương lên men theo mẻ hai giai đoạn hay lên men theo mẻ có bổ sung Bên cạnh đó, trình tách PHB NaClO làm hao hụt PHB Hơn nữa, việc xác định khối lượng PHB phương pháp đo mật độ quang cho kết tương đối Để đánh giá tính hiệu nghiên cứu lên men tạo PHB từ R eutropha chất mật rỉ đường, so sánh kết với nghiên cứu trước Beaulieu cộng (1995) lên men theo mẻ có bổ sung R eutropha, sử dụng glucose, có bổ sung thêm 0,3% mật rỉ đường mía, thu nhận 23,06 g/L sinh khối khơ, hàm lượng PHB tích lũy đạt 39% khối lượng khơ tế bào Kumar cộng (2005) tiến hành lên men theo mẻ hai giai đoạn, sử dụng glucose, bột bã cọ, mật rỉ làm nguồn carbon Giai đoạn đầu, vi khuẩn tăng sinh môi trường bổ sung đầy đủ dinh dưỡng Tồn mơi trường tăng sinh sau ly tâm thu sinh khối chuyển vào mơi trường giới hạn nitrogen để kích thích tổng hợp PHB tế bào Kết thu lượng PHB g/L, g/l 7,3 g/L [23] Joeng-Kwi Seo cộng (1998) lên men theo mẻ R eutropha, sử dụng nguồn carbon glucose, fructose acid lactic thu lượng sinh khối 11,9 g/L, 11,9 g/L, 8,5 g/L, hàm lượng PHB 19,4%, 21,6%, 21,7% [35] El-sayed cộng (2009) sau tối ưu hóa điều kiện dinh dưỡng để lên men tạo PHB thực lên men theo mẻ hai giai đoạn, kết hàm PHB tích lũy tế bào đạt 48,43%, cao nhiều so với phương pháp lên men theo mẻ giai đoạn (hàm lượng PHB đạt 5,9%) [9] Chakraborty cộng (2012) sử dụng dịch bắp cô đặc, sản phẩm thải ngành công nghiệp sữa, làm môi trường lên men R eutropha tạo PHB, áp dụng phương pháp lên men theo mẻ có bổ sung liên tục hỗn hợp acid béo chuỗi ngắn 46 trình lên men Kết thu nhận 8,37 g/L sinh khối khô tế bào, hàm lượng PHB 39,52% [13] Kim cộng (1996) lên men theo mẻ hai giai đoạn hệ thống lên men áp suất cao, sử dụng fructose làm chất carbon thu 6,41 g/L sinh khối khô, hàm lượng PHB tối đa đạt 61,5% [21] Syamsu cộng (2006) hội thảo quốc tế công nghệ kĩ thuật tài nguyên thiên nhiên báo cáo nghiên cứu sản xuất PHB từ R eutropha chất bột cọ thủy phân theo phương pháp lên men theo mẻ có bổ sung, kết cho thấy R eutropha tích lũy lượng PHB 3,72 g/L, đạt 76,54% khối lượng khô tế bào [39] Fang Liu cộng (1998) lên men theo mẻ có bổ sung E coli chất rỉ đường củ cải thu 39,5 g/L sinh khối khô tế bào, hàm PHB tích lũy tế bào lên đến 80% [26] Tại Việt Nam có nghiên cứu sản xuất PHB số chủng vi khuẩn khác Methylobacterium sp., Alcaligenes latus VN1, … Lê Lý Thùy Trâm cộng (2006) phân lập chủng vi khuẩn Methylobacterium sp có khả tích lũy PHB cao 31,37% môi trường KC với thành phần khoáng + 0,1 g/L cao men + 1% methanol sau ngày nuôi cấy Phạm Thanh Hà cộng (2008) dùng tia UV gây đột biến chủng Alcaligenes latus VN1 nhằm khả tổng hợp PHB chủng Chủng đột biến có khả tích lũy lượng PHB đến 55,6% khối lượng khô tế bào, sinh trưởng đạt tối đa 15,42 g/L sau 28 lên men [7] Kiều Phương Nam cộng (2010) nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp để chủng Methylobacterium radiotolerans H2T tích lũy tạo PHB, sử dụng nguồn carbon methanol kích thích tế bào tích lũy lượng PHB 50,55% khối lượng khô tế bào [1] Thông qua so sánh kết với nghiên cứu trên, nhận thấy kết mà thu cịn chưa cao Giải thích hạn chế khiến kết nghiên cứu chưa đạt yêu cầu, cho số nguyên nhân sau Môi trường lên men sử dụng nguồn carbon mật rỉ để thay hoàn toàn cho nguyên liệu đắt tiền glucose hay fructose Rỉ đường mía có tổng hàm lượng 47 đường chiếm khoảng 50% cịn chứa chất hữu vơ khác protein thô, potassium, calcium, sulfur, Điều ảnh hưởng đến sinh trưởng vi khuẩn, khiến lượng sinh khối PHB thu không cao lên men mơi trường có glucose, fructose, … Cùng phương pháp lên men theo mẻ, kết hàm lượng PHB mà thu (22,6%) tương đồng với kết Joeng-Kwi Seo cộng (1998) (21,7% chất acid lactic), cao kết El-sayed cộng (2009) (5,9% chất glucose) Đây tín hiệu khả quan, cho thấy mật rỉ sử dụng làm nguồn carbon cho lên men tạo PHB Phương pháp lên men theo mẻ hai giai đoạn phương pháp lên men theo mẻ có bổ sung cho kết sinh khối PHB cao phương pháp lên men theo mẻ truyền thống mà áp dụng Do đó, để cải thiện hiệu sản xuất PHB, cần phải thay đổi phương pháp lên men Quy trình tách chiết PHB NaClO chloroform Hahn cộng (1995) chứng minh có hiệu thu hồi cao, làm giảm khối lượng phân tử PHB Tuy nhiên, phương pháp khơng thể hồn tồn tránh khỏi việc hao hụt PHB thay đổi cấu trúc phân tử PHB trình tách chiết Do đó, cần nghiên cứu rộng nhằm tìm phương pháp thu hồi PHB hiệu cao, ứng dụng quy mơ cơng nghiệp Tóm lại, lên men theo mẻ R eutropha sử dụng chất mật rỉ đường dù không mang lại kết cao, nhận thấy kết nghiên cứu làm sở để tiến hành nghiên cứu sâu nhằm cải thiện suất sản xuất PHB 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua nghiên cứu, xác định số điều kiện dinh dưỡng mơi trường thích hợp cho việc lên men tạo PHB R eutropha sau: - Nồng độ mật rỉ thích hợp 60 g/L - Nguồn nitrogen thích hợp (NH4)2SO4 với nồng độ g/L - pH trung tính - Thời gian thu mẫu sau 96 lên men Thử nghiệm lên men hệ thống lên men, sử dụng môi trường tối ưu xác định, thu kết tương tự với kết thí nghiệm quy mơ 150 mL, lượng sinh khối tế bào khoảng 1,29 ± 0,05 g/L với hàm lượng PHB tích lũy sinh khối 22,6 ± 0,05% Kết đạt khơng cao, chúng tơi sử dụng làm sơ sở cho nghiên cứu sâu nhằm cải thiện hiệu lên men tạo PHB Kiến nghị - Thay đổi phương pháp lên men để cải thiện khả tạo PHB vi khuẩn - Tiến hành khảo sát thêm số yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men tạo PHB - Nghiên cứu phương pháp tách thu hồi PHB đạt hiệu cao 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Kiều Phương Nam cs (2010), "Nghiên cứu điều kiện lên men thúc đẩy tích lũy PHB (Poly-beta-hydroxybutyrate) chủng Methylobacterium radiotolerans H2T", Tạp chí công nghệ sinh học, 8(3B) Lê Lý Thùy Trâm (2006), "Thu nhận Poly-β-hydroxybutyrate, loại nhựa sinh học dễ phân hủy, từ vi khuẩn Methylobacterium sp phân lập Việt Nam", Tạp chí khoa học cơng nghệ - Đại học Đà Nẵng, 1(13) Lê Lý Thùy Trâm (2006), Nghiên cứu thu nhận nhựa phân hủy sinh học poly-βhydroxybutyrate (PHB) từ vi khuẩn Methylobacterium sp phân lập Việt Nam, Luận văn thạc sĩ Sinh học, ĐH Khoa học tự nhiên - ĐH quốc gia Tp Hồ Chí Minh Lê Gia Huy Khuất Hữu Thanh (2012), Cơ sở công nghệ vi sinh vật ứng dụng, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam Nguyễn Lân Dũng (2007), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Văn Dự Nguyễn Đăng Bình (2011), Quy hoạch thực nghiệm kỹ thuật, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Phạm Thanh Hà, Trần Đình Mấn Yataka Tokiwa (2008), "Tạo đột biến nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp poly-β-hydroxybutyrate vi khuẩn Alcaligenes lactus VN1", Tạp chí cơng nghệ sinh học, 6(4) Tiếng nước Azhar A.El-Sayed cs (2009), "Batch Production of Polyhydroxybutyrate (PHB) by Ralstonia Eutropha and Alcaligenes Latus Using Bioreactor Different Culture Strategies", Journal of Applied Sciences Research, 5(5) Azhar A.El-Sayed cs (2009), "Batch Production of Polyhydroxybutyrate (PHB) Using Batch and Two-stage Batch Culture Strategies", Australia Journal of Basic and Applied Sciences, 3(2) 50 10 Shrivastav Anupama, Kim Hae-Yeong Kim Young-Rok (2013), "Advances in the Applications of Polyhydroxyalkanoate Nanoparticles for Novel Drug Delivery System", BioMed Research International, 12 11 Soroosh Bagheriasl (2012), Development and Characterisation of Polyhydroxybutyrate from Selected Bacterial Species, Doctor Of Philosophy, University of Birmingham 12 M Beaulieu cs (1995), "Influence of Ammonium Salts and Cane Molasses on Growth of Alcaligenes eutrophus and Production of Polyhydroxybutyrate", Applied and Environmental Microbiology, 61(1) 13 Panchali Chakraborty, Kasiviswanathan Muthukumarappan William R Gibbons (2012), "PHA Productivity and Yield of Ralstonia eutropha When Intermittently or Continuously Fed a Mixture of Short Chain Fatty Acids", Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2012 14 P.S Chandrashekharaialh (2005), Isolation, screening and selection of eficient Poly-β-hydroxybutyrate (PHB) synthesizing Bacteria, Master of Science, University of Agricultural Sciences 15 Ivan Chodak (2008), Polyhydroxyalkanoates: Origin, Properties and Applications, Elsevier 16 G Du cs (2001), "Continuous production of poly-3-hydroxybutyrate by Ralstonia eutropha in a two-stage culture system", J Biotechnol, 88(1) 17 Enrico Grothe, Murray Moo-Young Yusuf Chisti (1999), "Fermentation optimization for the production of poly(β-hydroxybutyric acid) microbial thermoplastic", Enzyme and Microbial Technology, 25(1–2) 18 Sei Kwang Hann, Yong Keun Chang Sang Yup Lee (1995), "Recovery and Characterization of Poly(3-Hydroxybutyric Acid) Synthesized in Alcaligenes eutrophus and Recombinant Escherichia coli", Applied and Environmental Microbiology, 61(1) 19 Nicolas Jacquel cs (2008), "Isolation and purification of bacterial poly(3hydroxyalkanoates)", Biochemical Engineering Journal, 39(1) 51 20 B S Kim cs (1994), "Production of poly(3-hydroxybutyric acid) by theo mẻ có bổ sung culture of Alcaligenes eutrophus with glucose concentration control", Biotechnology and Bioengineering, 43(9) 21 Kyeo-Keun Kim Sun Kyoung Shin (1996), " Environmentally Safe Polyhydroxybutyrate Synthesis by Alcaligenes eutrophus in Pressurized Fermentor", Journal of Ind & Eng Chemistry, 2(1) 22 Martin Koller cs (2010), "Microbial PHA Production from Watse Raw Materials", Microbiology Monographs, 14 23 B Senthil Kumar G Prabakaran (2005), "Production of PHB (bioplastics) using bio-effluent as subtrate by Alcaligenes eutrophus", Indian Journal of Biotechnology, 24 Kshama Lakshman (2004), Study on the production of biopolymers by Rhizobium sps on their isolation and characterization, Doctor Of Philosophy, University of Mysore 25 S.Y Lee, F Wang Y Lee (2002), "A method for producing hydroxycarboxylic acids by auto-degradation of polyhydroxyalkanoates", 26 Fang Liu cs (1998), "Production of poly-β-hydroxybutyrate on molasses by recombinant Escherichia coli", Biotechnology Letters, 20(4) 27 C Marangoni, A Furigo Jr G M F Aragao (2001), "The influence of substrate source on the growth of Ralstonia eutropha, aiming at the production of polyhydroxyalkanoate", Brazilian Journal of Chemical Engineering, 18 28 Philippe Marchessault (1996), Fermentation methods for the production of Poly(3-hydroxybutyrate) by Alcaligenes eutrophus DSM 545, Master of Science, McGill University 29 Darshan Marjadi Nishith Dharaiya (2014), "Recovery and characterization of poly(3-Hydroxybutyric acid) synthesized in Staphylococcus epidermidis ", African Journal of Environmental Science and Technology, 8(6) 52 30 Jaruwan Marudkla, Chiravoot Pechyen Sarote Sirisansaneeyakul (2012), Effect of glucose on phb production using Alcaligenes eutrophus DSM 545 and TISTR 1095, 1st Mae Fah Luang University International Conference 2012 31 Sadeghi Pour Marvi Mahdi Mahdi (2013), "Thermoplastic biopolymer production (PHB, Poly 3-Hydroxybutyric acid) using secondary carbon source bioreactor based on nitrogen fixation biotechnology", Bioresearch bulletin 32 M Mekala, R Rajendran K Suganya (2013), "Comparative studies on cell growth and production of PHB", International journal of environmental sciences, 3(6) 33 A G Ostle J G Holt (1982), "Nile blue A as a fluorescent stain for poly-betahydroxybutyrate", Applied and Environmental Microbiology, 44(1) 34 Maria Celisa Santimano (2010), Production of Polyhydroxyalkanoates using Bacillus sp., Doctor of Philosophy, Goa University 35 Joeng-Kwi Seo cs (1998), "Optimum Growth Conditions and pH Control Solution for PHB Biosynthesis in A eutrophus", Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 4(3) 36 Ojumu Solomon (2003), "Production of Polyhydroxyalkanoates, a bacterial biodegradable polymer", African Journal of Biotechnology, 37 P F Stanbury, A Whitaker S J Hall (1995), Principles of Fermentation Techtology, Elsevier Science 38 Waranya Suwannasing, Samart Moonamart Pakawadee Kaewkannetra (2011), "Yields of Polyhydroxyalkanoates (PHAs) during Batch Fermentation of Sugar Cane Juice by Alcaligenes latus and Alcaligenes eutrophus", Journal of Life Sciences, 39 Khaswar Syamsu cs (2006), Production of Pha (Poly Hydroxy Alkanoates) by Ralstonia Eutropha on Hydrolysed Sago Starch as Main Substrate using Theo mẻ có bổ sung Cultivation Method, 1st International Conference on Natural Resources Engineering & Technology 2006 53 40 Fatemeh Tabandeh Ebrahim Vasheghani-Farahani (2003), "Biosynthesis of Poly-β-hydroxybutyrate as a Biodegradable Polymer", Iranian Polymer Journal, 12 41 Sabu Thomas cs (2012), Natural Polymers, Biopolymers, Biomaterials, and Their Composites, Blends, and IPNs Apple Academic Pres, Canada 42 Bingquing Wang (2011), Production of Polyhydroxybutyrate (PHB) by Alcaligenes lactus using Sucrose based Synthetic Media and Sugarbeet Juice, Master of Science, North Carolina State University PHỤ LỤC Phụ lục Kết xây dựng đường chuẩn PHB phương pháp quang phổ tử ngoại Hàm lượng Lần 0,175 0,233 0,345 0,517 0,723 Lần 0,175 0,235 0,344 0,517 0,734 Lần 0,175 0,233 0,341 0,516 0,730 0,175 0,234± 0,001 0,343± 0,002 PHB (µg/mL) OD235 Trung bình cộng 0,517±0,001 0,729±0,006 Phụ lục Kết cân sinh khối tế bào 2.1 Khảo sát nồng độ mật rỉ thích hợp Kết khối lượng khô tế bào Giờ 24 48 72 96 120 20 g/L 0,901 ± 0,03 1,016 ± 0,02 1,061 ± 0,03 1,103 ± 0,003 1,013 ± 0,05 40 g/L 60 g/L 80 g/L 0,922 ± 0,03 1,156 ± 0,04 1,317 ± 0,04 1,348 ± 0,05 1,164 ± 0,02 1,015 ± 0,02 1,338 ± 0,02 1,482 ± 0,02 1,552 ± 0,05 1,484 ± 0,02 1,002 ± 0,03 1,071 ± 0,03 1,125 ± 0,03 1,191 ± 0,02 1,108 ± 0,03 Kết khối lượng PHB thu 20 g/L 40 g/L 60 g/L 80 g/L Giờ 24 0,050 ± 0,050 0,071 ± 0,001 0,086 ± 0,017 0,070 ± 0,042 48 0,130 ± 0,026 0,155 ± 0,043 0,206 ± 0,019 0,168 ± 0,028 72 0,181 ± 0,037 0,255 ± 0,033 0,286 ± 0,014 0,213 ± 0,025 96 0,165 ± 0,013 0,290 ± 0,047 0,343 ± 0,029 0,250 ± 0,008 120 0,135 ± 0,013 0,244 ± 0,026 0,312 ± 0,027 0,232 ± 0,045 2.2 Khảo sát nguồn nitrogen thích hợp Kết khối lượng khô tế bào Giờ 24 48 72 96 120 urea 0,732 ± 0,03 0,924 ± 0,03 1,102 ± 0,03 1,097 ± 0,03 1,067 ± 0,02 NH4Cl Peptone 0,731 ± 0,04 0,910 ± 0,02 0,993 ± 0,04 1,015 ± 0,05 0,998 ± 0,02 0,962 ± 0,04 1,188 ± 0,05 1,233 ± 0,03 1,336 ± 0,03 1,386 ± 0,05 (NH4)2SO4 1,007 ± 0,05 1,462 ± 0,02 1,489 ± 0,02 1,689 ± 0,02 1,4 ± 0,04 Kết khối lượng PHB thu urea NH4Cl Peptone (NH4)2SO4 Giờ 24 0,054 ± 0,043 0,050 ± 0,024 0,075 ± 0,033 0,083 ± 0,043 48 0,145 ± 0,040 0,137 ± 0,018 0,174 ± 0,031 0,236 ± 0,000 72 0,220 ± 0,022 0,188 ± 0,002 0,246 ± 0,049 0,296 ± 0,049 96 0,240 ± 0,008 0,208 ± 0,010 0,266 ± 0,006 0,371 ± 0,004 120 0,224 ± 0,020 0,200 ± 0,038 0,275 ± 0,002 0,310 ± 0,021 2.3 Khảo sát nồng độ nitrogen thích hợp Kết khối lượng khô tế bào Giờ 24 1g/L g/L 0,433 ± 0,03 0,611 ± 0,02 48 0,883 ± 0,02 72 g/L g/L g/L 0,802 ± 0,02 1,066 ± 0,03 1,100 ± 0,003 0,956 ± 0,05 1,097 ± 0,002 1,372 ± 0,05 1,454 ± 0,03 0,980 ± 0,04 1,051 ± 0,01 1,202 ± 0,02 1,488 ± 0,03 1,533 ± 0,03 96 1,072 ± 0,02 1,083 ± 0,02 1,157 ± 0,003 1,604 ± 0,04 1,941 ± 0,05 120 0,950 ± 0,04 0,999 ± 0,05 1,087 ± 0,04 1,412 ± 0,05 1,640 ± 0,05 Kết khối lượng PHB thu 1g/L g/L g/L g/L g/L Giờ 24 0,037± 0,029 0,051± 0,033 0,062 ± 0,011 0,085 ± 0,031 0,083 ± 0,006 48 0,147± 0,047 0,145± 0,025 0,166 ± 0,003 0,206 ± 0,030 0,185 ± 0,047 72 0,195± 0,018 0,212± 0,029 0,229 ± 0,049 0,282 ± 0,025 0,261 ± 0,013 96 0,232± 0,010 0,238± 0,007 0,266 ± 0,024 0,365 ± 0,036 0,328 ± 0,004 120 0,198± 0,049 0,211± 0,045 0,244± 0,049 0,318± 0,020 0,290± 0,017 2.4 Khảo sát pH thích hợp Kết khối lượng khơ tế bào Giờ 24 0,185 ± 0,01 0,864 ± 0,04 0,990 ± 0,01 0,801 ± 0,04 0,226 ± 0,04 48 0,378 ± 0,02 0,808 ± 0,01 1,273 ± 0,04 0,902 ± 0,04 0,420 ± 0,05 72 0,469 ± 0,03 0,857 ± 0,04 1,394 ± 0,04 1,103 ± 0,005 0,709 ± 0,04 96 0,366 ± 0,04 0,711 ± 0,03 1,429 ± 0,03 1,103 ± 0,01 0,913 ± 0,05 120 0,268 ± 0,04 0,715 ± 0,05 1,363 ± 0,04 1,069 ± 0,03 0,940 ± 0,02 Kết khối lượng PHB thu Giờ 24 0,010 ± 0,020 0,054 ± 0,007 0,074 ± 0,014 0,052 ± 0,048 0,013 ± 0,050 48 0,043 ± 0,001 0,099 ± 0,031 0,195 ± 0,025 0,106 ± 0,009 0,033 ± 0,025 72 0,063 ± 0,031 0,140 ± 0,021 0,267 ± 0,022 0,195 ± 0,032 0,074 ± 0,042 96 0,064 ± 0,011 0,121 ± 0,009 0,307 ± 0,031 0,208 ± 0,043 0,101 ± 0,027 120 0,045 ± 0,013 0,120 ± 0,045 0,286 ± 0,006 0,193 ± 0,012 0,086 ± 0,014 ... acid base dễ tan dung môi hữu chloroform, methylene chloride, … - Khả khuếch tán oxygen tương đối Nhờ tính chất mà sản phẩm bao bì đựng thực phẩm làm từ PHB hạn chế oxygen hóa gây hỏng thực phẩm. .. hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ tối ưu 30 C [42] Hệ thống phân loại: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Betaproteobacteria Bộ: Burkholderiales Họ: Burkholderiaceae Chi: Cupriavidus/Ralstonia... sung ban đầu để vi khuẩn R eutropha tạo PHB tối ưu:  Nghiên cứu nồng độ mật rỉ đường bổ sung ban đầu  Nghiên cứu dạng muối nitrogen bổ sung ban đầu  Nghiên cứu nồng độ muối nitrogen bổ sung ban