Bước đầu nghiên cứu vi khuân nitrat hoá trong hồ chứa nước thải chợ vinh nghệ an

Trờng Đại học Vinh Khoa Sinh học Tống Thị Minh Thuyết Bớc đầu nghiên cứu vi khuẩn nitrat hoá trong hồ chứa nớc thải chợ Vinh Nghệ An khoá luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học Chuyên ngành: Di truyền - Vi sinh Khoá luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học - Sinh viên Tống Thị Minh Thuyết Vinh, tháng 5/2005 Mục lục Tống Thị Minh Thuyết .1 Bớc đầu nghiên cứu vi khuẩn nitrat hoá trong hồ chứa nớc thải chợ Vinh Nghệ An 1 Vinh, tháng 5/2005 .2 Mở đầu .4 Chơng I: Tổng quan tài liệu .6 I.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn nitrat hoá 6 I.2. Sự ảnh hởng của một số yếu tố sinh thái đến sinh trởng và phát triển của vi khuẩn nitrat hoá .9 2.1. Nhiệt độ .9 2.2. pH .10 2.3. Oxi hoà tan (DO) .10 2.4. Dinh dỡng 10 2.5. ánh sáng .11 2.6. Giá thể 11 I.3. Vai trò của vi khuẩn nitrat hoá đối với sự chuyển hoá nitơ trong các thủy vực .12 I.4. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn nitrat hoá ở Việt Nam 15 I.5. Các loại môi trờng dùng để phân lập và nuôi cấy vi khuẩn nitrat hoá .16 Chơng II: Đối tợngvà phơng pháp nghiên cứu 18 II.1. Đối tợng nghiên cứu 18 II.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .18 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu .18 2.2.2. Thời gian nghiên cứu 18 II.3. Phơng pháp nghiên cứu .19 2.3.1. Phơng pháp thu mẫu .19 2.3.2. Phơng pháp phân tích một số chỉ tiêu thuỷ lý thuỷ hoá .19 2.3.3. Phơng pháp nuôi cấy và xác định vi khuẩn tổng số hiểu khí [1] 20 2.3.4. Phơng pháp nuôi cấy và xác định coliform tổng số 21 2.3.5. Phơng pháp nuôi cấy vi khuẩn nitrat hoá .22 3.6. Phơng pháp xử lý số liệu 22 Chơng III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 24 I. Chất lợng nớc của hồ chứa nớc thải chợ Vinh (Nghệ An) 24 1.1. Một số đặc điểm của hồ chứa nớc thải chợ Vinh .24 1.2. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu thuỷ lý, thuỷ hoá và vi sinh vật 24 1.2.1. Kết quả phân tích Đợt I (ngày 11/10/2004) 24 1.2.2. Kết quả phân tích Đợt 2 (ngày 4/12/2004) .25 2 Khoá luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học - Sinh viên Tống Thị Minh Thuyết 1.2.3. Kết quả phân tích Đợt 3 (ngày 27/3/2005) .26 II. Kết quả định lợng vi khuẩn nitrat hoá .27 2.1. Định lợng bằng phơng pháp đếm số khuẩn lạc (CFU) trên môi trờng Vinogratxki chứa agar đặc 27 2.2. Định lợng bằng phơng pháp đếm số khuẩn lạc (CFU) trên môi trờng Nitrobacter Medium B chứa agar đặc 28 2.3. Định lợng bằng phơng pháp MPN trong môi trờng lỏng Nitrobacter Medium B .29 III. Một số đặc điểm của vi khuẩn nitrat hoá trong quá trình nuôi cấy .30 3.1. Vi khuẩn nitrat hoá nuôi cấy trên môi trờng agar đặc .30 3.2. Vi khuẩn nitrat hoá nuôi cấy trong môi trờng dịch thể .31 IV. Tìm hiểu về sự sinh trởng của vi khuẩn nitrat hoá 32 Kết luận và đề nghị .34 I. Kết luận .34 II. đề nghị 35 Tài liệu tham khảo .36 Phụ Lục 38 3 Khoá luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học - Sinh viên Tống Thị Minh Thuyết Mở đầu Trong những năm gần đây, sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật đã kéo theo sự gia tăng sản xuất công nghiệp và quá trình tiêu dùng của khoảng 6 tỷ ngời trên hành tinh này. Kết quả là đã góp phần tạo ra một lợng lớn các chất thải gây nên ô nhiễm trầm trọng môi trờng sống, ô nhiễm nguồn nớc, mặt đất và cả không khí. Đặc biệt, vấn đề ô nhiễm nguồn nớc do nớc thải sinh hoạt cho đến nay vẫn nằm trong mối quan tâm lo ngại không chỉ riêng Việt Nam mà tất cả các nớc trên thế giới. Nớc thải sinh hoạt do con ngời thải ra trong cuộc sống hàng ngày theo hệ thống cống rãnh, chảy vào các sông, hồ và gây ô nhiễm các thuỷ vực. Loại nớc thải này chứa nhiều phân rác, các hợp chất hữu cơ và các muối hoà tan. Đặc biệt là sự có mặt của các loại vi khuẩn đờng ruột và các loại vi sinh vật gây bệnh khác, các loại trứng giun sán. Những vi sinh vật gây bệnh đó chỉ sống trong nớc một thời gian nhất định nhng nguồn nớc thải lại đợc đổ vào thờng xuyên nên lúc nào chúng cũng có mặt. Trong thành phần ô nhiễm của nớc thải loại này có chứa hàm lợng lớn các hợp chất chứa N (hay hợp chất hữu cơ đã đợc vi sinh vật khoáng hoá thành NH 3 tan trong nớc ở dạng NH 4 + sau đó sẽ chuyển hoá thành NO 2 - và NO 3 - ) có độc tính cao đối với hệ thuỷ sinh, động thực vật và con ngời. Nếu nớc chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ chứa N, NH 3 hay NH 4 OH thì chứng tỏ nớc mới bị ô nhiễm. NH 3 trong nớc sẽ gây độc đối với cá và các sinh vật khác trong nớc. NH 3 hay NH 4 + có trong nớc cùng với phốtphát thúc đẩy quá trình phú dỡng của nớc. Tính độc của NH 3 cao hơn NH 4 + . Với nồng độ 0,01mg/l đã gây độc cấp tính. NH 4 + lại là hợp chất dinh dỡng rất thích hợp đối với vi sinh vật, tảo và thực vật thủy sinh. Nếu trong nớc chứa chủ yếu là nitrit (NO 2 - ) là nớc đã bị ô nhiễm một thời gian dài hơn. Nitrit là hợp chất có hại trực tiếp đến con ngời (đặc biệt đối với phụ nữ và trẻ em) và là tiền chất của một số sản phẩm có khả năng gây 4 Khoá luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học - Sinh viên Tống Thị Minh Thuyết ung th. Nếu nớc chứa chủ yếu là hợp chất nitơ ở dạng nitrat (NO 3 - ) chứng tỏ quá trình phân huỷ đã kết thúc [9]. Nh vậy, vấn đề đặt ra là ở chỗ việc chuyển hoá các hợp chất N kia ra sao? Vai trò của vi sinh vật chuyển hoá các hợp chất N đó trong các thuỷ vực đó nh thế nào? Và nếu phân lập đợc chúng thì sẽ góp phần gì vào việc xử lý nớc thải bằng biện pháp sinh học? Vì vậy khi đề cập tới nớc thải sinh hoạt, chúng tôi lựa chọn đề tài "Bớc đầu nghiên cứu vi khuẩn nitrat hoá trong hồ chứa nớc thải chợ Vinh - Nghệ An". Mục đích của đề tài là: nghiên cứu mức độ ô nhiễm nớc nói chung và mức độ ô nhiễm bởi các loại hợp chất chứa N nói riêng thông qua xác định các chỉ tiêu về coliform cũng nh chỉ tiêu về NH 4 + và sự có mặt của vi khuẩn nitrat hoá trong hồ. 5 Khoá luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học - Sinh viên Tống Thị Minh Thuyết Chơng I: Tổng quan tài liệu I.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn nitrat hoá Vi khuẩn nitrat hoá là những vi sinh vật tự dỡng hoá học bắt buộc. Điều này có nghĩa là chúng sử dụng muối vô cơ nh là nguồn năng lợng và nói chung không sử dụng chất hữu cơ. Chúng phải oxi hoá amoni và nitrit cho nhu cầu năng lợng của chúng và cố định CO 2 cho nhu cầu cacbon. Chúng không có khả năng di động và phải bám vào bề mặt (sỏi, cát, môi trờng sinh vật tổng hợp ) cho sự sinh trởng tối u của chúng. Chúng tiết ra chất nhầy dính để chúng sử dụng kết dính chung với nhau [10] . Vi khuẩn nitrat hoá gồm 2 nhóm [1]: - Nhóm vi khuẩn nitrit hoá bao gồm : + Nitrosomonas + Nitrozocystic + Nitrosolobus + Nitrosospira +Nitrosococcus - Nhóm nitrat hoá gồm : + Nitrobacter winogratskyi +N.agilis + Nitrospnra gracilis + Nitrococus mobilis Vi khuẩn nitrat có thời gian thế hệ dài bởi nguồn năng lợng thấp nhận từ các phản ứng oxi hoá. Từ khi năng lợng đợc sản sinh từ những phản ứng này thì chúng thực hiện việc chuyển hoá amoni và nitrit. Hầu hết sản phẩm năng lợng của chúng (80%) đợc sử dụng để cố định CO 2 qua chu trình Calvin và một ít năng lợng dùng duy trì sự sinh trởng và sinh sản. Nh là một hệ quả, chúng có một tốc độ sinh sản rất chậm [17]. 6 Khoá luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học - Sinh viên Tống Thị Minh Thuyết Vi khuẩn nitrat có hình thức sinh sản theo lối phân chia nguyên phân. Trong điều kiện tối u, Nitrosomosas có thể nhân đôi 7h/lần. Nitrobacter là 13h/lần. Trong điều kiện thông thờng là 15-20h/thế hệ. Đây là thời gian vô cùng dài nếu so với vi khuẩn dị dỡng là 20 phút/thế hệ. Thời gian mà 1 tế bào Nitrosomonas đợc nhân đôi trong quần thể thì một tế bào E. coli đã sinh ra một quần thể với 35 tỷ tế bào [17 ]. Các loài Nitrosomonas và Nitrobacter là vi khuẩn gram âm hầu hết hình que, chiều dài khoảng 0,4- 0,6 micromet. Chúng là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc và không thể nhân lên hay chuyển hoá amoni và nitrit trong điều kiện thiếu oxi [ 17 ]. 7 Hình dạng tế bào vi khuẩn Nitrobacter Khoá luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học - Sinh viên Tống Thị Minh Thuyết Không có loài nào trong họ Nitrobacteriaceac có thể sinh bào tử. Chúng có một thành tế bào phức tạp bao phủ bởi chất nhầy.Không giống các loài vi khuẩn dị dỡng khác, chúng không thể sống sót và thực hiện làm khô mà không giết chết sinh vật. Trong nớc, chúng có thể sống sót với thời gian ngắn trong điều kiện bất lợi bằng cách sử dụng các chất dự trữ bên trong tế bào. Khi các chất này hết thì chúng sẽ chết [17]. Những vi khuẩn nitrit hoá thì khác nhau cả về hình dạng, kích thớc, màu sắc của khuẩn lạc cũng nh của tế bào. Khuẩn lạc của chúng thờng nhỏ bé (đờng kính 0,2 - 1,2mm). Tế bào của nó là những tế bào Gram âm, có dạng hình que hay hình quả lê nhỏ với kích thớc khác nhau rộng 0,2 - 0,4àm, dài 0,5-0,8àm [7]. Trên môi trờng đặc chủng của vi khuẩn nitrat hoá thì tế bào của chúng có hình quả lê, kích thớc rộng 0,6-0,8àm; dài 0,8-1 àm, không sinh bào tử và Gram âm [7]. Đặc biệt thờng gặp nhất vẫn là 2 loại vi khuẩn Nitrosomonas và vi khuẩn Nitrobacter bởi vì chúng thờng sống chung và hỗ trợ nhau trong đất. Vì khi nồng độ NH 3 cao trong môi trờng kiềm có hại cho Nitrobacter , nhng nhờ Nitrosomonas sử dụng NH 3 và biến nó thành axit tạo điều kiện cho sự phát triển của Nitrobacter [3]. Một số loài của 2 giống trên có thể tìm thấy trong nớc mặn, nớc ngọt và những loài khác có thể tìm thấy ở cạn, một số loài ở trong các sinh cảnh khác. Những vị trí nơi mà các quần thể Nitrosomonas và Nitrobacter thờng tập trung nhiều là ở các hệ thống nớc thải hoặc nằm ở 10cm phía trên bề mặt lắng đọng của các con sông nơi mà nồng độ amoni từ các sản phẩm thải cao nhất [14]. Vi khuẩn Nitrosomonas đợc tìm thấy khắp cả hệ sinh thái trên Trái đất lẫn dới nớc. Vi khuẩn này hình thành thuộc địa ở bất kỳ chỗ nào nếu trên đó có đủ lợng amoniac và oxy. Nitrit là sản phẩm phụ đợc sản sinh bởi Nitrosomonas và chúng khá độc cho cá sống trong nớc. Nitrobacter ăn nitrit do đó chúng sản 8 Khoá luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học - Sinh viên Tống Thị Minh Thuyết sinh gần nitrat. Nitrosomonas và Nitrobacter đợc gọi là vi khuẩn lithotrophic. Chúng thích sống bám trên bề mặt những vật liệu cứng. Tế bào vi khuẩn nitrat có màu hơi đỏ (Nitrosomonas) đến màu hơi nâu (Nitrobacter). Những gì mà chúng ta thấy khi quan sát dịch nuôi tế bào vi khuẩn đó là màu tự nhiên của vi khuẩn, là những cục vón của vi khuẩn dính nhau nhờ chất nhầy của chúng hoà lẫn màu dung dịch sử dụng duy trì sự sống của chúng. Thỉnh thoảng, dung dịch có thể đổi thành nâu tối hoặc đen và mùi trứng thối. Hiện tợng này là hiếm chứ không phải là không bình thờng. Nguyên nhân là do sự có mặt của sunfat d đã suy giảm thành sunphit [17]. I.2. Sự ảnh hởng của một số yếu tố sinh thái đến sinh trởng và phát triển của vi khuẩn nitrat hoá Nhìn chung, hầu hết các thông tin có thể ứng dụng cho các loài Nitrosomonas và Nitrobacter. Tuy nhiên mỗi chủng có một sức chịu đựng riêng biệt đối với các yếu tố môi trờng. Tất cả các loài đều có giới hạn chịu đựng hạn chế và đặc biệt mẫn cảm với pH, nồng độ oxi hoà tan, nồng độ muối, nhiệt độ và các chất hoá học gây ức chế [17]. 2.1. Nhiệt độ Nhiệt độ tối u cho sự sinh trởng của vi khuẩn nitrat hoá nằm trong khoảng 25-30 0 C . ở 18 0 C tốc độ sinh trởng bị suy giảm 50% . Nếu nhiệt độ là 46-50 0 F thì tốc độ sinh trởng bị suy giảm 70%. Còn khi môi trờng xuống tới 39 0 F (4 0 C) thì sẽ không có hoạt động gì xảy ra và vi khuẩn nitrat hoá sẽ chết ở nhiệt độ O 0 C (32 0 F), ngay cả khi nhiệt độ môi trờng lên tới 120 0 F (49 0 C) thì vi khuẩn nitrat hoá cũng sẽ chết [17]. Trong đó vi khuẩn Nitrobacter chịu đựng nhiệt độ thấp kém hơn so với Nitrosomonas . Vì vậy trong hệ thống nớc lạnh, cần quan tâm đến việc kiểm tra sự tích luỹ nitrit [17]. Nh vậy, các vi sinh vật này có thể sinh trởng ngoài tự nhiên cả về mùa đông lẫn mùa hè. Tuy nhiên điều kiện nhiệt độ về mùa hè có thuận lợi hơn. Đây 9 Khoá luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học - Sinh viên Tống Thị Minh Thuyết cũng là một đặc điểm cần chú trọng khi sử dụng chúng cố định lên màng lọc sinh học xử lý nớc thải [10]. 2.2. pH Khả năng phát triển của chúng trong khoảng pH từ 4-10 . Song pH thích hợp nhất đối với Nitrosomonas là 7,8 - 8,0. Còn pH thích hợp cho sự sinh trởng của Nitrobacter là 7,3-7,5 . Nitrobacter sẽ phát triển một cách chậm chạp ở pH cao còn ở pH dới 7,0 thì Nitrosomonas sẽ bị ngăn cản. Quá trình nitrat hoá cũng sẽ bị cản trở nếu pH xuống 6,0 hay thấp hơn. Vì vậy cần giám sát quá trình phân huỷ amoni khi pH xuống 6,5 bởi ở pH này sự có mặt của hợp chất amoni gây độc nhẹ do sự hiện diện của ion NH 4 + [17]. 2.3. Oxi hoà tan (DO) Tốc độ nitrat hoá tối đa nếu DO đạt đợc 80% của sự bão hoà. Quá trình nitrat hoá sẽ không xảy ra nếu nồng độ DO giảm xuống 2mg/l hoặc thấp hơn. Nitrobacter bị tác động mạnh bởi DO thấp hơn là Nitrosomonas [17]. 2.4. Dinh dỡng Tất cả các loài Nitrosomonas sử dụng NH 3 nh là nguồn năng lợng trong suốt quá trình chuyển hoá của nó thành NO 2 - . Amoni đầu tiên đợc chuyển thành NH 2 và sau đó oxi hoá thành nitrit. Quá trình chuyển hoá này cho phép Nitrosomonas sử dụng một ít hợp chất amin đơn giản nh là sự tạo ra bởi năng lợng chuyển hoá amoni bằng cách loại bỏ amoni hoá học. Một ít chủng Nitrosomonas cũng có thể sử dụng urea nh là nguồn năng lợng. Tât cả các loài Nitrobacter sử dụng nitrit làm nguồn năng lợng trong việc oxi hoá chúng thành nitrat [17]. 10 . Trờng Đại học Vinh Khoa Sinh học Tống Thị Minh Thuyết Bớc đầu nghiên cứu vi khuẩn nitrat hoá trong hồ chứa nớc thải chợ Vinh Nghệ An khoá luận tốt nghiệp. khuẩn nitrat hoá (Nitrifying Bacteria) trong nớc của hồ chứa nớc thải chợ Vinh - Nghệ An. II.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu