Phân lập tuyển chọn và bước đầu đánh giá hiệu quả sử dụng chế phẩm nấm vùng rễ trên một số cây nông nghiệp

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  NGUYỄN ĐÌNH LUYỆN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ BƢỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG CHẾ PHẨM NẤM VÙNG RỄ TRÊN MỘT SỐ CÂY NÔNG NGHIỆP LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC  Hà nội, 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Mai Hương tận tình bảo, hướng cho tơi phương pháp luận vô giá trị để tơi có định hướng cho luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn TS Trần Thị Như Hằng chủ nhiệm đề tài nghị định thư Việt nam – Hungary tạo điều kiện cho đào tạo nước ngồi giúp tơi nâng cao kiến thức nội dung luận văn tốt Tôi xin cảm ơn GS Katalin Posta cộng sự.,trường Đại học quốc tế Szen Isvam, Cộng hòa Hungary Đã giúp đỡ học kỹ thuật phân lập sinh học phân tử để hoàn thành kết luận văn Tôi xin cảm ơn anh chị, bạn bè đồng nghiệp phòng sinh học thực nghiệm Viện Hóa học hợp chất Thiên nhiên tạo điều kiện công việc, thời gian giúp tơi hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện sinh thái Tài nguyên sinh vật, phòng đào tạo thầy cô giáo sở đào tạo sau đại học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập Viện Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ln động viên, khuyến khích để tơi hồn thành luận văn này./ Hà nội, ngày tháng năm 2013 Tác giả luận văn Nguyễn Đình Luyện Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học tơi tập thể phòng sinh học thực nghiệm Các số liệu đƣợc sử dụng tham khảo có nguồn gốc trích dẫn rõ ràng, kết luận văn hoàn toàn trung thực Nguyễn Đình Luyện Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Al Nhôm AM Arbuscular mycorrhizza CĐTHN Cƣờng độ thoát nƣớc CPU Colony Forming Unit – Đơn vị hình thành khuẩn lạc ĐDKK Độ dẫn khí khổng EM Ectomycorrhiza Fe Sắt IAA Indole-3-acctic acid MT Môi trƣờng N Nitơ P photpho SPAD Hàm lƣợng diệp lục TCA Trichloacetic acid (axit tricloaxetic) VAM Vesicular-Arbuscular mycorrhizza VSV Vi sinh vật VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ PHỤ LỤC Mở Đầu……………………………………………………………………….1 1.1 ĐẠI CƢƠNG VỀ NẤM CỘNG SINH VÙNG RỄ 1.2 PHÂN LOẠI NẤM VÙNG RỄ 1.2.1 Nấm ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza (EM) 1.2.2 Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhizal, AM) 1.2.3 Các loại nấm rễ khác 1.3 SINH HỌC VÀ SINH THÁI HỌC NẤM VÙNG RỄ 1.3.1 Sự hình thành nấm cộng sinh vùng rễ 1.3.2 Tính chun hóa nấm cộng sinh vùng rễ 11 1.4 VAI TRÒ NẤM CỘNG SINH VÙNG RỄ 12 1.4.1 Tăng khả hấp thụ P dinh dƣỡng chủ 12 1.4.2 Hình thành chất kích thích sinh trƣởng 13 1.4.3 Nâng cao sức chống chịu thích nghi với mơi trƣờng trồng 13 1.4.4 Cải thiện môi trƣờng xung quanh 14 1.4.5 Tăng khả kháng bệnh trồng 15 1.5 NHỮNG NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG NẤM CỘNG SINH VÙNG RỄ 15 1.5.1 Trên giới 15 1.5.2 Ở Việt Nam 18 1.6 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT NƠNG NGHIỆP Ở VIỆT NAM 20 CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP……………………………………………………….21 2.1 NGUYÊN LIỆU 23 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 23 2.1.2 Hóa chất thiết bị thí nghiệm 23 2.1.2.1 Hóa chất 23 2.1.2.2 Thiết bị thí nghiệm 23 2.1.3 Môi Trƣờng 23 2.1.3.1 Môi trường phân lập nấm vùng rễ 23 2.1.3.2 Môi trường nuôi cấy, lên men giữ giống 24 2.1.3.3 Mơi trường thử hoạt tính enzyme 24 2.1.3.4 Môi trường đánh giá khả kích thích sinh trưởng 24 2.1.4 Các dung dịch nhuộm 25 2.1.4.1 Dung dịch nhuộm rễ 25 2.1.4.2 Dung dịch nhuộm bào tử 25 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.2.1 Phân lập nấm vùng rễ 25 2.2.1.1 Phương pháp thu thập mẫu: 25 2.2.1.2 Phương pháp phân lập bào tử AM 25 2.2.1.3 Phương pháp phân lập chủng nấm vùng rễ (EM) 26 2.2.2 Phƣơng pháp phân loại hình thái sinh học phân tử 26 2.2.2.1 Phân loại chủng nấm AM 26 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.2.2.2 Phân loại chủng nấm EM 27 2.2.3 Tuyển chọn chủng nấm hữu hiệu để sản xuất chế phẩm thử nghiệm 28 2.2.3.1 Phương pháp thử hoạt tính enzyme phosphataza nấm vùng rễ (EM) 28 2.2.3.2 Phương pháp định lượng khả phân giải phốt phát khó tan 28 2.2.3.3 Xác định khả kích thích sinh trưởng thực vật chủng nấm vùng rễ 29 2.2.3.4 Xác định khả đối kháng chủng nấm vùng rễ 29 2.2.3.5 Kiểm tra tính an tồn chủng nấm lựa chọn 29 2.2.4 Tạo chế phẩm thử nghiệm quy mơ phịng thí nghiệm 30 2.2.4.1 Lên mem chủng nấm lựa chọn tạo sinh khối vi sinh vật 30 2.2.4.2 Quy trình phối trộn tạo chế phẩm quy mơ phịng thí nghiệm 31 2.2.4.3 Kiểm tra mật độ vi sinh chế phẩm theo thời gian 31 2.2.5 Thử nghiệm chế phẩm 32 2.2.5.1 Thử nghiệm chế phẩm lúa 32 2.2.5.2 Thử nghiệm chế phẩm cà chua 32 2.2.5.3 Thử nghiệm khoai tây 33 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………………………………… 33 3.1 THU THẬP MẪU 35 3.2 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH TÊN CÁC CHỦNG NẤM RỄ 35 3.3 PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM RỄ (EM) TỪ CÁC MẪU RỄ CÂY 40 3.4 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ENZYME NGOẠI BÀO CÁC CHỦNG NẤM (EM) 40 3.4.1 Hoạt tính enzyme chủng nấm vùng rễ (EM) 41 3.4.2 Định lƣợng khả phân giải phốt phát khó tan 42 3.4.3 Đánh giá khả sinh tổng hợp indolacetic axit (IAA) thô chủng nấm 43 3.4.4 Xác định khả đối kháng chủng nấm vùng rễ 44 3.4.5 Kiểm tra độ an toàn chủng nấm lựa chọn 44 3.4.6 Định tên phân loại số chủng nấm vùng rễ lựa chọn tạo chế phẩm thử nghiệm 45 3.4.7 Nghiên cứu điều kiện lên men tạo chế phẩm thử nghiệm 53 3.4.7.1 Ảnh hưởng môi trường lên men 53 3.4.7.2 Ảnh hưởng pH môi trường lên men 54 3.4.7.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 54 3.4.7.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi 55 3.4.8 Tạo chế phẩm thử nghiệm 56 3.4.9 Thử nghiệm chế phẩm 57 3.4.9.1 Thử nghiệm lúa……………………………………… .55 3.4.9.2 Thử nghiệm cà chua 63 3.4.9.3 Thử nghiệm Khoai tây 67 KẾT LUẬN 71 KIẾN NGHỊ 72 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN LUẬN VĂN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ PHỤ LỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh nấm rễ ngoại cộng sinh Hình 1.2 Hình ảnh nấm rễ nội cộng sinh Hình 3.1 Số lƣợng bào tử AM tổng số 1g đất phân lập đƣợc 36 Hình 3.2 Hình ảnh bào tử phân lập đƣợc dƣới kính hiển vi điện tử 36 Hình 3.3 Hình ảnh khả cộng sinh bào tử AM sau nhân nuôi bảo tồn Mã đề Ribwort 37 Hình 3.4 Khả sinh tổng hợp IAA thơ phân giải phốt phát khó tan chủng nấm lựa chọn 44 Hình 3.5 Hình ảnh khuẩn lạc bào tử chủng NR1 46 Hình 3.6 Ảnh hiển vi Penicillium vermiculatum NR4 47 Hình 3.7 Ảnh hiển vi Penicillium levitum NR5 48 Hình 3.8 Ảnh cuống sinh bào tử, bào tử (trái) thể (ảnh phải) chủng NR7 49 Hình 3.9 Khuẩn lạc quan sinh sản chủng NR8 50 Hình 3.10 Khuẩn lạc quan sinh sản chủng NR11 51 Hình 3.11 Khuẩn lạc quan sinh bào tử chủng NR12 52 Hình 3.12 Ảnh hiển vi Trichoderma konilangbra NR13 53 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ PHỤ LỤC BẢNG Bảng 3.1 Số lƣợng bào tử AM tổng số /1g đất phân lập 35 Bảng 3.2 Bảng mô tả hình thái số bào tử nấm rễ 37 Bảng 3.3: Định tên số bào tử nấm rễ 39 Bảng 3.4 Đánh giá hoạt tính enzyme phosphatase 41 Bảng 3.5 Khả phân giải phốt phát chủng nấm lựa chọn 42 Bảng 3.6 Khả sinh tổng hợp IAA thô chủng nấm 43 Bảng 3.7 Khả đối kháng chủng lựa chọn 44 Bảng 3.8 Kết đánh giá độ an toàn chủng lựa chọn 45 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi đến sinh trƣởng phát triển chủng nấm 53 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy đến sinh trƣởng phát triển chủng nấm 54 Bảng 3.11 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng phát triển chủng nấm 54 Bảng 3.12 Ảnh hƣởng thời gian nuôi đến sinh trƣởng phát triển chủng nấm 55 Bảng 3.13 Mật độ vi sinh chế phẩm thời gian khác 57 Bảng 3.14 Ảnh hƣởng chế phẩm nấm tới diện tích giống lúa KD18 (dm2/cây) 58 Bảng 3.15 Ảnh hƣởng chế phẩm nấm tới khối lƣợng rễ khô giống KD18 (g/cây) 59 Bảng 3.16 Ảnh hƣởng chế phẩm nấm tới khối lƣợng khơ tồn giống lúa KD18 60 Bảng 3.17 Ảnh hƣởng chế phẩm nấm tới suất yếu tố cấu thành suất giống lúa KD18 61 Bảng 3.18 Ảnh hƣởng chế phẩm nấm tới hàm lƣợng đạm, lân kali đất (mg/100g đất) 62 Bảng 3.19 Ảnh hƣởng nấm rễ với lƣợng lân bón khác đến động thái tăng trƣởng chiều cao thân cà chua (đơn vị tính: cm) 64 Bảng 3.20 Ảnh hƣởng chế phẩm nấm đến sinh khối khô cà chua 65 Bảng 3.21 Ảnh hƣởng chế phẩm nấm đến khả hoa đậu suất cà chua Savior 66 Bảng 3.22 Ảnh hƣởng chế phẩm nấm tới kích thƣớc cà chua 66 Bảng 3.23 Ảnh hƣởng chế phẩm nấm đến chiều dài thân số thân qua tuần theo dõi 68 Bảng 3.24 Ảnh hƣởng chế phẩm nấm rễ đến khối lƣợng chất khô qua giai đoạn sinh trƣởng 68 Bảng 3.25 Ảnh hƣởng loại chế phẩm nấm rễ đến yếu tố cấu thành suất suất 69 Bảng 3.26 Ảnh hƣởng loại chế phẩm nấm rễ đến kích thƣớc củ lúc thu hoạch (%) 69 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ năm 2004-2005”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nông Lâm Nghiệp (1&2), tr 82-87 TIẾNG ANH Aanen D.K (2006), “As you reap, so shall you sow: coupling of harvesting and inoculating stabilizes the mutualism between termites and fungi” Biol Lett, 2, pp 209-212 10 Bi Guochang, Zang Mu, Guo Xiuzhen (1989), “Distribution of ectomycorrhizal fungi under several chief forest types in alpine coniferou region of northwestern yunnan”, Scientia Silvae Sinicae, 25(1), pp 33-39 11 Cathy L Cripps and Leslie H Eddington (2005) Distribution of Mycorrhizal Types among Alpine Vascular Plant Families on the Beartooth Plateau, Rocky Mountains, U.S.A., in Reference to Large-Scale Patterns in Arctic– Alpine Habitats Arctic, Antarctic, and Alpine Research, 37, (2), 2005, pp 177–188 12 Douds D.D., and Millner P.D., (1999) “Biodiversity of arbuscular mycorrhizal fungi in agroecosystems” Agr Eco Env, 74, pp 77-99 13 Gardes, M and Dahlberg, A., 1996: Mycorrhizal diversity in arctic and alpine tundra: an open question New Phytologist, 133:pp 147–157 14 Gerdemann , J W and T H Nicolson T H , (1963), “Spores of mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet-sieving and decanting”, Trans Br Mycol Soc, 46, pp 235-244 15 - , C., D’Haen, J., Vangronsveld, J., Dodd, J.C., (2002) “Coper sorption and accumulation by the extraradical mycelium ofdifferent Glomus spp (arbuscular mycorrhizal fungi) isolated from the same polluted soil” Plant and Soil 240, pp 287 – 297 16 Grenville D J., Piché Y., Peterson R L (1985), “Sclerotia as viable sources of mycelia for the establishment of ectomycorrhizae”, Canadian Journal of Microbiology, 31, pp 1085-1088 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 17 Guhardja E., “Rainforest ecosystems of East Kalimantan” (2000), Springer, pp 1130-1154 18 Gupta, P.K., (2000), “Soil, plant, water and fertilizer analysis” Vedems eBooks (P)Ltd(India), chapter 13, pp 246-255 19 Harvey, Linda M (1991) “Cultural Techniques for Production of Ectomycorrhizal Fungi” Biotechnology Advances, 9, pp.12-29 20 Harvey, Linda M., (1991) “Cultural Techniques for Production of Ectomycorrhizal Fungi” Biotechnology Advances Vol 9, p.12-29 21 Haselwandter, K and Winkelmann, G., Siderophores of Mycorrhizal fungi (2009) “Detection, Isolation and identification” Soil Biology, 18, pp 393402 22 James M Trappe (2010), “Fungus associates of ectotrophic mycorrhizae”, Botanical Review, pp 538-606 23 Jan-Erik Nylund (1978), “The ectomycorrhizal infection zone and its relation to acid polysaccharides of cortical cell walls”, New Phytologist, 106, pp 505516 24 Mei-ling XU, Jiao-jun ZHU, Hong-zhang KANG, Jin-xin Zhang, Feng-qin Li (2008), “Optimun conditions for pure culture of major ectomycorrhizal fungi obtained from Pinus Sylvestris var Mongolica plantation in southeastern Keerpin sandy lands, China”, Journal of Forestry Research, Springer, pp 113-118 25 Nzanza B., Marais D., Soundy P (2012), “Effect of arbuscular mycorrhizal fungal inoculation and biochar amendment on growth and yield of tomato” Int J Agric Biol, 14, pp 965–969 26 Oehl F., Sieverding E., Ineichen K., Ris E.A., Boller T., Wiemken A., (2005).“Community structure of arbuscular mycorrhizal fungi at different soil depths in extensively an intensively managed agroecosystems” New Phytol 165, pp.273-283 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 27 Rai M.K., Acharya D., Varma A., Chikhale N.J., Wadegaonkar P.A, Thakare P.V., Ramteke A.P., Kirpan P., Shende S (2001) “Arbuscular mycorrhizal fungi in growth promotional of medicinal plants” National Workshop on conservation of medicinal aromatic plants held at CFHRD Procedings, pp 105-110 28 Rai M.K., Varma A (2005) ”Arbuscular mycorrhiza like biotechnological potential of piriformospora indica, which promotes the growth of Adhatpda vasica Nees” Elect J Biotechnol Chile, 8, pp 107-112 29 Redecker D, Schüßler A, Stockinger H, Stürmer SL, Morton JB, Walker C (2013), “An evidence-based consensus for the classification of arbuscular mycorrhizal fungi (Glomeromycota)”, Mycorrhiza, DOI: 10.1007/s00572013-0486-y 30 Redecker, D., (2000).“Specific PCR primers to identify arbuscular mycorrhizal fungi within colonized roots“ Mycorrhiza, 10, pp 73-80 31 Redecker, D., Hijri, I., Wiemken, A., (2003) “Molecular identification of arbuscular mycorrhizal fungi in roots: Perspectives and problems“ Folia Geobotanica 38, pp 113-124 32 RT Koide., (2004) Mycorrhizal symbioses In Encyclopedia of Plant and Crop Science, pp 770-772 33 Russell J., Rodriguez Regina S Redman Joan M Henson (2005), “Symbiotic Lifestyle Expression by Fungal Endophytes and the Adaptation of Plants to Stress: Unraveling the Complexities of Intimacy”, Taylor & Francis Group, LLC 34, pp 683-695 34 S.E Smith and D.J Read (1997), “Mycorrhizal Symbiosis” (2nd Edition) Academic Press: London, UK, 2, pp 605 35 Salvioli A., Novero M., Lacourt I., Bonfante P (2008) “The impact of mycorrhizal symbiosis on tomato fruit quality” 16th IFOAM Organic World Congress, Modena, Italy, June 16-20, 2008 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 36 Salvioli A., Zouari I., Chalot M., Bonfante P., (2012) “The arbuscular mycorrhizal status has an impact on the transcriptome profile and amino acid composition of tomato fruit” BMC Plant Biology, 12, pp 44 37 Schwarzott, D., Schussler, A., (2001).“A simple and reliable method for SSU rRNA gene DNA extraction, amplification, and cloning from single AM fungal spores“ Mycorrhiza 10, pp 203-207 38 Sylvie Crannenbrouck, (2010) “Arbuscular mycorrhizal fungi, Description, Classification and Idenfitication” Universitieit Gent, 1th April 2010 39.Turmel M.S.,(2004) “Exposing the Mycorrhizaes in Agriculture” University of Manitoba, Winnipeg, MB R3T 2N2 40 Vestberg M., Saari K., Kukkonen S., Hurme T., (2005) ”Mycotrophy of crops in rotation and soil amendment with peat influence the abundance and effectiveness of indigenous arbuscular mycorrhizal fungi in field soil” Mycorrhiza 15(6), pp 447-458 41 Yu TEJ-C, Egger KN, Peterson RL (2001) “Ectendomycorrhizal associations characteristics and functions” Mycorrhiza, 11:167–177 TÀI LIỆU WEBSIDE 42 httf://invam.caf.wvu.edu/index.html 43 httf://mycorrhizas.info/vam.html 44 http://www.vast.ac.vn/tin-tuc-su-kien/tin-khoa-hoc/quoc-te Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ PHỤ LỤC PHỤ LỤC Trình tự rDNA vùng ITS phân loại chủng nấm lựa chọn Trình tự gen rDNA đoạn ITS phân loại chủng NR01: CTTTGGCGGGCCCACCGGGGCCACCTGGTCGCCGGGGGACGCACGTCCC CGGGCCCGCGCCCGCCGAAGCGCGCTGTGAACCCTGATGAAGATGGGC TGTCTGAGTACTATGAAAATTGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTG GTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAA TTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCC TGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTGCCCTCAAGC ACGGCTTGTGTGTTGGGTGTGGTCCCCCCGGGGACCTGCCCGAAAGGCA GCGGCGACGTCCGTCTGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACTCGCT CGGGAAGGACCTGCGGGGGTTGGTCACCACCACATTTTACCACGGTTGA CCTCGGATCAGGTAGGAGTTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGC GGAGGAAAAGAAACCAACCGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGC GGCAAGAGCTCAAATTTGAAATCTGGCCCCTTTGGGGTCCGAGTTGTA Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 95 0.02 Penicillium funiculosum JN899377 Talaromyces flavus JN899395 65 NR01 Penicillium crateriforme JN899373 Talaromyces macrosporus JN899333 Penicillium victoriae JN899393 53 Talaromyces galapagensis JN899358 Penicillium korosum JN899347 98Penicillium pinophilum JN899382 Penicillium siamense JN899385 88 Penicillium purpurogenum JN899316 Penicillium verruculosum JN899367 Penicillium aculeatum JN899389 90 Penicillium aureocephalum JN899392 Penicillium marneffei JN899344 50 Penicillium calidicanium JN8993 Talaromyces derxii JN899327 94 Penicillium duclauxii JN899342 Talaromyces helicus AB176623 Penicillium pseudostromaticum JN899371 Penicillium erythromellis HQ1493 100 Penicillium rubrum JN899313 Talaromyces assiutensis JN89932 Talaromyces ohiensis JN899355 Talaromyces udagawae JN899350 98 Penicillium minioluteum GU396544 Penicillium purpurogenumJN899381.1| 100 Penicillium samsonii JN899369 Fennellia nivea EF669610 Cây phát sinh chủng loại chủng NR01 với lồi có mối quan hệ họ hàng gần dựa vào phân tích trình tự vùng gen ITS Fennellia nivea EF669610 làm nhóm ngồi Trình tự rDNA vùng ITS phân loại chủng NR07: GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACCGGGATTGCCTC AGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAATCTGGCCCC TTTGGGGTCCGAGTTGTAATTTGCAGAGGATGCTTCGGGTGCGGTCCCC GTCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTCTG GGATGGGCGGCCGCGCCCGTGTGAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTT TGGGAATGCAGCTCTAAGCGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATAC TGGCCGGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAG CACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAG CGTTGTCCACCAGACTCGCCCGGGGGGGTTCAGCCGGCACGTGTGCCGG TGTACTCCTCTCCGGGCGGGCCAGCATCGGTTTGGGCGGCTGGTGAAAG GCCCCGGGAATGTAACACCCTTCGGGGTGCCTTATAGCCCGGGGTGCCA TACAGCCAGCC Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Cây chủng loại phát sinh chủng NR07 loài có mối quan hệ họ hàng gần dựa vào phân tích trình tự gen ITS, Fennellia nivea làm nhóm ngồi Trình tự rDNA vùng ITS phân loại chủng NR08: AAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAG AGCTCAAATTTGAAAGCTGGCCCCCTCGGGGTCCGCGTTGTAATTTGCA GAGGATGCTTCGGGAGCGGCCCCCGTCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGT CATAGAGGGTGAGAATCCCGTATGGGATGGGGTGCCCGCGCCCGTGTG AAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGT GGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATATTGGCCGGAGACCGATAGCGCACA AGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACA GCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGACCAGACTCGCCCGC GGGGTTCAGCCGGCACTCGTGCCGGTGTACTTCCCCGCGGGCGGGCCAG CGTCGGTTTGGGCGGCCGGTCAAAGGCCCCTGGAAGGTAACGCCCCCCC GGGGGCGTCTTATAGC Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 0.01 Eupenicillium idahoense EF626955 Eupenicillium tularense ETU15469 Penicillium isariiforme AF454077 Penicillium malacaense EU427300 Eupenicillium cinnamopurpureum AY213698 Penicillium pusillum EF626951 Eupenicillium cinnamopurpureum EF422843 Eupenicillium inusitatum AF033431 Eupenicillium anatolicum AF033425 Penicillium decaturense AY313615 89 82 52 Penicillium paxilli EU427293 Penicillium alicantinum EU427299 Penicillium citrinum Eupenicillium ochrosalmoneum EF626960 100 NR08 Eupenicillium parvum AF033460 Aspergillus viridinutans EF661280 Cây chủng loại phát sinh chủng NR08 lồi có mối quan hệ họ hàng gần dựa vào phân tích trình tự gen ITS, Aspergillus viridinutans làm nhóm ngồi Trình tự gen rDNA đoạn ITS phân loại chủng NR11: GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACCGGGATTGCCTCAGTA ACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAAGCTGGCTCCTTCG GGGTCCGCATTGTAATTTGCAGAGGATGCTTCGGGTGCAGCCCCCGTCT AAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTATGGGG CGGGGTGTCTGCGTCCGTGTGAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTG GGAATGCAGCTCTAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATACTG GCCGGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCA CTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCG CTTGCAACCAGACTCGCTCGCGGGGTTCAGCCGGGCTTCGGCCCGGTGT Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ACTTCCCCGCGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGCCGGTCAAAGGCC TCCGGAATGTAGCGCCCTTCGGGGCGCCTTATAGCCGGGGGTGCAATGC GGCCAGCCTGGACCGAGGAACGCGCTTCGGCACGTGTGATGACAGCTG CGAGTGCGTGTT Cây phát sinh chủng loại NR11 với lồi có mối quan hệ họ hàng gần, đƣợc xây dựng dựa vào trình tự gen ITS; Talaromyces flavus EU021596 làm nhóm ngồi Trình tự gen rDNA 28S đoạn D1D2 chủng NR12 GCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACA GGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGA AAGCTGGCCCCTTCGGGGTCCGCGTTGTAATTTGCAGAGGATGCTTCGG GTGCAGCCCCCGTCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCATAGAGGGTGA GAATCCCGTCTGGGACGGGGTGTCTGCGTCCGTGTGAAGCTCCTTCGAC GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGTGGTAAATTTCATC TAAAGCTAAATACTGGCCGGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATC Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ GAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACGTGAAATT GTTGAAAGGGAAGCGTTTGCGACCAGACTCGCCCGCGGGGTTCAGCCG GCATTCGTGCCGGTGTACTTCCCCGTGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGG CGGCCGGTCAAAGGCCCTCGGAATGTATCACCTCTCGGGGTGTCTTATA GCCGAGGGTGCAATGCGGCCTGCCTGGACCGAGGAACGCGCTTCGGCT CGGACGCTGGCGTAATGGTCGTAAATGACCCGTC 0.02 Aspergillus arenarius EU021615 Aspergillus bombycis AF104444 90 Aspergillus thomi AF027896 100 Aspergillus flavus AF027863 67 Aspergillus campestris EF669577 100 Aspergillus candidus EF669592 99 Aspergillus microcysticus EF669607 Aspergillus ambiguous EF669606 97 Aspergillus carneus EF669611 100 Aspergillus terreus EF669587 Aspergillus brunneo-uniseriatus EF652141 Aspergillus aureofulgens EF669617 98 Aspergillus giganteus EF669928 Aspergillus acanthosporum EF669992 89 Aspergillus fumigatus U28460 100 NR12 Aspergillus ostianusEU021610 100 Aspergillus ochraceusEF661419 Talaromyces flavus EU021596 Cây phát sinh chủng loại NR12 với lồi có mối quan hệ họ hàng gần, đƣợc xây dựng dựa vào trình tự gen ITS; Talaromyces flavus EU021596 làm nhóm ngồi Trình tự gen rDNA đoạn ITS phân loại chủng NR13: CACAGGGATTGCCCCAGTACGGCGTAGAGAAGCGGCAACAGCTCAAAT TTGAAATCCGGCCCCTCGGGTCCGAGTTGTAATTTGTAGAGGATGCTTTT GGCAAGGCGCCGCCCGAGTTCCCTGGAACGGGACGCCACAGAGGGTGA Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ GAGCCCCGTCTGGCTGGCCGCCGAGCCTCTGTAAAGCTCCTTCGACGAG TCGAGTAGTTTGGGAATGCTGCTCAAAATGGGAGGTATATGTCTTCTAA AGCTAAATATTGGCCAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAA AGATGAAAAGCACCTTGAAAAGAGGGTTAAATAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGCGCTTGTGACCAGACTTGGGCGCGGCGGATCATCCGGG GTTCTCCCCGGTGCACTTCGCCGCGTCCAGGCCAGCATCAGTTCGTCGC GGGGGAAAAAGGCTTCGGGAACGTGGCTCCCCTGGGAGTGTTATAGCC CGTTGCACAATACCCTGCGGTGGACTGAGGACCGCGCATCTGCAAGGAT GCTGGCGTAATGGTCACCAGCGACCCGTCTGGAAAACACGGACCA 0.01 Trichoderma hanense AF399234.1 63 Hypocrea jecorina AF510497.1 Trichoderma saturnisporum AF399246.1 63 67 Trichoderma longibrachiatum AF399240.1 Trichoderma pseudokoningii AF400740.1 96 Trichoderma konilangbra AF399238.1 98 NR13 Trichoderma citrinoviride AF399228.1 Trichoderma flavofuscum AF399232.1 Hypocrea lutea AB027384.1 Trichoderma viride AY291123.1 Trichoderma koningi AJ876773.1 Fusarium merismoides EU860058.1 Phụ lục Một số hình ảnh lấy mẫu phân tích phịng thí nghiệm Hungary Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Phụ lục Hình ảnh nhân ni in vitro bào tử nấm rễ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Nhân nuôi in vitro từ rễ cà chua Nhân nuôi in vitro từ rễ lúa Phụ lục Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Một số hình ảnh thử nghiệm Trên lúa Trên cà chua Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Trên khoai tây Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... từ vài trò thực tiễn nấm vùng rễ nhằm tạo sở áp dụng công nghệ trên, phục vụ nghiên cứu tiếp theo, tiến hành thực đề tài ? ?Phân lập, tuyển chọn bước đầu đánh giá hiệu sử dụng chế phẩm nấm vùng rễ. .. xuất sử dụng chế phẩm đa chủng nấm nhằm tăng suất ổn định hiệu lực sản phẩm Việc nghiên cứu phát triển ứng dụng chế phẩm vi sinh từ nấm rễ nấm vùng rễ áp dụng hiệu cho nhiều lồi trồng nơng lâm nghiệp. .. bầu rễ số nông nghiệp nhƣ lúa, cà chua, lạc… từ số tỉnh miền bắc Việt nam (Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hƣng yên…) 3.2 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH TÊN CÁC CHỦNG NẤM RỄ Các kết thực đƣợc Phân lập Phân lập chủng nấm