NHẬN DẠNG RALSTONIA SOLANACEARUM BẰNG PCR VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG BỆNH HÉO XANH CỦA MỘT SỐ GIỐNG CÀ CHUA ĐỐI VỚI CÁC DÒNG VI KHUẨN Ở HÀ NỘI - VIEÄT NAM PCR FOR IDENTIFICATION OF RALSTONIA SOLANACEARUM AND EVALUATION OF RESISTANCE OF SOME TOMATO LINES TO BACTERIAL WILT IN VIETNAM Lê Lương Tề, Chu Văn Chuông, Phạm Mỹ Linh, Hà Viết Cường Đại học Nông nghiệp I – Hà Noäi SUMMARY - PCR for identification of Ralstonia solanacearum in infested tomato plant and evaluation on resistant to bacterial wilt capability of tomato lines in Hanoi – Vietnam - PCR is the best method for identification of Ralstonia solanacearum from infested tomato plant - Some international resistant cultivars to bacterial wilt entries namely Caraibo, Caravel, CLN1464-111-30.45 Redlander and Hawaii’s lines had showed high resistance to Vietnamese strains (BN and others strains) of tomato bacterial wilt Their resistant genes such as CRA66, CRA84-26-3, UPCA1169, P1127805A,… play a decive role in resistant capability in breeding programs - The experiment found out that susceptible tomato VL2000 grafted onto resistant to B.W eggplant named EG203 gave the best result on resistant to bacterial wilt capability in the field MỞ ĐẦU Bệnh héo xanh vi khuẩn Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuchi gây cà chua số trồng khác bệnh phổ biến, gây hại nghiêm trọng khó phòng trừ nước ta vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới nóng ẩm Việc phát nhanh xác để nghiên cứu biện pháp sử dụng giống mang gen kháng thông qua trình chọn lọc, lai tạo hữu tính ghép gốc ghép có tính kháng bệnh cao coi biện pháp phòng chống bệnh có triển vọng mang lại hiệu cao nghiên cứu nước PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Các bị bệnh phân lập môi trường PPSA từ isolate từ Hải Phòng, Bắc Ninh, Hà Nội, Vónh Phúc, Hà Tây Thanh Hóa - Lây nhiễm vi khuẩn vi khuẩn pha nước vô trùng (108 CFU/ml) đem ngâm rễ sát thương 3-4 tuần tuổi tưới thêm ml dịch vi khuẩn vào vùng rễ sau trồng Theo dõi tỷ lệ chết héo sống sót (Winstead, 1952) - Nhận diện vi khuẩn Ralstonia solanacearum kỹ thuật PCR DNA vi khuẩn chiết từ dịch vi khuẩn bệnh thu thấp tỉnh miền Bắc Hà Nội, Hà Tây, Thanh Hóa, Hải Phòng, Bắc Ninh, Vónh Phúc đất vùng rễ bệnh Cặp mồi sử dụng DivlR DivlF tổng hợp đoạn DNA đặc hiệu vi khuẩn Ralstonia solanacearum nằm vùng mã hóa riboxom 16S KẾT QUẢ Nhận diện vi khuẩn Ralstonia solanacearum kỹ thuật PCR Phản ứng PCR tổng hợp đoạn DNA đặc hiệu vi khuẩn Ralstonia solanacearum phân lập trực tiếp từ dịch vi khuẩn cà chua có triệu chứng héo xanh điển hình thu thập tỉnh miền Bắc Tuy nhiên, phát có mặt vi khuẩn gây bệnh chiết DNA từ đất lấy vùng rễ bệnh có lẽ mật độ vi khuẩn thấp Chúng thử cắt sản phẩm PCR thu với enzym cắt giới hạn RsaI AluI kết cho thấy enzym không tạo khác mẫu thử Thử phản ứng độc tính dòng isolate Ralstonia solanacearum giống cà chua cà tím Các giống cà chua VL.2000, Ba Lan giống cà tím EG203, EG195 lây nhiễm nhân tạo dòng vi khuẩn khác Bắc Ninh, Hà Nội, Hải Phòng, Thanh Hóa Kiểm tra tỷ lệ bệnh bị chết héo sống sót sau tuần lây nhiễm Kết đánh giá thu bảng Hình Phản ứng PCR phát Ralstonia solanacearum cà chua 1: mẫu Hải Phòng, 2: mẫu Thanh Hóa, 3: mẫu Hà Tây, 4: mẫu Hà Nội 5: đất bệnh, 6: đất khỏe, 7: mẫu Thanh Hóa, 8: mẫu Bắc Ninh, 9: mẫu Vónh Phúc Hình Kết gây bệnh nhân tạo Ralstonia solanacearum cà chua Bảng Phản ứng kháng – nhiễm giống cà chua dòng vi khuẩn Isolate (Dòng vi khuẩn) BN (Bắc Ninh) HP (Hải Phòng) HN (Hà Nội) HT (Hà Tây) Tỷ lệ bệnh chết héo (%) sau tuần lây nhiễm VL.2000 Ba Lan EG203 EG195 69,5 83,4 10,0 33,4 53,9 63,4 3,4 23,4 57,5 80,0 16,7 20,2 43,0 60,0 0,0 40,0 Trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo nhà lưới viện NCRQ – Hà Nội 2000-2001 cho thấy isolate BN phân lập từ cà chua vùng chuyên rau Bắc Ninh có độc tính cao isolate vùng Hải Phòng, Hà Nội, Hà Tây giống cà chua thí nghiệm Giống cà tím EG203 có khả kháng bệnh cao, tỷ lệ bệnh héo chết thấp từ 0,0% - 16,7% tỷ lệ sống cao từ 83,3% 100,0% tùy theo dòng vi khuẩn Xác định mức độ kháng nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn số giống nhập nội mang nguồn gen kháng điều kiện sinh thái vùng Hà Nội Bằng thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo dòng vi khuẩn BN có độc tính cao số giống cà chua nhập nội mang gen kháng bệnh khác để nhằm phát giống mang gen kháng phù hợp làm vật liệu nguyên thủy chọn tạo giống kháng có suất cao làm gốc ghép để phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn Kết trình bày bảng Bảng Khảo sát mức độ kháng – nhiễm giống cà chua bệnh héo xanh (dòng BN) Giống Hawaii 7996 Hawaii 7997 Caraibo GA 1565 Caravel CLN 1464111-30.45 Redlander FLA 7421 GA 219 Bf – Okitsu L 390* Nguồn gen kháng PT.127805A PT.127805A CRA66 PT.1263722 CRA66 UPCA1169 CRA84-26-3 VC-9-1 H7997 PT126408 NC19-53-64N - Nguồn gốc địa lý Mỹ Mỹ Pháp Pháp Trọng lượng (g) 55 50 130 60,5 135 Tỷ lệ héo xanh (%) 4,17 2,08 12,92 33,33 22,50 Đài Loan 150 16,67 R 120 135 40 18 35 27,09 68,75 59,33 8,33 77,09 R S S HR HS Mỹ Nhật Đài Loan Mức kháng HR HR R MR R Ghi chú: * Giống nhiễm chuẩn sử dụng làm đối chứng HR: kháng cao, R: kháng, MR: kháng trung bình, S: nhiễm, HS: nhiễm cao Kết thu chứng tỏ rằng: - Một số giống Hawaii nhỏ, có nguồn gốc từ Mỹ, mang nguồn gen kháng PT127805A thuộc nhóm giống có tính kháng cao (HR) dòng vi khuẩn BN phía Bắc Việt Nam tỷ lệ sống sau lây nhiễm nhân tạo đạt tỷ lệ cao từ 83,3% - 97,7%, tỷ lệ bệnh chết héo thấp từ 2,08% – 17,7% - Một số giống cà chua to (trên 90 gram/quả) mang nguồn gen kháng CRA66, CRA84-263, UPCA1169 giống Caraibo, Caravel, CLN1464-111-30.45 có tính kháng đến kháng vừa, tỷ lệ bệnh chết héo sau lây nhiễm tương đối thấp 12,9% – 16,67% Tỷ lệ sống sót cao 83% 87%, có triển vọng sử dụng công tác chọn tạo giống kháng bệnh héo xanh vi khuẩn có giá trị kinh tế - Một số giống khác to, mang nguồn gen kháng khác giống GA129, FLA7421 tỏ nhiễm nặng với dòng vi khuẩn BN Việt Nam - Giống nhiễm chuẩn (đối chứng) không mang gen kháng L390 tỏ giống nhiễm nặng dòng vi khuẩn thí nghiệm Việt Nam Khả phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn biện pháp trồng cà chua gốc ghép kháng bệnh Thí nghiệm thực vụ xuân hè 1999-2000 2001 khu thí nghiện viện NCRQ – Gia Lâm – Hà Nội gồm công thức trồng giống cà chua VL2000 giống nhập nội có suất cao, đặc tính nông học tốt chọn lọc trồng phổ biến sản xuất cảm nhiễm bệnh (đối chứng) công thức trồng giống VL2000 ghép gốc ghép kháng bệnh cà tím EG203, EG192 Lây nhiễm nhân tạo nguồn vi khuẩn BN theo phương pháp mô tả (Winstead, 1952) Cà chua ghép theo phương pháp ghép nối Kết kiểm tra tình hình sinh trưởng, suất mức độ nhiễm bệnh (tỷ lệ sống tỷ lệ chết héo) trình bày bảng Bảng Mức độ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn yếu tố sinh trưởng, suất cà ghép vụ xuân hè 2000-2001 Khu thí nghiệm viện NCRQ – Gia Lâm Công thức ghép cà chua/gốc ghép VL2000/EG302 VL2000/EG192 VL2000* Tỷ lệ bệnh chết héo (%) 8,4 36,7 53,4 Tỷ lệ sống (%) 91,6 63,3 46,6 Thời gian từ trồng đến thu lứa (ngày) 72 75 68 Năng suất TB/cây khỏe (kg) 1,23 0,92 1,33 Năng suất thu hoạch (tấn/ha) 39,9 36,9 20,5 Dựa sở kết bảng 3, bước đầu nhận xét hiệu phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn biện pháp ghép cà chua VL2000 gốc ghép tốt giống cà tím EG203 kháng bệnh khu vực đồng sông Hồng Cây cà chua ghép gốc cà tím EG203 thời kỳ có khả giảm tỷ lệ bệnh chết héo (8,4%) tăng tỷ lệ sống cho thu hoạch (91,6%) so với giống cà chua VL2000 không ghép có tính mẫn cảm bệnh làm tỷ lệ bệnh đạt cao (54,3%), tỷ lệ sống cho thu hoạch thấp (46,6%) làm giảm suất thu hoạch rõ rệt so với ghép KẾT LUẬN - Kỹ thuật PCR nhận biết, phát nhanh vi khuẩn Ralstonia solanacearum từ bệnh so với phương pháp vi sinh - Các dòng, giống có nguồn gen kháng CRA66, CRA-84-26-3, UPCA1169, PT127805A nhóm Hawaii 7997 giống có tính kháng cao – trung bình có triển vọng sử dụng công tác chọn tạo giống cà chua kháng bệnh héo xanh vi khuẩn số vùng thuộc miền Bắc Việt Nam, nơi phổ biến dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc Biovar3 – Race1 - Giống cà tím EG203 có tính kháng cao dòng vi khuẩn phân lập từ vùng phía Bắc Việt Nam (dòng BN, HN, HP, HT, …) Ghép cà chua VL2000 gốc ghép cà tím EG203 kháng bệnh có khả phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn, cho suất cao, chất lượng không thay đổi so với cà chua VL2000 nhiễm bệnh nặng không ghép trồng vụ xuân hè vùng Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO HANSON P.M., WANG J.F., and LICARDO O., 1996 Variable rection of tomato lines to Bacteral wilt evaluated at several locations in Southest Asia Hort Science 31:143-146 PRIOR P., GRIMAULT V., and J SCHMITH, 1994 Resistance to B.W (Pseudomonas solanacearum) in tomato Present status and prosfect ... giống có tính kháng cao – trung bình có triển vọng sử dụng công tác chọn tạo giống cà chua kháng bệnh héo xanh vi khuẩn số vùng thuộc miền Bắc Vi? ??t Nam, nơi phổ biến dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum. .. gây bệnh nhân tạo Ralstonia solanacearum cà chua Bảng Phản ứng kháng – nhiễm giống cà chua dòng vi khuẩn Isolate (Dòng vi khuẩn) BN (Bắc Ninh) HP (Hải Phòng) HN (Hà Nội) HT (Hà Tây) Tỷ lệ bệnh. .. kháng khác giống GA129, FLA7421 tỏ nhiễm nặng với dòng vi khuẩn BN Vi? ??t Nam - Giống nhiễm chuẩn (đối chứng) không mang gen kháng L390 tỏ giống nhiễm nặng dòng vi khuẩn thí nghiệm Vi? ??t Nam Khả phòng