Phân lập và khảo sát điều kiện sinh tổng hợp Amylase của xạ khuẩn RB-XK3

Trong bài viết này, 23 chủng xạ khuẩn đã được phân lập từ nhiều mẫu đất khác nhau, trong đó chủng xạ khuẩn RB-XK3 đã được tuyển chọn và định danh thuộc loài Streptomyces canus. Chủng xạ khuẩn này thể hiện khả năng sinh tổng hợp amylase tốt trong môi trường Gause II chứa 1% cơ chất tinh bột và 0,5% NH4NO3 với pH 8,0 tại 37C trong thời gian lên men là 96 giờ. Mời các bạn cùng tham khảo!

Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Số 44, 2020 PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP AMYLASE CỦA XẠ KHUẨN RB-XK3 NGUYỄN THỊ DIỆU HẠNH1, NGUYỄN THỊ THANH THÚY1, BÙI THỊ LUYẾN2, NGUYỄN THANH HẢI2, HỨA TRƯỜNG CHINH1, ĐẶNG BÍCH NGÂN1, NGUYỄN NGỌC ẨN1, PHẠM TẤN VIỆT1* Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Cơng Nghiệp Tp Hồ Chí Minh, 12 Nguyễn Văn Bảo, Gị Vấp, Tp Hồ Chí Minh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, 227 Nguyễn Văn Cừ, quận 5, Tp Hồ Chí Minh phamtanviet@iuh.edu.vn Tóm tắt: Vi sinh vật có vai trị quan trọng việc phân hủy hợp chất hữu tự nhiên đối tượng cho việc sản xuất enzyme giới Trong đó, amylase ba enzyme sử dụng nhiều thị trường enzyme công nghiệp việc tìm kiếm đối tượng vi sinh vật sản xuất amylase mạnh có khả hoạt động tốt điều kiện cực đoan cần thiết, đặc biệt xạ khuẩn đối tượng tiềm cho sản xuất amylase công nghiệp Trong nghiên cứu này, 23 chủng xạ khuẩn phân lập từ nhiều mẫu đất khác nhau, chủng xạ khuẩn RB-XK3 tuyển chọn định danh thuộc loài Streptomyces canus Chủng xạ khuẩn thể khả sinh tổng hợp amylase tốt môi trường Gause II chứa 1% chất tinh bột 0,5% NH4NO3 với pH 8,0 37C thời gian lên men 96 Chủng xạ khuẩn RB-XK3 cho thấy tiềm sản xuất amylase mơi trường kiềm thay trung tính chủng xạ khuẩn khác ứng dụng nhiều lĩnh vực khác Từ khóa: Streptomyces, amylase, enzyme ngoại bào, phân hủy tinh bột, điều kiện lên men ISOLATION AND SCREENING OF AMYLASE PRODUCTION OF ACTINOMYCES RB-XK3 Abstract: Microorganisms play an important role in the breakdown of organic compounds in nature and are the object of enzyme production in the world In particular, amylase is one of the three largest used groups in the industrial enzymes, and it is always necessary to select high amylase-producing microorganisms that can work under extreme conditions Notably, actinomycetes are the potential targets for industrial amylase production In this study, 23 strains of actinomycetes were isolated from many different soil samples, of which RB-XK3 was selected and identified as Streptomyces canus This strain showed high amylase biosynthesis in Gause II medium containing 1% starch substrate and 0.5% NH 4NO3 with pH 8.0 at 37C for 96 hours The RB-XK3 strain shows superior potential to produce amylase in an alkaline environment instead of the neutral one like other actinomycetes and thus can be applied in many different fields Keywords: Streptomyces, amylase, extracellular enzyme, starch degradation, fermentation conditions GIỚI THIỆU Amylase nhóm enzyme quan trọng có khả thủy giải tinh bột tạo thành loại đường khác fructose, glucose, maltose dextrin trung gian Amylase ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác công nghiệp thực phẩm, ngành công nghệ lên men, dệt may công nghệ sản xuất giấy [1, 2] Amylase sử dụng thành cơng q trình đường hóa tinh bột, công nghệ sản xuất rượu bia, cải thiện chất lượng bột công nghệ làm bánh thành phần cơng nghệ giặt tẩy [3-5] Ngồi ra, nhiều nghiên cứu cho thấy amylase ứng dụng y học, công nghệ sinh học hóa học [5, 6] Amylase ba nhóm enzyme sử dụng nhiều enzyme cơng nghiệp, chiếm khoảng 25-33% thị trường enzyme tồn giới [7] Amylase thu nhận từ nhiều nguồn khác thực vật, động vật, vi sinh vật chủ yếu sản xuất từ vi sinh vật Amylase vi sinh vật đáp ứng nhu cầu cơng nghiệp gia tăng tổng hợp enzyme kỹ thuật di truyền, phương pháp nuôi cấy liên tục, cảm ứng tối ưu hóa điều kiện sinh © 2020 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 188 PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP AMYLASE CỦA XẠ KHUẨN RB-XK3 trưởng [8] Các chủng vi sinh vật thường sử dụng để sản xuất amylase thuộc chi Bacillus, Streptomyces, Micrococcus, Pseudomonas, Arthrobacter, Escherichia, Proteus, Aspergillus Serratia, chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces ngày quan tâm [5, 9-12] Streptomyces nhóm vi sinh vật quan trọng có hiệu kinh tế cao thuộc họ actinobacteria Các chủng xạ khuẩn Streptomyces đối tượng sản xuất khoảng 50% hợp chất trao đổi thứ cấp, đặc biệt chất kháng sinh, kháng khối u, enzyme chất ức chế enzyme, hợp chất kháng khuẩn kháng oxy hóa, chất điều hòa thực vật vitamin [13-15] Streptomyces tham gia vào việc sản xuất nhiều loại enzyme khác đóng vai trị quan trọng việc phân hủy hợp chất hữu cellulase, protease, keratinase, amylase, xylanase, lipase, chitinase, pectinase [5] Với đặc tính chịu nhiệt chịu kiềm cao, việc sản xuất amylase từ xạ khuẩn ngày quan tâm Các amylase chiu nhiệt sản xuất từ xạ khuẩn ứng dụng dễ dàng nhiều ngành công nghiệp khác [5] Do đó, việc phân lập chọn lọc chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp amylase mạnh tối ưu hóa điều kiện sản xuất amylase từ chủng xạ khuẩn nghiên cứu nhiều năm gần [16-19] Trong nghiên cứu này, phân lập, tuyển chọn định danh chủng xạ khuẩn có khả tổng hợp amylase ngoại bào có hoạt tính cao xác định điều kiện thích hợp cho q trình sinh tổng hợp amylase chủng xạ khuẩn tuyển chọn Nghiên cứu tạo sở cho việc sản xuất amylase ngoại bào ứng dụng việc tạo chế phẩm vi sinh có khả phân hủy tinh bột để ứng dụng lĩnh vực khác VẬT LIỆU & PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn sinh tổng hợp amylase Các mẫu đất thu thập từ nhiều địa phương khác tỉnh Tiền Giang Bến Tre Mẫu đất sau pha loãng nước muối sinh lý trải môi trường thạch Gause I (20,0 g tinh bột tan; 0,5 g MgSO4.7H 2O; 3,0 g K2HPO4; 1,0 g KNO3; 0,5 g NaCl; 0,1 g FeSO4; 20,0 g agar; nước cất vừa đủ lít; pH 7,2-7,4) ủ 37C – 10 ngày Các khuẩn lạc riêng rẽ có đặc điểm đặc trưng xạ khuẩn có khả tạo vịng phân giải tinh bột có diện dung dịch lugol chọn cấy ria liên tiếp lần môi trường điều kiện để làm Các khuẩn lạc sau làm giữ giống glycerol 20% -46C cho thí nghiệm 2.2 Đánh giá sơ khả sinh tổng hợp amylase Khả sinh tổng hợp amylase chủng xạ khuẩn đánh giá sơ thơng qua vịng phân giải tinh bột mơi trường thạch Gause I có diện dung dịch lugol Các chủng xạ khuẩn nuôi cấy môi trường Gause I 37C 10 ngày Sau thời gian ni ủ, vịng phân giải kiểm tra thuốc thử lugol Khả sản sinh amylase để phân giải tinh bột chủng xạ khuẩn xác định cách so sánh độ lớn vòng phân giải A = D – d với D đường kính vịng phân giải d đường kính khuẩn lạc xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp amylase mạnh chọn để nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp amylase ngoại bào 2.3 Định danh xạ khuẩn Căn vào kết khảo sát sơ khả sinh tổng hợp amylase, chủng xạ khuẩn chọn nuôi môi trường Gause I 10 ngày 37C quan sát hình thái đại thể Cấu trúc cuống sinh bào tử quan sát tiêu phịng ẩm kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần Chủng xạ khuẩn định danh mức phân tử phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S-rRNA với cặp mồi 27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' phương trình PCR sau 95°C - phút, 30 chu kỳ (95°C - 30 giây; 55°C - 40 giây; 72°C - 90 giây) 72°C - phút công ty Nam Khoa Biotek (793/62 Trần Xuân Hưng, Quận 7, Hồ Chí Minh) kết giải trình tự so sánh với sở liệu 16S-rRNA xạ khuẩn có sẵn National Center for Biotechnology Information (NCBI) công cụ BLASTN (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Kết giải trình tự chiều vùng trình tự 16S ribosomal RNA kiểm tra độ xác thiết lập trình tự consensus phần mềm FinchTV Seaview Các trình tự gióng phần mềm ClustalX2.1 Cây phả hệ thể mối quan hệ di truyền Mẫu nghiên cứu loài thuộc chi Streptomyces có liệu GenBank xây dựng phầm mềm MrBayes theo phương pháp Bayesian © 2020 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP AMYLASE CỦA XẠ KHUẨN RB-XK3 189 2.4 Xác định hoạt độ amylase phƣơng pháp Bernfeld Hoạt độ amylase enzyme ngoại bào từ xạ khuẩn xác định thông qua lượng đường khử tạo thành sau phản ứng dịch enzyme thô chất tinh bột 1% Phương pháp dựa sở sử dụng thuốc thử 3,5-acid dinitrosalicylic (DNS) có màu vàng sau cho phản ứng với đường khử (sản phẩm thủy phân cellulose) tạo thành 3-amino,5-nitro salicylic acid màu đỏ cam có khả hấp thụ cực đại bước sóng 540 nm [20] Dịch ni cấy xạ khuẩn điều kiện thích hợp thu nhận loại bỏ tế bào cách ly tâm (13.000 vòng/phút 10 phút 4C) để thu nhận dịch enzyme thô amylase ngoại bào Dịch enzyme cho phản ứng với dung dịch tinh bột 1% 10 phút thuốc thử DNS thêm vào để xác định lượng đường khử giải phóng Đơn vị hoạt tính (UI) amylase xác định lượng enzyme cần thiết để giải phóng micromole đường khử 37℃ phút 2.5 Khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn nuôi môi trường Gause I lỏng 37C, 150 vòng/phút ngày sử dụng nguồn giống tăng sinh cho thí nghiệm khảo sát điều kiện sinh tổng hợp enzyme ảnh hưởng nguồn chất, nitơ, điều kiện nhiệt độ, pH khác Hoạt tính amylase dịch nuôi cấy xạ khuẩn sau loại bỏ tế bào phương pháp ly tâm 13.000 vòng/phút 4C xác định sau 24 nuôi cấy phương pháp Bernfeld Để khảo sát ảnh hưởng nguồn chất, môi trường Gause II với thành phần bao gồm 3,0 g cao thịt; 5,0 g pepton; 5,0 g NaCl; nước cất vừa đủ lít; pH 7,2-7,4 bổ sung 10,0 g chất khác tinh bột, bột gạo, bột mì, bột bắp Cơ chất cho kết tổng hợp enzyme cao sử dụng cho thí nghiệm khảo sát Ảnh hưởng nguồn nitơ lên sinh tổng hợp amylase kiểm tra môi trường Gause II với thành phần cacbon cho kết cao thí nghiệm thay nguồn nitơ g tryptone, cao nấm men, NaNO3, (NH4)2SO4, NH4NO 3, NH4Cl, ure Nguồn chất nitơ cho kết hoạt tính amylase dịch ni cấy cao chọn để tiếp tục khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn ni mơi trường thử nghiệm có nguồn chất nitơ thích hợp ni ủ điều kiện nhiệt độ khác 25C, 30C, 35C, 37C, 40C ± 0,1C Kết chọn lọc từ điều kiện thích hợp nguồn chất, nitơ phù hợp sử dụng khảo sát ảnh hưởng pH môi trường lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn Môi trường thử nghiệm điều chỉnh giá trị pH ban đầu khác 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 ± 0,1 nuôi ủ nhiệt độ thích hợp chọn lọc 2.6 Phƣơng pháp thống kê xử lý số liệu Giá trị kết thí nghiệm trung bình lần lặp lại Số liệu tính toán, vẽ biểu đồ Microsoft Excel 2013 xử lý thống kê phương pháp ANOVA phần mềm Statgraphics Centurion 18 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính amylase Các chủng xạ khuẩn phân lập từ mẫu đất thu thập từ nhiều địa phương khác thuộc tỉnh Tiền Giang Bến Tre, môi trường Gause I 37C ngày Kết phân lập 23 chủng xạ khuẩn khác sinh trưởng phát triển mơi trường chọn lọc đặt tên theo thứ tự RB-XK01 đến RB-XK23 Kết sàng lọc với dung dịch lugol cho thấy có chủng xạ khuẩn có khả hình thành vịng phân giải tinh bột với độ lớn vòng phân giải từ 1,0 - 2,9 cm Các chủng xạ khuẩn có khả phân giải tinh bột mạnh thể hình độ lớn vòng phân giải thể bảng Các chủng vi khuẩn thể độ lớn vòng phân giải nhỏ 1,0 cm xem khả sinh tổng hợp amylase ngoại bào không đáng kể (17 chủng) Bảng 1: Độ lớn vòng phân giải tinh bột chủng xạ khuẩn phân lập Chủng xạ khuẩn Nguồn đất phân lập Độ lớn vòng phân giải A (D-d, cm) RB-XK2 Tiền Giang 2,77 a 0,40 RB-XK3 Tiền Giang 2,94 a 0,56 RB-XK7 Bến Tre 1,56b 0,19 RB-XK16 Bến Tre 1,33b 0,06 © 2020 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 190 PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP AMYLASE CỦA XẠ KHUẨN RB-XK3 RB-XK17 RB-XK23 Bến Tre Bến Tre 2,31 c 0,09 1,0 d 0,10 Hình Khả sinh amylase số chủng xạ khuẩn phân lập Dựa kết thể bảng 1, số chủng xạ khuẩn thể khả phân giải tinh bột mơi trường Gause I chủng xạ khuẩn RB-XK3 thấy khả sinh tổng hợp amylase ngoại bào tốt với độ lớn vòng phân giải lên đến 2,94 0,56 cm Hai chủng xạ khuẩn RB-XK2 RBXK17 thể hoạt tính phân giải tinh bột cao với độ lớn vòng phân giải tương ứng 2,77 0,40 2,3 0,09 cm, ba chủng xạ khuẩn cịn lại RB-XK7, RB-XK16, RB-XK23 có độ lớn vòng phân giải từ 1,0 0,10 đến 1,56 0,19 cm Kết phân tích thống kê cho thấy độ lớn vịng phân giải tinh bột chủng RB-XK3 khơng có khác biệt có ý nghĩa với chủng RB-XK2, nhiên, kết thống kê cho thấy có khác biệt đáng kể với chủng lại (ANOVA, n=3, độ tin cậy 95%) Với độ lớn vòng phân giải 2,94 0,56 cm, chủng xạ khuẩn RB-XK3 cho thấy khả sản sinh amylase ngoại bào cao cao chủng Streptomyces S1-S8 phân lập chọn lọc từ biển có vịng phân giải 0,4 - 2,0 cm nghiên cứu Sathya Rengasamy cộng (2018) [16], tương tự chủng Streptomyces sp SLBA-08 chọn lọc từ 286 chủng xạ khuẩn nghiên cứu Santos cộng (2012) [21] Như vậy, với thể khả sinh tổng hợp amylase cao, chủng xạ khuẩn RB-XK3 chọn làm đối tượng nghiên cứu cho thí nghiệm khảo sát điều kiện sinh tổng hợp amylase 2.7 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, vi thể định danh xạ khuẩn RB-XK3 Chủng xạ khuẩn RB-XK3 kiểm tra đặc điểm đại thể hình thái khuẩn lạc mơi trường Gause I sau 10 ngày nuôi ủ Khuẩn lạc RB-XK3 trịn, có kích thước 0,4-0,6 cm, màu trắng đục, bờ không đều, tâm màu vàng nhạt, khuẩn ty chất bám sâu vào bề mặt thạch, khuẩn ty khí sinh nằm sát bề mặt mơi trường (hình 2A) Kết vi thể tiêu phòng ẩm quan sát kính hiển vi cho thấy cuống sinh bào tử RB-XK3 phân nhánh, có dạng xoắn lị xo, với bào tử hình thành cuống sinh bào tử dạng chuỗi dài (hình 2B-C) © 2020 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP AMYLASE CỦA XẠ KHUẨN RB-XK3 191 Hình Hình thái đại thể vi thể xạ khuẩn RB-XK3 (A) Hình thái khuẩn lạc mơi trường Gause I sau ngày ni ủ 37C (B) Hình ảnh vi thể độ phóng đại X1000 (C) Hình ảnh phóng đại cuống sinh bào tử (mũi tên đen) chuỗi bào tử (mũi tên trắng) Bên cạnh đó, phần trình tự đoạn gen mã hóa cho16S-rRNA (900 bp) xạ khuẩn RB-XK3 kiểm tra với trình tự mồi so sánh với ngân hàng liệu NCBI Kết cho thấy gen mã hóa cho 16S-rRNA chủng RB-XK3 có tương đồng với chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces Dựa kết thu được, phả hệ chủng xạ khuẩn RB-XK3 với loài gần xây dựng xác định chủng xạ khuẩn RB-XK3 thuộc chi Streptomyces (hình 3) Hình Cây phả hệ thể mối quan hệ di truyền (vùng vùng trình tự 16S ribosomal RNA) mẫu nghiên cứu taxa từ liệu NCBI, xây dựng phần mềm MrBayes theo phương pháp Bayesian với nhánh có giá trị bootstrap > 50% giữ lại 2.8 Ảnh hƣởng nguồn chất lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RB-XK3 Tương tự loại vi sinh vật khác, tổng hợp enzyme ngoại bào xạ khuẩn chịu ảnh hưởng trực tiếp chất tương ứng có mơi trường Do đó, tiến hành khảo sát ảnh hưởng chất tinh bột khác (tinh bột tan, bột gạo, bột mì, bột bắp) lên trình sinh tổng hợp amylase ngoại bào xạ khuẩn RB-XK3 Dịch nuôi cấy xạ khuẩn sau 24 nuôi ủ thu nhận kiểm tra hoạt tính amylase theo phương pháp Bernfeld Kết ảnh hưởng chất tinh bột khác theo thời gian lên sinh tổng hợp amylase trình bày hình © 2020 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 192 PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP AMYLASE CỦA XẠ KHUẨN RB-XK3 Hình Ảnh hưởng nguồn chất lên tổng hợp amylase xạ khuẩn RB-XK3 theo thời gian (A) thời điểm 96 nuôi cấy (B) Kết cho thấy chủng xạ khuẩn RB-XK3 có khả sinh tổng hợp amylase môi trường Gause II với chất bổ sung tinh bột, bột gạo, bột mì, bột bắp với mức độ khác (hình 4A) Trong 48 nuôi ủ ban đầu, RB-XK3 thể tổng hợp enzyme không đáng kể Sau 72 nuôi ủ, bốn loại chất cho thấy sinh tổng hợp amylase vượt trội, nguồn chất tinh bột bột bắp cho kết tốt với hoạt tính 2895 ± 56,5 UI/ml 2660 ± 97,8 UI/ml, hoạt tính amylase thu điều kiện bột gao bột mì đạt 1221 ± 64,2 UI/ml 1683 ± 147,6 UI/ml Tuy nhiên, sau thời gian nuôi ủ 96 giờ, hoạt tính amylase mơi trường bổ sung chất bột gạo cho kết tăng cao với 3266 ± 138,1 UI/ml, tương tự hoạt tính đạt mơi trường có nguồn chất tinh bột 3248 ± 91,9 UI/ml, mơi trường có chất bột mì bột bắp cho kết đạt 2189 ± 74,2 UI/ml 1574 ± 24,3 UI/ml (hình 4B) Sự gia tăng thời gian ni ủ cho thấy giảm hoạt tính amylase dịch ni cấy, ngồi trừ mơi trường có nguồn chất tinh bột, nguyên nhân nguồn chất khơng phải mơi trường thích hợp cho sinh trưởng xạ khuẩn, đó, hạn chế mật độ xạ khuẩn hạn chế sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật Bên cạnh đó, kết phân tích thống kê cho thấy có khác biệt đáng kể nguồn chất tinh bột với nguồn chất bột bắp, bột mì khơng có khác biệt nguồn chất bột gạo lên sinh tổng hợp amylase chủng xạ khuẩn RB-XK3 sau 96 ni ủ (ANOVA, n=3, độ tin cậy 95%) Do đó, để ổn định trình sinh tổng hợp enzyme, tinh bột chọn làm chất cho thí nghiệm khảo sát lên trình sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RB-XK3 với thời gian nuôi ủ sau 96 2.9 Ảnh hƣởng nguồn nitơ lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RB-XK3 Bên cạnh nguồn chất cacbon, nitơ thành phần thiếu sinh trưởng phát triển loại sinh vật Sự sinh tổng hợp enzyme ngoại bào vi sinh vật bị ảnh hưởng thành phần Do đó, để xác định ảnh hưởng nitơ lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RB-XK3, tiến hành khảo sát nguồn nitơ khác (NH4)2SO4, NH4NO3, NH4Cl, NaNO3, ure, cao nấm men, tryptone lên sản sinh amylase ngoại bào xạ khuẩn Hoạt tính amylase dịch nuôi cấy kiểm tra sau 24 nuôi ủ thể hình Hình Ảnh hưởng nguồn nitơ lên tổng hợp amylase xạ khuẩn RB-XK3 theo thời gian (A) thời điểm 96 ni cấy (B) © 2020 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP AMYLASE CỦA XẠ KHUẨN RB-XK3 193 Hoạt tính amylase chủng RB-XK3 ghi nhận cho kết cao mơi trường ni cấy có bổ sung nguồn nitơ NH4NO3 với 4161,9 IU/ml ± 140,2 UI/ml sau 96 lên men trì hoạt tính cao theo khoảng thời gian lên men đến 144 (hình 5A) Hoạt tính amylase mơi trường lên men có bổ sung (NH4)2SO4 ure ghi nhận 3980,9 ± 185,4 UI/ml 3827,1 ± 84,1 UI/ml thời điểm lên men 96 chênh lệch không đáng kể so sánh với mơi trường lên men có chứa NH4NO3 (ANOVA, n=3, độ tin cậy 95%) Tuy nhiên, sau thời gian tiếp tục lên men đến 144 hoạt tính amylase giảm cho thấy có ảnh hưởng sản phẩm trao đổi thứ cấp môi trường lên men lên hoạt tính amylase sinh tổng hợp từ xạ khuẩn RB-XK3 Ngồi ra, hoạt tính amylase dung dịch enzyme môi trường bổ sung nguồn nitơ khác kiểm tra, hoạt tính thể thấp với giá trị 3275,2 ± 267,4 IU/ml, 2732,4 ± 209,3 IU/ml, 3438,1 ± 140,2 IU/ml, 3166,7 ± 85,3 IU/ml tương ứng với NH4Cl, NaNO3, Tryptone, cao nấm men (hình 5B) Sự gia tăng thời gian nuôi cấy đến 144 ảnh hưởng đến chất lượng dung dịch enzyme môi trường lên men cho thấy hoạt tính amylase giảm mạnh so với hoạt tính ghi nhận trước Căn kết thu nhận được, nguồn nitơ NH4NO3 chọn bổ sung vào môi trường sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RB-XK3 với thời gian lên men xác định sau 96 2.10 Ảnh hƣởng điều kiện nhiệt độ lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RB-XK3 Nhiệt độ lên men yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme khả sản sinh enzyme vi sinh vật, đặc biệt xạ khuẩn Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh tổng hợp amylase kiểm tra môi trường Gause II với nguồn nitơ NH4NO3 điều kiện nhiệt độ khác (25, 30, 35, 37, 40C), 150 vòng/phút Hoạt tính amylase dung dịch ni cấy nhiệt độ khác kiểm tra tương tự thí nghiệm sau 24 hoạt tính khơng tăng đáng kể kết thể hình bên Chủng xạ khuẩn RB-XK3 thể hoạt tính khác điều kiện nhiệt độ khác sau 144 lên men (hình 6A), hoạt tính cao điều kiện nhiệt độ 37C với 4478,6 ± 42,0 UI/ml điều kiện nhiệt độ khác thể thấp tương ứng 380,0 ± 24,3 UI/ml, 633,3 ± 70,1 UI/ml, 841,4 ± 64,2 UI/ml, 2542,4 ± 85,3 UI/ml nhiệt độ 25C, 30C, 35C, 40C So sánh hoạt tính thể theo thời gian nhiệt độ khác nhau, kết cho thấy khả sinh tổng hợp amylase chủng xạ khuẩn RB-XK3 khơng thích hợp nhiệt độ thấp 25C, 30C nhiệt độ ấm 35C-40C thích hợp cho tổng hợp amylase Điều phù hợp cho đặc tính sinh trưởng phát triển ưa nhiệt chủng xạ khuẩn Tại điều kiện 35C, 37C, 40C, sau 96 lên men, hoạt tính amylase thể tương ứng 3429,0 ± 78,0 UI/ml, 3600,9 ± 28,0 UI/ml, 3492,4 ± 85,3 UI/ml kết phân tích thống kê cho thấy khơng có khác biệt đáng kể sinh tổng hợp amylase điều kiện nhiệt độ sau 96 nuôi ủ (ANOVA, n=3, độ tin cậy 95%) (hình 6B) Tuy nhiên, thời gian ni ủ tăng lên, hoạt tính amylase điều kiện 35C 40C giảm, hoạt tính amylase 37C khơng có xu hướng giảm tiếp tục tăng nhẹ Kết nguyên nhân giảm khả sinh trưởng xạ khuẩn môi trường nhiệt độ thấp, ảnh hưởng chất trao đổi thứ cấp xạ khuẩn trình sinh trưởng hình thành Kết tương tự quan sát thấy sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn Streptomyces spp PDS1 nghiên cứu Ragunathan cộng (2013) [17] Ngoài ra, kết cho thấy chủng xạ khuẩn RB-XK3 sinh tổng hợp amylase tốt sau 96 ni ủ tương tự dịng xạ khuẩn Streptomyces S1-S8 nghiên cứu Sathya Rengasamy cộng (2018) [16], chủng Streptomyces gancidius_ASD-KT852565 nghiên cứu Ashwini Krishnan cộng (2015) [11] nhanh chủng Streptomyces spp PDS1 với thời gian thích hợp 120 (Ragunathan cộng sự-2013) [17], chủng Streptomyces sp D1 có thời gian lên men tạo amylase thích hợp 10 ngày nghiên cứu Chakraborty cộng (2009) [22] Dựa vào kết thu nhận được, nhiệt độ 37C chọn cho sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RB-XK3 thời gian nuôi ủ xác định tương tự kết nghiên cứu trước sau 96 © 2020 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 194 PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP AMYLASE CỦA XẠ KHUẨN RB-XK3 Hình Ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ khác lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RB-XK3 theo thời gian (A) thời điểm 96 nuôi cấy (B) 3.6 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RB-XK3 Ngoài việc chịu ảnh hưởng thành phần chất cacbon, nitơ, điều kiện nhiệt độ môi trường, sinh tổng hợp amylase ngoại bào vi sinh vật bị ảnh hưởng yếu tố pH môi trường cấy Để khảo sát ảnh hưởng yếu tố pH lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RB-XK3, môi trường Gause II với thành phần chất tinh bột nguồn nitơ NH4NO3 điều chỉnh giá trị pH ban đầu khác 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 ± 0,1 xạ khuẩn nuôi cấy nhiệt độ 37C điều kiện lắc 150 vòng/phút Dung dịch enzyme thu nhận kiểm tra hoạt tính sau 24 ni cấy Hình Ảnh hưởng điều kiện pH khác lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RB-XK3 theo thời gian (A) thời điểm 96 ni cấy (B) Kết thể hình cho thấy chủng xạ khuẩn RB-XK3 có khả tổng hợp amylase tốt mơi trường ni cấy có giá trị pH ban đầu khoảng 6,0-8,0 mạnh pH 8,0 với hoạt tính 4379,0 ± 78,0 UI/ml hoạt tính điều kiện pH 6,0 7,0 3392,9 ± 64,2 UI/ml 3528,6 ± 24,3 UI/ml sau 96 nuôi ủ Kết phân tích thống kê cho thấy khơng có khác biệt đáng kể sinh tổng hợp amylase sau 96 với 120 144 nuôi ủ (ANOVA, n=3, độ tin cậy 95%) (hình 7A) Bên cạnh đó, hoạt tính enzyme thu nhận mơi trường ni cấy có điều kiện pH 4,0, 5,0 9,0 thể hoạt tính thấp đạt 2099,0 ± 61,1 UI/ml pH 4,0, 2859,0 ± 114,7 UI/ml pH 5,0 1954,3 ± 121,4 UI/ml điều kiện pH 9,0 sau 96 ni ủ, đồng thời hoạt tính giảm mạnh theo thời gian nuôi ủ đạt 1076,7 UI/ml sau 144 ni ủ (hình 7A) Ngồi ra, giảm hoạt tính enzyme điều kiện pH acid mạnh (4,0 – 5,0) pH kiềm (9,0) điều kiện bất lợi môi trường ảnh hưởng đến khả sinh trưởng phát triển xạ khuẩn, từ ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp enzyme xạ khuẩn Ngoài điều kiện pH không phù hợp ảnh hưởng đến ổn định cấu trúc enzyme làm giảm hoạt tính enzyme Kết khảo sát cho thấy sinh tổng hợp amylase RB-XK3 thích hợp điều kiện pH trung tính, acid yếu kiềm yếu (6,0-8,0), kết phân tích thống kê cho thấy có khác biệt đáng kể hoạt tính amylase thu nhận pH 8,0 với điều kiện pH 6,0 7,0 sau 96 nuôi ủ (ANOVA, n=3, độ tin cậy 95%) (hình 7B) Như vậy, chủng xạ khuẩn RBXK3 thích hợp sinh tổng hợp amylase mơi trường có pH kiềm, phần lớn chủng xạ khuẩn nghiên cứu trước thể tốt điều kiện pH trung tính 7,0 chủng Streptomyces sp © 2020 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP AMYLASE CỦA XẠ KHUẨN RB-XK3 195 SLBA-08, chủng Streptomyces spp PDS1 nghiên cứu tương ứng Santos cộng (2012) [21], Ragunathan cộng (2013) [17], chủng xạ khuẩn Streptomyces gancidius_ASD-KT852565 phân lập từ biển nghiên cứu Ashwini Krishnan cộng (2015) [11] Ngoài ra, sinh tổng hợp amylase từ chủng xạ khuẩn ưa kiềm ghi nhận nghiên cứu Chakraborty S cộng (2012) [23] KẾT LUẬN Từ nguồn mẫu đất khác nhau, 23 chủng xạ khuẩn phân lập kiểm tra sinh tổng hợp amylase ngoại bào chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn RB-XK3 thể sinh tổng hợp amylase cao định danh phân tích trình tự 16S rRNA So sánh với ngân hàng liệu NCBI, chủng RB-XK3 xác định thuộc chi Streptomyces loài Streptomyces canus Điều kiện sinh tổng hợp amylase chủng xạ khuẩn kiểm tra xác định Chủng xạ khuẩn RB-XK3 thể tổng hợp enzyme tốt môi trường Gause II có bổ sung 1% chất tinh bột, 0,5% NH4NO3 Thời gian thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme kiểm tra điều kiện khảo sát tương ứng xác định thời gian tối thích 96 ni ủ điều kiện nhiệt độ 37C pH mơi trường thích hợp 8,0 Khả hoạt động tốt xạ khuẩn RB-XK môi trường pH 8,0 cho thấy tiềm cao việc ứng dụng tạo chế phẩm sinh học để xử lý chất thải tinh bột giặt tẩy chất bẩn có nguồn gốc từ tinh bột điều kiện kiềm hóa cách hiệu quả, đặc biệt hỗ trợ việc phát triển bền vững môi trường đời sống LỜI CẢM ƠN: Kết nghiên cứu phần đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường “Tuyển chọn xạ khuẩn phân tích đặc tính hệ enzyme amylase ngoại bào từ xạ khuẩn” (mã số 184.TP13) hỗ trợ kinh phí từ trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh Do đó, chúng tơi xin chân thành cảm ơn trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh hỗ trợ cho thí nghiệm đề tài nghiên cứu khoa học TÀI LIỆU THAM KHẢO Rajagopalan G, K.C., Alpha amylase production from catabolic depressed Bacillus subtilis KCC103 utilizing sugarcane bagasse hydrolysate Bioresource Technology, 2008 99: p 3044-3050 Reddy NS, N.A., Sambasiva Rao KRS , An overview of the microbial amylase family African Journal of Biotechnology, 2003 2: p 645-648 Gupta R, G.P., Mohapatra H, Goswami VK, Chauhan B., Microbial amylases a biotechnological perspective Process Biochemistry, 2003 38: p 1599-1616 A Pandey, P.N., C R Soccol, V T Soccol, D Singh, and R.Mohan, , Advances in microbial amylases Biotechnology and Applied Biochemistry, 2000 31: p 135-152 Salma Mukhtar, A.Z., Dalaq Aiysha, Kauser Abdulla Malik and Samina Mehnaz, Actinomycetes: A Source of Industrially Important Enzymes Journal of Proteomics & Bioinformatics, 2017 10: p 316-319 Kira O, C.U., Arikan B, Effects of carbon sources and various chemicals on production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-12 Enzyme 2004 29: p 99-103 Q D Nguyen, J.M.R.-S., M Claeyssens, I Stals, and Á Hoschke, Purification and characterisation of amylolytic enzymes from thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus strain ATCC 34626 Enzyme and Microbial Technology,, 2002 31: p 345-352 Pandey A, S.C., Mitchell D , New developments in solid state fermentation: Bioprocess and products Process Chemistry, 2000 35: p 1153-1169 Van der Maarel J.M., V.d.V.B., Uitdehaag J.C., Leemhuis H., Dijkhuizen L., Properties and applications of starch converting enzymes of the alfa amylase family Journal of Bacteriology, 2002 94: p 137-155 © 2020 Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 196 PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP AMYLASE CỦA XẠ KHUẨN RB-XK3 10 Shafiei M., Z.A.A., Amoozegar M.A , Purification and characterization of an organic- solvent-tolerant halophilic a-amylase from the moderately halophilic Nesterenkonia sp strain F Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2011 38: p 275-281 11 Ashwini Krishnan, S.S.K., Optimization of alpha amylase extracted from marine actinomycetes Streptomyces gancidicus_ASD-KT852565 International Research Journal of Pharmacy, 2015 6: p 729735 12 Abdullah R, S.N., Iqtedar M, Naz S, Iftikhar T., Optimization of cultural conditions for the production of alphaamylase by Aspergillus niger (BTM-26) in solid state fermentation Pakistan Journal of Botany, 2014 46.(1071-1078) 13 Bull AT, S.J., Ward AC, Goodfellow M , Marine actinobacteria; perspectives, challenges, future directions Antonie Van Leeuwehoek, 2005 87: p 65-79 14 Sreejetha M, D., Veena S, Kokati Venkata BR , The bioactive potential of Streptomyces variabilis-DV-35 isolated from Thottada Marine sediments, Kannur, Kerala Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 2016 9: p 67-71 15 Kamjam M, S.P., Deng Z, Hong K (2017) 8: 760, Deep Sea Actinomycetes and Their Secondary Metabolites Frontier in Microbiology, 2017 8: p 760 16 Sathya Rengasamy, U.t., Isolation, screening and determination of a-amylase activity from marine Streptomyces species International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2018 10: p 122127 17 Padhmadas, R.R.a.R., Production, purification and characterization of - amylase using Streptomyces spp PDS1 and Rhodococcus spp Isolated from Western Ghats 2013 2: p 206-214 18 Tanupriya Ojha, K.D., Anjulata Vishwakarma, Production of amylase and lipase enzymes from actinomycetes World Journal of Pharmaceutical Sciences, 2016 4: p 353-356 19 Renu Singh, V.K., and Vishal Kapoor, Partial Purification and Characterization of a Heat Stable aAmylase from a Thermophilic Actinobacteria, Streptomyces sp MSC702 Hindawi Publishing Corporation Enzyme Research, 2014 2014: p 1-8 20 Bernfeld, P., Amylase, α and β Methods in Enzymology, 1955 1: p 149-158 21 Édilla Ribeiro dos Santos, Z.N.S.T., Núria Mariana Campos, Diogo Angeli Jacinto de Souza, Aline Simões da Rocha Bispo and Rodrigo Pires Nascimento, Production of a-Amylase from Streptomyces sp SLBA08 Strain Using Agro-Industrial By-Products Brazilian archives of Biology and Technology, 2012 55: p 793-800 22 Chakraborty S, K.A., Kokare C, Mahadik K, Chopade B , Isolation and characterization of novel aamylase from marine Streptomyces sp D1 Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2009 58: p 1723 23 Chakraborty S, R.G., Khopade A, Mahadik K, Kokare C et al., Study on calcium ion independent aamylase from halo-alkaliphilic marine Streptomyces strain A3 Indian Journal Biotechnology, 2012 11: p 427-437 © 2020 Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ... khuẩn lạc xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp amylase mạnh chọn để nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp amylase ngoại bào 2.3 Định danh xạ khuẩn Căn vào kết khảo sát. .. Hồ Chí Minh PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP AMYLASE CỦA XẠ KHUẨN RB-XK3 189 2.4 Xác định hoạt độ amylase phƣơng pháp Bernfeld Hoạt độ amylase enzyme ngoại bào từ xạ khuẩn xác định... thành phố Hồ Chí Minh 192 PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP AMYLASE CỦA XẠ KHUẨN RB-XK3 Hình Ảnh hưởng nguồn chất lên tổng hợp amylase xạ khuẩn RB-XK3 theo thời gian (A) thời điểm