Nghiên cứu sự hình thành màng sinh học biofilm và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn sản sinh biofilm luận văn thạc sĩ nông nghiệp

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ ĐỨC HẠNH NGHIÊN CỨU SỰ HÌNH THÀNH MÀNG SINH HỌC (BIOFILM) VÀ TÍNH ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN SẢN SINH BIOFILM Ngành: Thú Y Mã số: 60640101 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Bá Hiên NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Đức Hạnh i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Thú Y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Đặc biệt tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn khoa học PGS TS Nguyễn Bá Hiên tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình nghiên cứu thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị môn Vi Sinh Vật Truyền Nhiễm giúp đỡ thời gian thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Đức Hạnh ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract x PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái niệm màng sinh học (BIOFILM) 2.2 Các dạng màng sinh học tự nhiên 2.3 Qúa trình hình thành màng sinh học 2.4 Cấu trúc màng sinh học 10 2.5 Vai trò màng sinh học vi sinh vật tự nhiên 13 2.6 Các phương pháp nghiên cứu hình thành màng sinh học 16 2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thành màng sinh học 20 2.8 Tác hại màng sinh học 22 2.9 Biện pháp kiểm sốt hình thành màng sinh học 23 2.10 Ứng dụng có lợi màng sinh học 23 PHẦN NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1 Đối tượng nghiên cứu 27 3.2 Nội dung nghiên cứu 27 3.3 Địa điểm nghiên cứu 27 3.4 Thời gian nghiên cứu 27 3.5 Nguyên liệu 27 3.6 Phương pháp nghiên cứu 28 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 iii 4.1 Kết phân lập khiết vi khuẩn 32 4.2 Kết nghiên cứu khả sinh trưởng vi khuẩn 35 4.3 Kết định lượng khả sản sinh màng sinh học 37 4.4 Biến động trình sản xuất màng sinh học 39 4.5 Kết nghiên cứu khả đề kháng kháng sinh vi khuẩn hình thành màng sinh học 42 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Kiến nghị 46 Tài liệu tham khảo 48 Phụ lục 55 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CRA Congo Red Agar MIC Minimum inhibitory concentration OD Optical density PBS Phosphate buffered saline PW Peptone water TCP Tissue Culture Plate TM Tube method TSB Tryptic soy broth TW Tryptone water Y Yeast extract v DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Kết phân lập khiết vi khuẩn 35 Bảng 4.2 Kết xác định khả đề kháng kháng sinh 44 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Màng sinh học (biofilm) vi khuẩn Hình 2.2 Một số ví dụ màng sinh học Hình 2.3 Mơ hình phát triển màng sinh học Hình 2.4 Mơ hình cấu trúc màng sinh học hồn chỉnh 11 Hình 2.5 Cấu trúc phân lớp màng sinh học 12 Hình 2.6 Cấu trúc phân lớp màng sinh học 13 Hình 2.7 Vai trò vi khuẩn khơng hoạt động lớp biofilm 14 Hình 2.8 Khả đề kháng với tượng thực bào biofilm 15 Hình 2.9 Phương pháp ống nghiệm nghiên cứu hình thành biofilm 17 Hình 2.10 Phương pháp bổ sung đỏ Congo nghiên cứu hình thành biofilm 18 Hình 2.11 Mức độ sản sinh biofilm thạch bổ sung đỏ Congo 18 Hình 2.12 Dụng cụ cải tiến dùng nghiên cứu biofilm 19 Hình 2.13 Phương pháp slide- band xác định hình thành biofilm 19 Hình 3.1 Các bước nghiên cứu biến động biofilm theo thời gian 30 Hình 3.2 Tóm tắt bước nghiên cứu khả đề kháng kháng sinh 31 Hình 4.1 Kết phân lập vi khuẩn từ mẫu swab 32 Hình 4.2 Kết khiết tụ cầu khuẩn từ mẫu swab 33 Hình 4.3 Hình thái chủng tụ cầu khuẩn khiết 34 Hình 4.4 Đường cong sinh trưởng tụ cầu khuẩn môi trường TSB-Y 36 Hình 4.5 Kết kiểm tra khả tạo màng sinh học 37 Hình 4.6 Màng sinh học nhuộm tím kết tinh 1% (200X) 38 Hình 4.7 Mức tạo màng sinh học tụ cầu khuẩn 39 Hình 4.8 Biến động lượng biofilm sản sinh theo thời gian 40 Hình 4.9 Biến động màu thuốc nhuộm giữ lại lớp biofilm 41 Hình 4.10 Kết thử tính mẫn cảm với kháng sinh 43 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Đức Hạnh Tên Luận văn: Nghiên cứu hình thành màng sinh học (biofilm) tính đề kháng kháng sinh vi khuẩn sản sinh biofilm Ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định khả hình thành màng sinh học (biofilm) vi khuẩn Gram dương phân lập Nghiên cứu khả đề kháng kháng sinh vi khuẩn sản sinh biofilm Phương pháp nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn Staphylococcus spp phân lập đường hô hấp gà nuôi huyện Gia Lâm, Hà Nội số tỉnh lân cận Bắc Giang, Vĩnh Phúc Hải Dương * Nội dung nghiên cứu  Phân lập khiết vi khuẩn  Nghiên cứu khả sinh trưởng vi khuẩn  Định lượng khả sản sinh màng sinh học vi khuẩn  Nghiên cứu biến động trình sản sinh màng sinh học theo thời gian  Nghiên cứu khả đề kháng kháng sinh vi khuẩn hình thành màng sinh học * Nguyên liệu + Môi trường lỏng: tryptone water, tryptic soy broth, peptone water (Merck) + Yeast extract (Oxoid) + Giấy tẩm kháng sinh, kháng sinh bột + Đĩa nhựa 96 giếng vô trùng (SPL Life Sciences) viii + Hóa chất dùng định lượng màng sinh học: methanol, đệm PBS 1x, dung dịch 1% tím kết tinh (crystal violet), dung dịch cồn 80% có bổ sung 5% sodium dodecyl sulfate + Máy đọc ELISA (Biotek, ELx808) * Phương pháp nghiên cứu + Phương pháp phân lập, khiết vi khuẩn + Phương pháp xác định khả sản sinh màng biofilm + Phương pháp nghiên cứu biến động lượng biofilm sản sinh theo thời gian + Phương pháp xác định khả đề kháng kháng sinh Kết kết luận - Có 51,61% số chủng tụ cầu khuẩn phân lập từ đường hơ hấp gà có khả sản sinh màng sinh học (biofilm) mức mạnh, trung bình yếu - Q trình hình thành biofilm có đặc điểm: lớp biofilm sản sinh tăng khoảng đến 20 giờ, sau giảm từ 24 đến 40 - Vi khuẩn nằm màng sinh học đề kháng với nồng độ kháng sinh cao gấp 10 lần 100 lần nồng độ MIC ix giếng có biến động theo thời gian (hình 4.8) Ngược lại, với mẫu xác định hình thành biofilm mức trung bình mạnh (M47.1, M54.3 M49.2) giá trị OD có xu hướng tăng dần khoảng đến 20 giờ, sau giảm (từ 24 đến 40 giờ) Minh họa biến động lượng biofilm theo thời gian (thông qua màu thuốc nhuộm tím gentian giữ lại giếng) trình bày hình 4.9 Đ.c M49.1 M47.1 M54.3 M24.2 M52.2 M49.2 M12 4h 8h 12h 16h 20h 24h 28h 32h 36h 40h Hình 4.9 Biến động màu thuốc nhuộm giữ lại lớp biofilm Trình bày hình 4.9 ảnh chụp đĩa nhuộm biofilm theo thời gian chủng vi khuẩn sản sinh biofilm mức yếu, trung bình mạnh Ở giếng đối chứng (Đ.c) mẫu M12 không giữ màu thuốc nhuộm giếng thời điểm rút mẫu (4 đến 40 giờ) Ngược lại, mẫu M49.2 (hình thành biofilm mạnh) thấy rõ tăng dần màu tím gentian khoảng đến 20 giờ, sau giảm từ 24 đến 40 Như vậy, với kết trình bày hình 4.8 hình 4.9 cho thấy hình thành biofilm trình động phụ thuộc vào thời gian Cũng dễ dàng nhận thấy rằng, lượng biofilm sản sinh không tương quan tỷ lệ thuận với thời gian 41 nuôi cấy tĩnh vi khuẩn (lượng biofilm đạt cực đại sau giảm xuống) Kết (i) giảm theo thời gian chất dinh dưỡng có giếng ni vi khuẩn (ii) song song với q trình tạo màng sinh học ln có tượng phá vỡ phần cấu trúc biofilm để giải phóng vi khuẩn Kết nghiên cứu cơng bố năm 2006 (Holá, 2006), ảnh hưởng thời gian, chất dinh dưỡng nhiệt độ đến hình thành biofilm cho thấy: điều kiện nuôi cấy 25oC vi khuẩn Staphylococcus epidermidis hình thành màng sinh học chậm theo thời gian Ngược lại, 37oC, vi khuẩn hình thành màng sinh học cách nhanh chóng (sau nuôi cấy khoảng 2-4 giờ), lớp màng sinh học hồn chỉnh sau ni cấy từ 12- 14 giờ, sau giảm dần tiếp tục trì từ 3442 Như vậy, kết tương đồng biến động lớp biofilm hình thành theo thời gian Kết nghiên cứu biến động biofilm theo thời gian cịn cho thấy cần thiết phải tìm hiểu đặc điểm hình thành biofilm chủng tụ cầu khuẩn trước thực nghiên cứu định lượng biofilm, thử khả đề kháng kháng sinh lớp biofilm, v.v lớp biofilm hình thành mạnh - yếu thời điểm khác Ở khía cạnh này, nhận xét chúng tơi phù hợp với khuyến cáo trước thời gian nuôi vi khuẩn để nghiên cứu sản sinh biofilm (Stepanovic, 2007) 4.5 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN HÌNH THÀNH MÀNG SINH HỌC Để nghiên cứu ảnh hưởng biofilm tới khả đề kháng kháng sinh, trước hết cần phải tìm loại kháng sinh mà vi khuẩn mẫn cảm Tham khảo sở liệu EUCAST loại kháng sinh mà tụ cầu khuẩn mẫn cảm (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, 2017), tiến hành thử tính mẫn cảm với số loại kháng sinh Kết trình bày tóm tắt hình 4.10 42 Dx (30µg) 20 15 10 Kn (30µg) Ge (10µg) 4 3 2 1 0