Quan sát bằng mắt thường o Quan sát bằng mắt thường ta nhận thấy theo thứ tự nồng độ tăng dần của các ống thì màu xanh của dd cũng đậm dần o Ống số 1 là nhạt nhất và ống số 6 là đậm nh[r]
(1)BÀI THÍ NGHIỆM SỐ XÁC ĐỊNH PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP BRADFORD I NGUYÊN TẮC Tìm hiểu sơ lược protein và Coomasie Brilliant Blue G-250 o Protein Là đại phân tử cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là axít amin Chúng kết hợp với thành mạch dài nhờ các liên kết peptide (gọi là chuỗi polypeptide) Các chuỗi này có thể xoắn cuộn gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác protein Dưới tác dụng các tác nhân vật lý tia cực tím, sóng siêu âm, khuấy học hay tác nhân hóa học axit, kiềm mạnh, muối kim loại nặng, các cấu trúc bậc hai, ba và bậc bốn protein bị biến đổi không phá vỡ cấu trúc bậc nó, kèm theo đó là thay đổi các tính chất protein so với ban đầu Có tính kị nước các gốc kỵ nước các acid amin(aa) chuỗi polipeptit protein hướng ngoài các gốc này liên kết với tạo liên kết kỵ nước o Coomasie Brilliant Blue G-250 Coomassie Brilliant Blue G-250 là hai hình thức hóa học hợp chất triphenylmethane disulfonated Công thức phân tử: C47H50N3O7S2+; Khối lượng phân tử: 833.0458 [g/mol] thường sử dụng loại thuốc nhuộm để phát protein phương pháp điện di gel và Bradford để xác định lượng protein G-250 tạo phản ứng màu với protein (màu xanh),nên nó còn gọi là thuốc nhuộm Coosamie Nhuộm Coomassie Brilliant Blue G- 250 là phương pháp nhuộm phổ biến thường sử dụng phát protein trên gel (2) polyacrylamide (Wilson,1983) Rất dễ phát có khoảng 0,1 – µg protein trên băng Tùy theo hàm lượng protein mà ta có thể thay đổi tỉ lệ thành phần các chất chất nhuộm Đối với Coomassie Brilliant Blue G- 250 nên sử dụng để nhuộm protein có trọng lượng phân tử polypeptide thấp Bản chất phản ứng o Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào thay đổi màu xảy Coomassie Brilliant Blue G – 250 liên kết với protein dung dịch axit Dạng proton hoá thuốc nhuộm Coomassie Blue có màu đỏ da cam Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein Trong môi trường các gốc mang điện tích dương, proton hoá không xảy và có màu xanh xuất o Các protein phản ứng xanh Coomassie hình thành hợp chất màu có khả hấp thụ ánh sáng bước sống 595nm (hấp thụ cực đại bước sống này) Đặc điểm phản ứng o Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein dung dịch.Nồng độ Protein càng cao thì màu xanh càng đậm o Không phụ thuộc vào nồng độ acid amin dung dịch o Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát tới vài g protein/ml.Nhạy phương pháp Lowry gấp lần o Dễ phát và tiết kiệm thời gian o Ít bị ảnh hưởng các chất thường gặp tế bào chẳng hạn muối II THỰC HÀNH Hóa chất cần dùng o Dung dịch mẫu cần xác định o Dung dịch albumin 1mg/ml Cân chính xác 10mg albumin pha loãng 1ml nước cất Lắc cho tan,giữ 20oC để tạo dung dịch có nồng độ 0.1mg/ml o Dung dịch thuốc thử Bradford Coomasie Brilliant Blue G-250 :0.001g Ethanol 990 (3) Acid phosphoric 85% :8.5g Phẩm màu CBB Cách tiến hành thí nghiệm o Bước 1: chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn với nồng độ pha loãng theo bảng sau ống số Dung dịch albumin 0,1mg/ml (ml) Nồng độ albumin (µg) Nước cất (ml) Thuốc thử Bradford 0.1 0.2 0.3 0.4 a 0.5 10 20 30 40 50 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 o Bước 2:sau pha loãng dung dịch với nồng độ xác định ta tiến hành cho dung dịch Bradford vào với thể tích là ml,thực các phản ứng còn lại với các ống cách phút o Bước 3:tiến hành đem các ống nghiệm trên để xác định giá trị OD ống o Bước4 :chuẩn bị mẫu thí nghiệm là enzyme Amilaza,cách tiến hành tương bước trên,sao cho mẫu pha loãng cho trị số đọ quang đo khoảng đường chuẩn o Bước5 :ghi nhận kết và dựa vào giá trị OD để vẽ biểu đồ đường chuẩn III KẾT QUẢ Ống số Chỉ số OD 0.103 0.105 0.108 0.112 0.112 0.112 (4) Quan sát mắt thường o Quan sát mắt thường ta nhận thấy theo thứ tự nồng độ tăng dần các ống thì màu xanh dd đậm dần o Ống số là nhạt và ống số là đậm Dựa vào kết đo hấp thụ (OD) bước sống 595nm o Nồng độ albumin càng cao thì giá trị OD càng lớn IV.PHẦN MỞ RỘNG o Protein sau tách chiết và làm có thể định lượng o Nếu protein là enzyme thì định lượng thông qua xác định hoạt độ enzyme,một đơn vị hoạt độ enzyme là lượng enzyme tham gia chuyển hóa mol chất phút điều kiện tiêu chuẩn o Protein xem là nững bước tách chiết và làm không làm tăng hoạt độ riêng chúng đó thì quá trình tách chiết và làm hoàn thiện Phần lớn các phương pháp xác định gián tiếp protein dựa trên sở xác định lượng nitrogen –phương pháp Kjeldahl o Nguyên lí phương pháp này là vô hóa H2SO4 đậm đặc và xúc tác.dùng kiềm mạnh(NaOH,KOH) đẩy NH3 từ muối ( NH4)2SO4 sau đó hứng NH3 vào dung dich có nồng độ xác định để chuẩn độ acid dư.Từ đó tính lượng Nitrogen có nguyên liệu o Ưu điểm: Phương pháp này có khả ứng dụng cho hầu hết các loại mẫu Mẫu thực phẩm: thuỷ hải sản, nước mắm, các loại đậu, thức ăn nuôi tôm cá, rau quả… Đất, nước thải Bã men bia, bánh dầu đậu nành, bánh dầu cao su… o Những yếu tố làm ảnh hưởng đến kết phân tích: Nồng độ HCl 0,25N không đảm bảo chính xác Lấy mẫu không đại diện (5) Cân mẫu không chính xác Nguồn nước bị nhiễm N Định lượng Protein phương pháp Lowry o Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng màu protein và thuốc thử Folin, cường độ màu dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ protein, và dựa vào đường chuẩn protein, có thể tính hàm lượng protein mẫu nghiên cứu o Ưu điểm: Được sử dụng rộng rãi để xác định nhiều loại protein khác Có độ nhạy cao cho phaeps xác định protein nồng độ 1g/ml o Nhược điểm: Cường độ màu còn phụ thuộc nhiều vào loại protein Nhiều chất khác có thể làm ảnh hưởng tăng giảm nồng độ màu vì phương pháp này chính xác quá trình chiết tách protein đảm bảo tinh khiết Định lượng Protein phương pháp quang phổ o Nguyên tắc: Phát và đo protein.các protein hấp thụ cực đại các tia cực tím bước sống 280nm và độ hấp thu thay đổi theo loại protein o Ưu điểm: Phương pháp đơn giản để đo nồng độ protein dung dịch là độ hấp thụ tia cực tím nó o Nhược điểm: Phụ thuộc nhiều vào đọ protein.Nếu protein tinh thì nồng độ tuyệt đối nó tính theo giá trị đo Nếu protein không tinh thì nồng độ protein tổng số tính tương đối từ độ hấp phụ Không dùng cho các dung dịch có nồng đọ protein thấp 0.1mg/ml có mặt nhiều chất khác mà cùng hấp thụ vùng cực tím protein dd dạng huyền phù Định lượng Protein phương pháp Dumas o Nguyên tắc: Phương pháp đốt cháy Dumas để xác định protein thô Quy trình dùng thiết bị lò điện đun nóng mẫu phân tích lên đến 600oC lò phản ứng bịt kín với diện oxy Hàm lượng nitơ khí đốt sau đó đo cách dùng máy dò dẫn nhiệt Mỗi lần xác định cần khoảng phút (6) V BIỆN LUẬN (7)