5 cac phuong phap xac dinh protein 6tpw

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ******* BÁO CÁO HĨA SINH THỰC PHẨM CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH PROTEIN Nhóm 28 - Lớp HC04TP2 GVHD: ThS Tơn Nữ Minh Nguyệt MỤC LỤC ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG NHỮNG PHẢN ỨNG ĐẶC TRƯNG A Cơ sở xác định phản ứng B Phản ứng Biure C Phương pháp Lowry D Một số phản ứng màu khác .6 E Phản ứng Xiorenxen F Phương pháp Van-Slyke XAÙC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP VẬT LÝ A Phương pháp quang phổ B Tính khuếch tán XÁC ĐỊNH PROTEIN DỰA VÀO KHẢ NĂNG TẠO TỦA CỦA NÓ 10 XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ DINH DƯỢNG CỦA PROTEIN 13 A Chỉ số sinh học : TD, BV, PER, NPU, NDp Cal %, NPR .13 B Chỉ số hoá học : CS 17 XÁC ĐỊNH NHU CẦU PROTEIN TRONG CƠ THỂ 18 A Phương pháp Bilăng 18 B Phương pháp tính phần18 ĐỊNH TÍNH-ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG NHỮNG PHẢN ỨNG ĐẶC TRƯNG A CƠ SỞ XÁC ĐỊNH PHẢN ỨNG  Axitamin đơn vị cấu tạo sở peptit protein, axitamin kết hợp với qua liên kết peptit(-CONH-)tạo thành peptit có chiều dài mạch khác nhaugọi polypeptit,một phân tử protein có hay nhiều chuổi polypeptit  Như thông qua liên kết peptit, gốc axitamin , nhóm - amin tự đầu N chuỗi polypeptit ta có phản ứng màu đặc trưng thường dùng để định tính định lượng protein B PHẢN ỨNG BIURÊ (PHẢN ỨNG ĐẶC TRƯNG CỦA LIÊN KẾT PEPTIT) Nguyên tắc + Trong môi trường kiềm mạnh ,liên kết peptit phân tử protein phản ứng với CuSO4 tạo phức chất màu tím tím đỏ dạng anion + Phản ứng tạo phức có màu bền ,ổn định ,dùng để định lượng protein  Protein (có từ liên kết peptit trở lên) + Cu2+ -> tạo phức màu xanh tím.(phản ứng coi dương tính có màu tím rõ Cách tiến hành Cần chuẩn bị THUỐC THỬ : Các dung dịch protein axitamin: Dung dịch protein trứng 0,1% Dung dịch gelatin 0,1% Dung dịch glycin 0,1% Thuốc thử Biure (pha theo Gornall) CuSO4.5H2O 1.5g Nước cất 500ml Hoà tan KI 1g NaOH 10% 300ml Na, K tartrat 6g Bảo quản lọ pyrex hay polyethylen, đậy nút kín TIẾN HÀNH  Trong ống nghiệm - Dung dịch protein trứng 0,1% (giọt) 10 - Dung dịch gelatin 0,1% 10 (giọt) 10 - Dung dịch glycin 0,1% (giọt) 10 10 10 - Thuốc thử biure (giọt)  Lắc đều, phản ứng coi dương tính có màu tím rõ rệt Chú ý: + Chỉ chất có từ liên kết peptid trở lên cho phản ứng này(axitamin dipeptit phản ứng Biure) + Phức hợp màu có phổ hấp thụ cực đại bước sóng 540nm độ đậm màu (mật độ quang ) tỷ lệ thuận với nồng độ protein + Độ nhạy phản ứng tăng thêm vào thuốc thử Folin-Ciocalteau.Hiện , người ta cải tiến phản ứng Biurê thành phản ứng Micrôbiure để làm tăng độ nhạy phản ứng lên hàng chục lần + Bằng phương pháp ta định lượng protein tổng số , albumin , globulin , fibrinogen huyết Phản ứng tạo phức màu : C PHẢN ỨNG VỚI THUỐC THỬ FOLIN -CIACALTEAU(PHƯƠNG PHÁP LOWRY)-PHẢN ỨNG ĐẶC TRƯNG CỦA MỘT HAY MỘT SỐ GỐC AXITAMIN Nguyên tắc Tính hàm lượng protein nghiên cứu dựa vào đường chuẩn protein phản ứng màu protein với thuốc thử Folin-Ciocalteau.Cường độ màu dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ protein Thuốc thử : + Dung dịch protein chuẩn coù 10 –100 g protein coù 1ml + Protein hoà tan dung dịch NaCl 0,9% với lượng protein 1ml coù 10 , 20 , 30 , 40 , 80 , 100 g protein Dung dòch chuẩn thường dùng tinh thể albumin huyết bò + Dung dòch A : dung dich Na2CO3 2% NaOH 0,1N + Dung dòch B1 : dung dòch CuSO4 1% + Dung dịnch B2 : dung dịch muối Seignett 2% ( Kali tactarat ) + Dung dòch C Dung dòch B1 Dung dòch B2 ml Dung dòch A 0,5 ml 0,5 50 + Dung dòch D :dung dòch Folin 0,1 N Dung dịch D Nước cất NaWO4 2H2O NaMoO4 2H2O Acid H3PO4 85% HCl đậm đặc Li2SO4 H2O gioït Brom 700ml 100g 25g 50ml 100ml 150g Cách tiến hành + Lấy 1ml dung dịch protein nghiên cứu cho vào ống nghiệm , thêm ml dung dịch C Lắc , để nhiệt độ phòng 10 phút + Tiếp tục cho thêm 0,5 ml dung dịch D , lắc ,ø để 30 phút đo máy so màu bước sóng 750 nm Chú ý + Giai đoạn đầu thực phản ứng Biure, sau thêm Folin-Ciocalteau tạo thành phức xanh + Thuốc thử Folin-Ciocalteau chủ yếu gồm:Natri molypñat (NaMoO4), Natri wonframat (NaWO4) , Liti sunfat (LiSO4) + Tác dụng thuốc thử :tăng độ nhạy phản ứng Biurê ,phản ứng với gốc Tyrosin Trytophan phân tử prôtêin tạo phức chất màu xanh da trời hấp thụ cực đại bước sóng 750nm  Đối với loại prôtein , cường độ màu dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ protein Còn protein với nhau, cường độ màu phụ thuộc vào loại protein(VD:cùng nồng độ ,cường độ màu tripxin, hemoglobin,gelatin theo thứ tự giảm dần),do để kết xác protein phải qua tinh nhiều + Một số chất tăng cường độ màu: phenol, purin, pirimidin, axit uric, nhóm-SH,1 số ion kim loại…Lí :chúng phản ứng với Folin-Ciocalteau + Một số chất làm giảm cường độ màu:etanol, ete có nồng độ cao 5%, axeton, Ba(OH)2 có nồng độ cao 1%, Cl3COOH, HClO4 trung hoà  Ưu điểm phương pháp này: độ nhạy cao, phát protein dung dich nồng 1g/cm3 D MỘT SỐ PHẢN ỨNG MÀU KHÁC  Phản ứng với axit piric: Đun dung dịch protein với axit piric Na2CO3 có màu cam đỏ, phản ứng đặc trưng cho prôtein có vòng dixentopiperazin  Phản ứng Xantoprotein: Axit nitric đậm đặc tác dụng với protein có màu vàng (do protein có axit amin có vòng thơm : fenylalanin , tyrozin , typtofan)  Phản ứng Millon: Đặc trưng cho cò mặt tyrosin, thuốc thử Millon(Hg-NO3+HNO3) cho muối thuỷ ngân có màu đỏ  Phản ứng Paulli: Thuốc thử diazo dung dịch kiềm prôtein có màu đỏ da cam , phản ứng đặc trưng tyrosin , histidin có protein  Phản ứng Adamkevic: Cho axit axetic đậm đặc vào dung dịch protein , sau cho thêm giọt H2SO4 đậm đặc theo ống nghiệm giới hạn chất lỏng có màu tím đỏ, phản ứng đặc trưng cho tryptopan có protein  Phản ứng Sacaguichi: Dung dịch protein tác dụng với hyporo-bromit Na vàø-naptol dung dịch có màu đỏ anh đào,phản ứng đặc trưng cho có mặt arginin phân tử protein E PHẢN ỨNG CỦA NHÓM AMIN VỚI FOMALDEHIT (PHẢN ỨNG XIORENXEN )  đánh giá mức độ thuỷ phân protein Phản ứng để nhận biết: fomaldehit phản ứng với nhóm amin tạo thành dẫn xuất mêtilen axitamin theo phản ứng sau: R CH H2O COOH NH2 + HC = O R CH H COOH + N = CH  nhóm amin bị khoá nên chuẩn độ axitamin kiềm, từ tính số nhóm amin F PHƯƠNG PHÁP VAN-SLYKE Căn vào lượng Nitơ thoát ,có thể định lượng axitamin protein dung dòch R CH COOH N + H2 O OH + HNO R- CH - COOH + OH CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH PROTEIN DỰA VÀO TÍNH CHẤT VẬT LÝ A PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ Nguyên tắc + Dựa vào tính chất quang học protein:protein có khả hấp thu tia cực tím Quang phổ thu phụ thuộc vào axitamin có vòng phenylalanin , tyrozin , trytophan phân tử protein + Nếu protein tinh nồng độ tuyệt đối tính theo giá trị đo Nếu protein không tinh nồng độ protein tổng tính cách tương đối Cách tiến hành + Li tâm mẫu loại phân tử phức hợp khác thể huyền phù + Đặt bước sóng 280nm máy quang phổ điều chỉnh độ hấp thụ với cuvet chứa đệm + Tính tỉ số hấp thu 206 -280nm  tỉ số < 0.6 : protein không lẫn axit nucleic Nồng độ mẫu = Độ hấp thu 280nm Hệ số tắt 280nm 10 mg/l Nồng độ 1,55 ( độ hấp thụ 280nm ) mẫu = (độ hấp thụ 260nm ) HAY - 0,77 10 Chú ý : + Không dùng với chất có nồng độ protein thấp ( N thải : thể tích luỹ Nitơ Bilăng ( - ) : N ăn vào < N thải : thể Nitơ Bilăng cân : N ăn vào = N thải : thể không tích luỹ không Nitơ  Người ta tìm thấy nhu cầu protein cách điều chỉnh lượng protein ăn vào bilăng Nitơ cân Tuy nhiên, thể khó xây dựng Nitơ cân lượng Nitơ ăn vào khác ( VD : người trưởng thành có bilăng Nitơ cânn với phần ăn có 60g protein, chuyển sang chế độ ăn 80g/ngày, bilăng trở lại cân sau ngày) 23  Người ta ước tính nhu cầu tối thiểu protein : 1g/kg cân nặng/ngày  Phương pháp tính phần  Phương pháp xác định lượng Nitơ không tránh khỏi điều kiện chế độ ăn protein hạn chế, dùng để trì , nhu cầu cho phát triển , chống đỡ kích thích Lượng Nitơ không tránh khỏi gồm:  Lượng Nitơ theo nước tiểu ngoài, tính cách theo dõi lượng Nitơ đào thải theo nước tiểu chế độ ăn đủ calo protein ( 37 mg N/kg trọng lượng thể)  Khi ăn chế độ protein thể Nitơ theo phân enzim, tế bào ruột ( 12 mgN/kg trọng lượng thể)  Nitơ qua da, móng, tóc chế độ ăn bình thường điều kiện môi trường bình thường ( -8mg/kgtrọng lượng thể )  Nitơ theo đường hô hấp, nước mũi, tinh dịch, kinh nguyệt… (nữ: 3mg, nam 2mg/kg trọng lượng thể)  Như tổng lượng Nitơ không tránh khỏi lên đến 54mgN/kg  Để tính lượng protein thức ăn đảm bảo cho việc thay protein thể, ta làm sau : Hàm lượng protein thức ăn xác định việc đo hàm lượng Nitơ đó.Hàm lượng Nitơ protein tương đối ổn định-chiếm khoảng 16% Do đó: Hàm lượng protein=(hàm lượng Nitơ đo thức ăn) ( 6,25) Bảng hệ số qui đổi hàm lượng Nitơ thức ăn Protein thức ăn Hệ số Protein thức ăn Hệ số 24 Gạo tẻ Ngô Vừng Đậu nành Nhu cầu thực tế = 5.95 6.25 5.30 5.71 Lạc 5.46 Trứng thịt 6.25 loại 6.38 Sữa Nhu cầu theo protein chuẩn NPU protein ăn vào 25 ... lượng protein= (hàm lượng Nitơ đo thức ăn) ( 6, 25) Bảng hệ số qui đổi hàm lượng Nitơ thức ăn Protein thức ăn Hệ số Protein thức ăn Hệ số 24 Gạo tẻ Ngô Vừng Đậu nành Nhu cầu thực tế = 5. 95 6. 25 5.30... dòch A 0 ,5 ml 0 ,5 50 + Dung dòch D :dung dòch Folin 0,1 N Dung dịch D Nước cất NaWO4 2H2O NaMoO4 2H2O Acid H3PO4 85% HCl đậm đặc Li2SO4 H2O gioït Brom 700ml 100g 25g 50 ml 100ml 150 g Cách tiến... tây 67 Ngô 60 64 Protein Giá trị sinh học Protein trứng gà 83 85 Sữa bò tách bơ 83 Cá 76 Đậu nành chín Thịt bò 74 Lạc 59 Thịt lợn  Tỉ lệ tận Utilization): dụng protein (NPU-Net protein  Tỉ lệ