ÌM HIỂU sự KHÁC NHAU về các CHỈ TIÊU SINH lý và SINH hóa GIỮA các DÒNG VI KHUẨN edwardsiella ictaluri xác ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH hóa TRUYỀN THỐNG và API 20e

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG TÌM HIỂU SỰ KHÁC NHAU VỀ CÁC CHỈ TIÊU SINH LÝ VÀ SINH HĨA GIỮA CÁC DỊNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH THỐNG VÀ API Trung tâm Học liệu ĐHHÓA CầnTRUYỀN Thơ @ Tài liệu học tập 20E nghiên cứu L LU UẬ ẬN NV VĂ ĂN NT TỐ ỐT TN NG GH HIIỆ ỆPP Đ ĐẠ ẠII H HỌ ỌC C N NG GÀ ÀN NH HN NU UÔ ÔII T TR RỒ ỒN NG GT TH HỦ ỦY Y SSẢ ẢN N C CH HU UY YÊ ÊN NN NG GÀ ÀN NH HB BỆ ỆN NH HH HỌ ỌC CT TH HỦ ỦY Y SSẢ ẢN N 2008 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG TÌM HIỂU SỰ KHÁC NHAU VỀ CÁC CHỈ TIÊU SINH LÝ VÀ SINH HĨA GIỮA CÁC DỊNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA TRUYỀN THỐNG VÀ API 20E Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu L LU UẬ ẬN NV VĂ ĂN NT TỐ ỐT TN NG GH HIIỆ ỆPP Đ ĐẠ ẠII H HỌ ỌC C N G À N H N U Ô I T R Ồ N G T H Ủ Y S Ả N NGÀNH NUÔ I TRỒNG THỦY SẢN C CH HU UY YÊ ÊN NN NG GÀ ÀN NH HB BỆ ỆN NH HH HỌ ỌC CT TH HỦ ỦY Y SSẢ ẢN N CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH NGUYỄN THỊ TIÊN 2008 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Được làm luận văn tốt nghiệp mong muốn nhiều sinh viên, có thân tơi Tuy nhiên để hồn thành luận văn trình phấn đấu, phải nhiều thời gian công sức để nghiên cứu, đồng thời phải hướng dẫn nhiệt tình thầy Lời xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa thủy sản trường Đại Học Cần Thơ, đặc biệt thầy cô môn sinh học bệnh thủy sản truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báo thời gian theo học nghiên cứu trường Xin cám ơn gia đình động viên giúp đỡ không vật chất mà tinh thần từ bước chân vào trường Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Đặng Thị Hồng Oanh chị Nguyễn Thị Tiên tận tình giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Xin gởi lời cám ơn đến Nguyễn Thị Thu Hằng thầy Đồn Nhật Phương Trung liệu ĐH Cần @ gian Tàilàm liệu tập nhiệttâm tình Học quan tâm động viên trongThơ suốt thời cố học vấn học tập.và nghiên cứu Đồng thời xin gởi lời cám ơn đến tập thể lớp nuôi trồng bệnh học thủy sản K30 động viên, hỗ trợ suốt thời gian học tập trường i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT Chủng vi khuẩn tham khảo E223 với chủng C1, C2 phân lập trực tiếp từ cá bệnh chủng tủ âm khoa thủy sản CAF258, CAF255, 2B1, 3B3 sử dụng cho việc dịnh danh vi khuẩn phương pháp sinh hóa truyền thống kiểm tra API 20E Sau phục hồi TSA tiến hành test tiêu gồm Tất chủng có đặc điểm vi khuẩn E ictaluri dạng hình que, gram âm, cho phản ứng oxidase âm tính, có khả lên men oxi hóa đường glucose, khơng có khả sinh khí H2S khơng tạo sản phẩm indole Hầu hết tiêu giống phương pháp Đề tài tiến hành điện di, kết sản phẩm PCR có diện vi khuẩn E ictaluri tất hện vạch vị trí 407pb Chọn ngẫu nhiên chủng CAF258, E223, 3B3, C1 C2 tiến hành gây cảm nhiễm Kết bể CAF28, C1 C2 cá có xuất dấu hiệu bệnh lý Sau tái phân lập tái định danh tất chủng có đặc điểm giống chủng ban đầu, cho kết PCR giống (hiện vạch 407 bp) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v Chương I : Giới thiệu Chương II: Lược khảo tài liệu 2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh cá 2.2 Tình hình ni dịch bệnh cá tra ĐBSCL 2.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh cá da trơn 2.31 Bệnh xuất huyết Trung tâm liệu Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên5cứu 2.3.2 BệnhHọc mủ gan trênĐH cá tra 2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp Chương III: Nội dung phương pháp nghiên cứu 11 3.1 Thời gian địa điểm 11 3.1.1 Thời gian 11 3.1.2 Địa điểm 11 3.2 Nội dung thực 11 3.3 Vật liệu thiết bị nghiên cứu 11 3.3.1 Vật liệu 11 3.3.2 Thiết bị 11 3.4 Thuốc thử, môi trường dùng cho nghiên cứu 12 3.3.4 Số chủng vi khuẩn cần thiết 12 3.5 Phương pháp nghiên cứu 13 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.5.1 Số chủng vi khuẩn cần thiết 13 3.5.2 Nguồn vi khuẩn 13 3.5.3 Phương pháp phục hồi nuôi tăng sinh vi khuẩn 14 3.5.4 Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống 14 3.5.5 Định danh vi khuẩn kit API20E 15 3.5.6 Phương pháp PCR 16 3.5.7 Thí nghiệm gây cảm nhiễm 17 Chương IV: Kết quả- thảo luận 19 4.1 Phương pháp sinh hóa truyền thống 19 4.2 Kết test API 21 4.3 Kết định danh vi khuẩn PCR 23 4.4 Kết gây cảm nhiễm tái định danh vi khuẩn 24 4.5 Thảo luận 28 Chương V: Kết luận – Đề xuất 32 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 5.1 Kết luận 32 5.2 Đề xuất 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 3.1: Nguồn gốc dòng vi khuẩn sử dụng cho đề tài 13 Bảng 3.2: Bảng test tiêu sinh hóa vi khuẩn 14 Bảng 3.3: Các tiêu hình thái, sinh lý sinh hóa vi khuẩn xác định kít API 20E 15 Bảng 3.4: Thành phần hóa chất thực phản ứng PCR 16 Bảng 4.5: Kết phân tích tiêu hình thái, sinh lý sinh hóa chủng vi phương pháp sinh hóa truyền thống 19 Bảng 4.6: Kết phân tích tiêu hình thái, sinh lý sinh hóa chủng vi kit API 20E 22 Bảng 4.7: Kết phân tích tiêu hình thái, sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm cảm nhiễm phương pháp sinh hóa truyền thống 26 Trung tâm liệu @ Tài liệulýhọc tậphóavàcácnghiên Bảng 4.8: Học Kết phânĐH tíchCần chỉThơ tiêu hình thái, sinh sinh chủng cứu vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm cảm nhiễm kít API 20E 27 Bảng 4.9: Các đặc điểm khác loài E ictaluri với lồi khác thuộc nhóm Enterobacteriaceace (OIE, 2003) 29 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 3.1: Các bước chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm 18 Hình 4.2: Hình nhuộm gram vi khuẩn E ictaluri 20 Hình 4.3: Khả lên men oxi hóa đường glucose E ictaluri 20 Hình 4.4: Kết âm tính với indole cua vi khuẩn E ictaluri 21 Hình 4.5: Khả thủy phân ornithine lysine E ictaluri 21 Hình 4.6: Kết test API vi khuẩn E ictaluri 23 Hình 4.7: Kết điện di sản phẩm PCR chủng vi khuẩn E ictaluri 23 Hình 4.8: Thận cá tra nhiễm dòng vi khuẩn CAF258 25 Hình 4.9: Dấu hiệu bên ngồi cá tra gây cảm nhiễm dịng E ictaluri 25 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƯƠNG I GIỚI THIỆU Một bảy vùng kinh tế quan trọng nước Đồng Bằng Sơng Cửu Long (ĐBSCL) có nhiều điều kiện tự nhiên thuận lợi cho nuôi trồng thủy sản phát triển Trong năm gần nuôi trồng thủy sản đóng góp đáng kể vào kim ngạch xuất Việt Nam, tạo công ăn, việc làm, tăng thu nhập, xóa đói giảm nghèo cho vùng nơng thôn Nổi bật nghề nuôi cá tra đối tượng dễ nuôi, mau lớn, chất lượng thịt ngon, có khả thích ứng cao với điều kiện môi trường khắc nghiệt Năm 2006, sản lượng cá tra nuôi ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất 292.800 tấn, thu kim ngạch xuất 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất thủy sản nước (www.fistenet.gov.vn) Trung Tuy nhiên diện tích ni mở rộng, nghề ni thâm canh hóa ni với mật độ cao vấn đề dịch bệnh xảy thường xuyên gây thiệt hại nhiều Có thể nói năm gần nghề ni thủy sản phải đương đầu với tình trạng dịch bệnh bùng nổ suy thoái mơi trường lây lan mầm bệnh Trong bệnh truyền nhiễm mà bệnh vi khuẩn gây thiệt hại nghiêm trọng đến suất tâmsảnHọc liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu lượng cá nuôi với bật bệnh mủ gan gây thiệt hại không nhỏ kinh tế cho nhiều hộ nuôi Các kết nghiên cứu gần xác định bệnh mủ gan vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra, bệnh xảy cá tra nuôi tất giai đoạn, tỉ lệ hao hụt lên đến 90% (Nguyễn Quốc Thịnh ctv, 2003) Hiện phương pháp xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh cá tra phổ biến phương pháp sinh hóa sử dụng phương pháp kiểm tra xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa truyền thống sử dụng kit API 20E Tuy nhiên, chưa có thơng tin đồng hay sai khác xác định đặc tính sinh lý sinh hóa hai phương pháp định danh vi khuẩn E ictaluri Đề tài “Tìm hiểu khác tiêu sinh lý, sinh hóa dịng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri xác định phương pháp sinh hóa truyền thống sử dụng kít API 20E” thực nhằm tìm tiêu sinh hóa giống khác sử dụng hai phương pháp nêu trên, góp phần vào việc chuẩn hóa phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn E ictaluri gây cá tra LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Mục tiêu nghiên cứu So sánh tiêu sinh lý sinh hóa dịng vi khuẩn E ictaluri xác định phương pháp sinh hóa truyền thống sử dụng kit API 20E Nội dung nghiên cứu  Xác định tiêu sinh lý sinh hóa dịng vi khuẩn E ictaluri xác định phương pháp truyền thống  Xác định tiêu sinh lý sinh hóa dịng vi khuẩn E ictaluri kit API 20E  Xác định kết định danh phương pháp PCR Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.5 Thảo luận Đề tài thực với nội dung tìm hiểu tiêu sinh hóa khác sử dụng phương pháp sinh hóa truyền thống sử dụng kít API 20E Nhìn chung hầu hết tiêu giống sử dụng hai phương pháp Tuy nhiên, có sai khác số tiêu ornithine dương tính phương pháp sinh hóa truyền thống âm tính kít API 20E Theo ghi nhận từ nhiều tài liệu tiêu ornithine có nhiều biến đổi Cụ thể năm 1986, Waltmam ctv tiến hành kiểm tra 119 dịng E ictaluri có 100 dịng cho phản ứng dương tính với ornithine cịn lại 19 dịng cho phản ứng âm tính Trong Hawke (1979) tiến hành định danh vi khuẩn E ictaluri cá nheo Mỹ kết số tiêu axit amin có lysine dương tính cịn arginine ornithine âm tính Như tiêu acid amin E ictaluri tiêu ornithin có âm tính, có dương tính Trung Năm 2007, Lê Minh Đương tiến hành gây cảm nhiễm cá tra dòng vi khuẩn E223, sau tái phân lập vi khuẩn từ máu, lớp nhớt da, mang, não, gan, thận, tỳ tạng, tim kiểm tra kít API 20E thấy ngồi tiêu glucose lysine citrate cho phản ứng dương tính Trong hànhliệu gây cảm phân @ lập ởTài cá quanhọc tươngtập tự đối dòng vi cứu tâmtiến Học ĐHnhiễm CầnvàThơ liệu vàvới nghiên khuẩn EHO2 lại có kết âm tính với citrate Như tiêu citrate giống ornithin biến đổi chủng vi khuẩn E ictaluri Năm 2002, Từ Thanh Dung ctv dùng kít API 20E cho việc định danh vi khuẩn E ictaluri phân lập cá tra hai tỉnh An Giang Cần Thơ Ngoài đặc điểm lysine glucose dương tính lồi E ictaluri phân lập nơng hộ cịn có thêm khả sử dụng urea, tiêu khác so với kết đề tài Các kết nghiên cứu Buller (2004), Hawke (1979) hầu hết tiêu urea âm tính Ngày API phương pháp phổ biến việc định danh vi khuẩn đặc biệt loài vi khuẩn gram âm Nếu so sánh API sinh hóa truyền thống mà khơng nói độ xác kết dễ dàng nhận thấy API chấp nhận nhiều không nhiều thời gian, công sức mà lại cịn cho kết nhanh chóng Nếu xét riêng phương pháp kít API hay phương pháp sinh hóa truyền thống có ưu nhược điểm riêng Xét mặt thời gian phương pháp sinh hóa truyền thống cho kết chậm hơn, thao tác thực phức tạp dễ bị tạp nhiễm Bộ kít API cho kết nhanh, đơn giản, dễ làm có sẵn kít thuốc thử nên không cần phải nhiều thời gian cho việc chuẩn 28 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com bị Tuy nhiên, chi phí sử dụng kít cao kít API thiết kế cho việc định danh vi khuẩn người, với nhiệt độ thể 37C, ứng dụng vào thủy sản cho nhóm E ictaluri (nhiệt độ tối ưu để chúng phát triển 28C) tính xác phân tích phải lưu ý Kết kiểm tra sinh hóa kiểm tra API dường khẳng định qua phát triển chủng vi khuẩn môi trường Edwarrdsiella ictaluri agar, môi trường dinh dưỡng đặc trưng cho loài vi khuẩn này, với thành phần thích hợp, có E ictaluri mọc mơi trường Sau ngày phát triển 28 0C, vi khuẩn tạo khuẩn lạc nhỏ, khơng nhân, rìa có dạng khơng đồng Trong nhóm Enterobacteriaceace đặc điểm dễ nhận biết để phân biệt E ictaluri với nhóm khác chỗ tất tiêu âm tính, vài tiêu dương tính Theo thống kê OIE (2006) số loại đường gồm malonate, arabinose, trehalose, mannitol, sucrose E ictaluri khơng có khả tạo axit từ loại đường Kết giống với kết test sinh hóa chủng E ictaluri đề tài, nhiên điều kiện không cho phép nên đề tài chưa tiến hành phân tích tiêu malonate Trung Bảng 4.9: Các đặc điểm khác loài E ictaluri với loài khác thuộc (OIE,học 2003).tập nghiên tâm Học liệu ĐHnhóm CầnEnterobacteriaceace Thơ @ Tài liệu Chỉ tiêu D- Mannitol Sucrose Trehalose Arabinose Malonate Indole H2S Motility Citrate Yersinia ruckeri + + + Hafnia alvei + + + d + - E tarda + + + + + + E hoshinae + + + (-) + + (+) cứu E ictaluri -** - ** Di động yếu 28C (Hawke, 1979) -: âm tính +: dương tính d: âm tính dương tính Trong nhóm Enterobacteriaceace cho thấy loài E ictaluri E tarda thường quan tâm nhiều đối tượng gây tổn thất lớn cho nghề nuôi cá Tuy nhiên E tarda loài vi khuẩn phát triển tốt vùng nước ấm, theo OIE (2006) chúng phát triển 42C, Việt Nam vùng khí hậu nhiệt đới nên nhìn chung chưa thấy xuất loại vi khuẩn Các kết nghiên 29 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com cứu thường tiến hành so sánh đặc điểm sinh hóa hai lồi OIE đưa kết luận phân biệt E ictaluri với E tarda dựa vào tiêu indole H2S, E tarda có khả sinh indole H2S E ictaluri khơng Ngồi E tarda phát triển 42C di động 37C Định danh E ictaluri phương pháp sinh hóa truyền thống kít API 20E phương pháp phổ biến nhiều người thực Dùng phương pháp cho kết nhiên phương pháp kiểm tra truyền thống nhiều thời gian dùng kít API cần vài ngày Cái đề tài với phương pháp PCR cần khoảng ngày nhanh chóng phát E ictaluri, mà kết lại xác lồi vi khuẩn bắt cặp với mồi vạch vị trí 407 bp Trung Kết nghiên cứu đề tài cho phép phân biệt E ictaluri với loài khác dựa vào số đặc điểm là: vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, di động yếu khơng di động, oxidase âm tính, catalase dương tính, đặc biệt khơng tạo sản phẩm indole H2S Vì sau làm việc với E ictaluri ta không thiết phải dùng kít API, khơng cần kiểm tra tất tiêu kít có sẵn, chẳng cần nhiều thời gian cho việc định danh vi khuẩn sinh hóa truyền thống mà điều quan trọng phải kiểm tra tâmtiêu Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu gồm nhuộm gram, di động, oxidase, catalase, đặc biệt phải thử sản phẩm H2S indole, điểm quan trọng để phân biệt E ictaluri E tarda Nếu tiêu giống đặc điểm E ictaluri, ta tiến hành kiểm tra xác lại phản ứng PCR Với cách làm tiết kiệm nhiều thời gian chi phí, từ kết kiểm tra tiêu sinh hóa PCR cho phép phát nhanh sớm mầm bệnh dạng tiềm ẩn Đây hướng việc chẩn đoán nhanh bệnh mủ gan cá tra nuôi, nghi ngờ ao ni nhiễm bệnh khơng phải đợi đến bệnh bộc phát mà chẩn đốn sớm Nếu dùng phương pháp sinh hóa truyền thống khoảng tuần, kít API cho kết khoảng ngày dùng PCR cần khoảng ngày cho việc ly trích mẫu chạy PCR mà kết dễ chấp nhận Tuy nhiên phương pháp phải thời gian đầu cho việc kiểm tra tiêu 30 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phân lập vi khuẩn TSA/NA Khuẩn lạc màu trắng khơng nhân, rìa có dạng không đồng sau 24-48h Nhuộm Gram Gram dương Gram âm, hình que ngắn Oxidase âm tính, catalese dương tính Oxidase dương tính Di động yếu khơng di động 37 ∙C Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Không tạo sản phẩm indole H2S âm tính Chạy PCR, vạch 407pb Edwarsiella ictaluri Đề xuất quy trình định danh E ictaluri gây bệnh mủ gan cá tra 31 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƯƠNGV KẾT LUẬN- ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Kết kiểm tra sinh hóa truyền thống khơng khác nhiều so với kết nghiên cứu trước Kết test API 20E khơng có khác chủng So sánh kết test sinh hóa truyền thống test API nhìn chung khơng khác ngồi tiêu ornithin chủng E223, 3B3, CAF258, C1 C2 chọn ngẫu nhiên để gây cảm nhiễm Tiến hành tái phân lập tái định danh chủng CAF258, C1, C2 cho kết giống với đặc điểm chủng vi khuẩn ban đầu Riêng bể E223 3B3 sau 10 ngày theo dõi không thấy có biểu lạ khơng tìm thấy xuất vi khuẩn thận, tỳ tạng máu Kết PCR khẳng định chủng vi khuẩn CAF258, E223, 3B3, C1 C2 Edwardsiella ictaluri (hiện vạch 407bp) Điều kiện không cho phép nên chưa tiến hành chạy PCR chủng CAF255 2B1 Đề xuất Trung tâm5.2Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Áp dụng phương pháp PCR phát sớm E ictaluri gây bệnh mủ gan cá tra Dùng PCR phát đồng thời loại vi khuẩn Flavobacterium columnare (504bp), Edwardsiella ictaluri (407bp), Aeromonas hydrophila (209bp) 32 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO A.del Cerro, I Marquez, J.A.Guijarro, 2002 Simultaneous Detection of Aeromonas salmonicida, Flavobacterium psychrophilum and Yersinia ruckeri, Three Major Fish Pathogens, by multiplex PCR Baldwin T.J and J.C Newton, 1993 Pathogenesis of Enteric septicemia of Channel catfish, caused by Edwardsiella ictaluri: Bacteriologic and light and electron microscopic finding Journal of Aquatic Animal Health 1993;5:189-198 Barrow, G I and R K A Feltham 1993 Cowan and Steel ‘s manual for the indentification of medical bacteria, 3rd edn Cambridge Univesity Press, Cambridge 262 Bartie, K., Đ T H Oanh, G Huy, C Dickson, M Cnockaert, J Swings, N T Phương, A Teale 2006 Tạp chí Công nghệ sinh học (1): p31-40 Baxa D V., J M Groff, A Wishkovsky, R.P Hedrick, 1990 Susceptibility of experimental infection with Edwardsiella ictaluri Buller B, Cần 2004 Thơ Bacteria@from andhọc othertập aquatic animal: A cứu Trung tâm Học liệuN.ĐH Tàifish liệu nghiên Practical Indentification Manual, 353 trang Bùi Quang Tề, 2006, nhà xuất nông nghiệp, Hà Nội 395 trang Bilodeau L., D Wise and B Wolters, 2002 Early detection of Edwardsiella ictaluri in NWAC103 channel catfish fingerlings NWAC News Edited by Jimmy L Avery Volume 5, number 2, page Cheryl L.Tars, Jayna S.Patel, Nancy D Puhr, Evansowers, Cheryl A Bopp, Nancy A Strockbine, 2006 Indentification of Vibrio isolates using a multiplex- PCR assay and rpoB sequence determination 10 Dung T.T, M Crumlish, N.T.N.Ngọc, N.Q.Thịnh & Đ.T.M Thy, 2004 Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan cá tra (Pangasius hypophthalmus) Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ, 2004 11 Đặng Thị Hồng Oanh, 2007 Giáo trình ngun lý chẩn đoán bệnh, khoa thủy sản, trường Đại Học Cần Thơ 85 trang 12 Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004 Giáo trình bệnh học thủy sản Khoa nuôi trồng thủy sản, đại học thủy sản Nha Trang, 345 trang 33 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 13 Ferguson, H.W, JF Turnbull, A Shinn, K.Thomson, TT Dung and M.Crumlish, 2001, Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong delta, VietNam Journal of fish disease 2001, 24, page 509-513 14 G Nicolas Frerichs, Stuart D Millar, 1993 Manual for the isolation and Identification of fish bacterial pathogens 15 Hawke, J.P, 1979 A bacterium associated with disease of pond cultured channel catfish Journal of the Fisheries Research Board of Canada 36: 1508-1512 16 Hawke, J.P, R.M Durborow, R.L Thune and A.C Camus, 1998 ESC – Enteric Septicemia of Catfish SRAC Publication No.477 17 Inglis V., Roberts R.J and Bromage N.R., 1993 Bacterial disease of fish Institute of aquaculture 18 J A Plumb and S Vinitnantharat, 1989 Biochemical, biophysical and Serological Homogeneity of Edwardsiella ictaluri Trung tâm 19 Kasornchandra J, W.A Rogers and J.A Plumb 1987 Edwardsiella ictaluri from walking catfish, Clarias batrachus L., in Thailan Journal Fish Diseases 10, 137-138 Họcofliệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 20 Khawsak, P., W Deesukon, P Chaivisuthangkura, W Sukhumsirichart, 2008 Multiplex RT- PCR asay for simultaneous detection of six viruses of penaeid shrimp Mol cell probes 22 (3): 17783 21 Lawrence M.L., R.K Cooper and R.L.Thune, 1997 Attenuation, persistence and vaccine potential of an Edwardsiella ictaluri purA Mutant Infection and Immunity, nov 1997,p.4642-4652 Vol.65,no.11 22 Lê Minh Đương, 2007 So sánh khả xâm nhập hai dòng vi khuẩn Edwarsiella ictaluri cá tra (Pangasius hypophthalmus) Luận văn Đại Học, khoa thủy sản, Đại Học cần Thơ, 63 trang 23 Lê Phú Khởi, 2006 Đánh giá thông tin liên quan đến quản lý sức khỏe cá tra (Pangasius hypophthalmus) tỉnh An Giang Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ 43 trang 24 Lê Thị Bé Năm, 2002 Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus) Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 43trang 34 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 25 Lương Trần Thục Đoan, 2006 Khảo sát xâm nhập vi khuẩn gây bệnh mủ gan (Edwardsiella ictaluri) quan khác cá tra (Pangasius hypophthalmus) Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 51trang 26 Manual of Diagnostic tesst for aquatic animals, 2003, 1/9/2003 http:// www.oie.int/fr/normes/fmanual/A_00029.htm, ngày truy cập 3/6/2008 27 M Crumlish, T T Dung, J F Turnbull, N T N Ngoc and H W Ferguson, 2002 Indentification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam Journal of fish dieases, 25, 733-736 28 Năm 2006: Kim ngạch xuất thủy sản đạt 773,64 triệu USD http://www.fistenet.gov.vn/detail.asp?Object=1015068&New_ID=2335 109 Cập nhật: 02/06/2008 29 Nguyễn Chính, 2005 Đánh giá tình hình sử dụng thuốc hóa chất ni cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh An Giang- Cần Thơ Luận văn cao học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 74 trang Trung tâm 30 Nguyễn Quốc Thịnh, 2002 Bước đầu nghiên cứu mô bệnh học bệnh đốm trắng nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus) Luận văn HọcĐạiliệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Học, khoa thủy sản, Đại Học cần Thơ, 40 trang 31 Nguyễn Quốc Thịnh, Từ Thanh Dung, Ferguson H.W, 2003 Nghiên cứu mô bệnh học cá tra (Pangasius hypophthalmus) bị bệnh trắng gan Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ, chuyên ngành thủy sản, 2004, 120125 32 Panangala, V.S., C.A Shoemaker, V.L Van Santan, K Dybvig., P H Klesius 2007 Multiplex-PCR for simultaneous detection of three fishpathogenic bacteria, Edwardsiella ictaluri, Flavobacterium columnare and Aeromonas hydrophila Diseases of Aquatic Organisms 74: 199208 33 Phan Thị Mỹ Hạnh, 2004 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá tra (Pangasius hypophthalmus) Đồng Bằng Sông Cửu Long Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 47 trang 34 Plumb, J.A, 1999 Edwardsiella Septicaemias Fish disease and Disorders, Volume 3: Viral, Bacterial and Fungal infections 35 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 35 Plumb J.A and D.J Sanchez, 1983 Susceptibility of five species of fish to Edwardsiella ictaluri Journal of fish disease 6, 261-266 36 Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chuyên môn bệnh học thủy sản, 2007 Bộ môn sinh học bệnh thủy sản, khoa thủy sản, trường Đại Học cần Thơ 66 trang 37 The aquatic Animal heath rearch Institure Bangkock, Thailand 2003 Diagnostic Bacteriology, 106 trang 38 Tiết Ngọc Trân, 2007.So sánh khả gây bệnh hai dòng vi khuẩn Edwarsiella ictaluri gây bệnh cá tra (Pangasius hypophthalmus) cá nheo Mỹ (Ictalurus punctalus) Luận văn Đại Học, khoa thủy sản, Đại Học cần Thơ, 56 trang 39 Trần Thị Ngọc Hân, 2006 Khảo sát mô học cá tra (Pangasius hypophthalmus) bị bệnh mủ gan điều kiện gây cảm nhiễm Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ 71 trang 40 Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa, 2005 Giáo trình bệnh học thủy sản, khoa thủy sản, trường Đại Học Cần Thơ Trung tâm 41 Từ Thanh Dung, 2006 Giáo trình bệnh vi khuẩn động vật thủy sinh, thủy sản,Cần trườngThơ Đại Học 37trang Họckhoa liệu ĐH @Cần TàiThơ, liệu học tập nghiên cứu 42 Từ Thanh Dung Nguyễn Thị Như Ngọc, 2006 Thực tập bệnh vi khuẩn động vật thủy sản 43 Victor S Panangala, Craig A Shoemaker, Vicky L van Santen, Kevin Dybvig, Phillip H Klesius, 2007, multiplex- PCR for simultaneous detection of bacterial fish pathogen, Flavobacterium columnare, Edwadsiella ictaluri, and Aeromonas hydrophyla Dieases of aquatic organisms, 74: 199- 208 44 Waltman W D., E B Shotts and T C Hsu, 1986 Biochemical characteristics of Edwardsiella ictaluri Applied and environmental microbiology, 51, No 1, p 101-104 45 William, M.L and M.L Lawrence, 2005 Identification and characerization of a two compoent hemolysin from E ictaluri Veterinary Microbiology 108: 281-189 46 Wongteerasupaya, C., V Boonsaeng, W Tongchuea, N Sitidilokratana, P Kanchanaphum, R Klinputsorn, S Panyim, 1998 Multiplex PCR for detection of Yellow-head virus and White sport syndrome virus in Penaeus monodon 36 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 47 Yang B, X–L Song, J Huang, C-Y Shi, Q-H Liu and L Liu, 2006 A single-step multiplex PCR for simultaneous detection of white spot syndrome virus and infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp, 29, 301-305 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 37 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Nhuộm Gram Chuẩn bị tiêu bản: Nhỏ giọt nước cất lên lam kính, dùng que cấy nhặt vi khuẩn trải lên giọt nước cất Để khơ nhiệt độ phịng sau hơ lướt lam lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn lam Các bước thực hiện: Nhỏ dung dịch Crystal violet (dung dịch I ) lên lam Để phút Rửa nước cho hết màu tím lam (khoảng giây), để khơ Nhỏ dung dich Iodine (dung dịch II) lên lam, để khoảng phút Lật nghiêng lam kính cho hết dung dịch Iodine lam Dùng dung dịch cồn: aceton (dung dịch III) để tẩy màu cách nghiêng lam kính nhỏ từ từ dung dịch III giọt nước cuối lam khơng cịn màu tím Rửa để khô Nhỏ dung dịch Safranin (dung dich IV) lên lam, để khoảng phút Rửa để khơ nhiệt độ phịng Quan sát vật kính 100X Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Đọc kết Vi khuẩn Gram dương (G+) có màu tím xanh Vi khuẩn Gram âm (G-) có màu hồng đỏ Quan sát tính di động Sự di động vi khuẩn quan sát phương pháp giọt treo vật kính 40X Các bước thực sau: Cho vaseline lên góc lamelle đặt ngửa lamelle bàn Cho giọt nước lên lame Tiệt trùng que cấy, lấy vi khuẩn cho lên lame hòa vào nước Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle cho lame không chạm vào giọt nước chứa vi khuẩn Cẩn thận lật thật nhanh lame để giọt nước treo ngược lamelle Đặt lam lên kính hiển vi quan sát tính di động vi khuẩn vật kính 40X 38 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phản ứng oxidase: dùng dung dịch oxidase Dùng que cấy phết vi khuẩn lên giấy lọc tẩm dung dịch oxidase Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng Oxidase (+) làm giấy lọc chuyển sang màu xanh vòng 10 giây ngược lại Phản ứng catalase Sử dụng dung dịch 3% H2O2 (3ml H2O2 100ml nước cất) 1.Dùng que cấy nhặt vi khuẩn để lên lam Nhỏ lên vi khuẩn giọt 3% H2O2 Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng Catalase (+) gây tượng sủi bọt dung dịch 3% H2O2 ngược lại Khả len men oxy hoá đường glucose (O/F) Các bước thực hiện: Đun khấy cho tan hồn tồn mơi trường O/F Tiệt trùng 1210C 15 phút, để nguội 45 0C Thêm 1% tiệt trùng Cho@ 3mlTài môi trường vào ống nghiệm Trung tâm3.Học liệuglucose ĐH Cần Thơ liệu học tập nghiên cứu Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm có chứa mơi trường OF Sau phủ 0.51ml dầu parafin tiệt trùng vào ống nghiệm để tạo điều kiện yếm khí ống nghiệm Để tủ ấm 280C Theo dõi đọc kết sau từ đến bảy ngày Lên men (F) ống có phủ parafin chuyển sang màu vàng Oxidation (O) ống khơng có phủ parafin chuyển sang màu vàng Khơng đổi (N) hai ống có màu xanh xanh lơ Phản ứng decarboxylase (Arginine, Lysine, Ornithine) Các bước thực hiện: Pha môi trường Decarboxylase (công thức nhãn) + 0.5% yeast extract Thêm 1% amino acid (Arginine, Lysine, Ornithine) cho phản ứng Mơi trường làm đối chứng khơng có amino acid Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm Thanh trùng 1210C 15 phút Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm sau phủ lên ống 0.5ml 39 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com parafin tiệt trùng, để tủ ấm 28 0C Đọc kết từ 1-4 ngày Phản ứng (+) ống nghiệm có amino acid chuyển màu khác với màu ống đối chứng ngược lại Khả sử dụng citrate Pha môi trường Simmon,s Citrate agar (công thức pha chế nhãn) Đun sôi khuấy cho tan Cho khoảng 6ml môi trường vào ống nghiệm Thanh trùng 1210C 15 phút Để nghiêng để tạo mặt phẳng nghiêng ống nghiệm để nguội Cấy vi khuẩn bề mặt nghiêng ống nghiệm Ủ 280C Sau 2-7 ngày, vi khuẩn sử dụng Citrate tạo màu xanh lơ môi trường Simmon,s Citrate agar cho kết (+) ngược lại Khả sinh H 2S Các bước thực hiện: Trung tâm1.Học liệu TSI ĐH(60g/1000ml Cần Thơ @cất) Tài liệu học tập nghiên cứu Môi trường nước Đun khuấy cho tan hoàn toàn Tiệt trùng 1210C 15 phút Để nguội 45 0C Cho khoảng 3ml môi trường vào ống nghiệm Để nghiêng ống nghiệm tạo mặt phẳng nghiêng Cấy vi khuẩn bề mặt nghiêng mặt đứng ống nghiệm Ủ 280C Đọc kết sau 14-28 Vi khuẩn lên men đường Glucose cho màu đỏ phần thạch nghiêng màu vàng phần thạch đứng (K (alkaline)/A (acid)) Vi khuẩn lên men đường Glucose Lactose Sucrose cho màu vàng phần thạch nghiêng màu vàng phần thạch đứng (A(acid)/A (acid)) Vi khuẩn lên men đường Lactose Sucrose cho màu vàng phần thạch nghiêng màu đỏ phần thạch đứng (A (acid)/K (alkaline)) Vi khuẩn không lên men đường Glucose, không lên men đường Lactose Sucrose cho màu đỏ phần thạch nghiêng màu đỏ phần thạch đứng (K (alkaline)/K (alkaline)) 40 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Vi khuẩn sinh H2S cho màu đen ống nghiệm Khả sử dụng urea Các bước thực hiện: Pha 0.1% Pepton + 0.2% KH2PO4+ 0.0012% Phenol Red +0.1 % Glucose Thêm 2% ure cho phản ứng Môi trường làm đối chứng khơng có urea Cho khoảng 3ml mơi trường vào ống nghiệm Thanh trùng 1210C 15 phút Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Để tủ ấm 280C Đọc kết vòng ngày Phản ứng (+) ống nghiệm có urea chuyển sang màu hồng 10 Khả sinh indole Các bước thực hiện: Cho khoảng 3ml môi trường Nutrient broth vào ống nghiệm Thanh trùng 1210C 15 phút Để nguội Trung tâm3.Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Để tủ ấm 280C Sau 48 nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào ống nghiệm Kết quả: Vi khuẩn sinh Indole cho phản ứng (+) với vòng màu hồng đến đỏ sậm bề mặt môi trường ngược lại 11 Phản ứng voges- proskauer (VP) Các bước thực hiện: Cho khoảng 3ml môi trường MR – VP broth vào ống nghiệm Thanh trùng 1210C 15 phút, để nguội Thuốc thử: A : Hòa tan 5g alpha naphthol 100ml ethyl alcohol B: Hòa tan 40g KOH 100ml nước cất Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Ủ 280C Sau 48 nhỏ 0.6ml thuốc thử A 0.2ml thuốc thử B vào ống nghiệm, lắc để nghiêng ống nghiệm 30 phút 41 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kết quả: Sự chuyển màu hồng môi trường cho phản ứng (+) ngược lại 12 Khả sử dụng nguồn cacbohydrate Các bước thực hiện: Môi trường Nutrient broth (công thức pha chế nhãn) + 0.4% Bromothymol blue (1.6%) Thêm 1% đường (glucose, arabinose, cellobiose…) Chỉnh pH = 6.8 Cho khoảng 3ml môi trường vào ống nghiệm Thanh trùng 1210C 15 phút Để nguội Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Ủ 280C Đọc kết vịng 2-7 ngày Nếu mơi trường chuyển sang màu vàng cho phản ứng (+) ngược lại 13 -galactosidase Cho vi khuẩn vào môi trường NB, thêm vào 0.2ml 1.5% NaCl Ủ qua đêm Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Sau 48 cho đĩa ONPG vào, giữ 20 phút đọc kết quả: dương tính cho màu vàng vịng giờ, ngược lại âm tính 42 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG TÌM HIỂU SỰ KHÁC NHAU VỀ CÁC CHỈ TIÊU SINH LÝ VÀ SINH HĨA GIỮA CÁC DỊNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA TRUYỀN THỐNG... sai khác xác định đặc tính sinh lý sinh hóa hai phương pháp định danh vi khuẩn E ictaluri Đề tài “Tìm hiểu khác tiêu sinh lý, sinh hóa dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri xác định phương pháp sinh. .. Mục tiêu nghiên cứu So sánh tiêu sinh lý sinh hóa dòng vi khuẩn E ictaluri xác định phương pháp sinh hóa truyền thống sử dụng kit API 20E Nội dung nghiên cứu  Xác định tiêu sinh lý sinh hóa