Nội dung Luận văn nghiên cứu tổng hợp hệ nanodendrimer PAMAM mang thuốc chống ung thư carboplatin (CAR) và oxaliplatin (OXA) nhằm giảm độ độc của thuốc đối với tế bào lành và cải thiện hiệu quả tiêu diệt tế bào ung thư nhờ tăng độ tan, tăng khả năng lưu trữ thuốc, định hướng thuốc tới đích thụ động. Mời các bạn cùng tham khảo!
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - HỒ MINH NHẬT NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ NANO DENDRIMER POLY(AMIDOAMINE) MANG THUỐC CHỐNG UNG THƯ (CARBOPLATIN VÀ OXALIPLATIN) Chuyên ngành: Vật liệu cao phân tử tổ hợp Mã số: 9440125 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH KHOA HỌC VẬT LIỆU Thành phố Hồ Chí Minh – 2020 Cơng trình hoàn thành tại: Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Những người hướng dẫn khoa học: GS TS NGUYỄN CỬU KHOA PGS TS NGUYỄN NGỌC VINH Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, tổ chức Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi ngày tháng năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam MỞ ĐẦU Hiện ung thư nguyên nhân gây tử vong hàng đầu tồn giới Hóa trị phương pháp điều trị, đặc biệt với ung thư di Khi hóa trị cisplatin sử dụng phổ biến Tuy nhiên, thuốc tồn nhiều tác dụng phụ độc tính cao tiềm ẩn khả kháng thuốc tế bào ung thư Sau đó, carboplatin oxaliplatin sử dụng rộng rãi nhờ độ độc giảm hẳn khả gây độc cao tính chọn lọc hướng đích Nhằm khắc phục nhược điểm trên, dendrimer poly(amidoamine) (PAMAM) với số nhóm chức bề mặt lớn có hoạt tính hóa học cao, biến tính tác nhân hướng đích phân tử thuốc tạo hệ chất mang thuốc giúp tăng hiệu điều trị Tuy nhiên, PAMAM có nhiều nhóm chức amin bề mặt tương tác với màng tế bào mang điện tích âm gây phá hủy tế bào khiến PAMAM có độ độc cao hạn chế khả ứng dụng Để khắc phục nhược điểm biến tính nhóm chức bề mặt PAMAM với Poly(ethyleneglycol) (PEG), polyme mạch thẳng có tính tương hợp sinh học cao, không độc, không gây miễn dịch tan tốt nước Việc gắn PEG lên PAMAM làm tăng độ tan nước thời gian tồn máu, giảm tích lũy gan thận PAMAM, làm tăng không gian nội phân tử giúp tăng khả nang hóa thuốc PEG đóng vai trị nắp làm giảm tốc độ phóng thích thuốc PAMAM, cải thiện khả thấm xuyên màng tế bào PAMAM giúp hệ chất mang thâm nhập vào tế bào tốt Trên sở đó, đề xuất luận án: “Nghiên cứu tổng hợp hệ nano dendrimer poly(amidoamine) mang thuốc chống ung thư (carboplatin oxaliplatin)” Mục tiêu Nghiên cứu tổng hợp hệ nanodendrimer PAMAM mang thuốc chống ung thư carboplatin (CAR) oxaliplatin (OXA) nhằm giảm độ độc thuốc tế bào lành cải thiện hiệu tiêu diệt tế bào ung thư nhờ tăng độ tan, tăng khả lưu trữ thuốc, định hướng thuốc tới đích thụ động Nội dung nghiên cứu - Tổng hợp dendrimer PAMAM đến hệ G4.0 từ tâm ethylendiamin - Biến tính PAMAM (2 hệ chẵn G3.0 G4.0 lệ lẻ G3.5) PEG 4.000K với tỉ lệ: 1:4; 1:8; 1:16 1:32 - Đánh giá cấu trúc độ chuyển hóa hệ PAMAM biến tính PEG - Đánh giá khả mang thuốc chống ung thư carboplatin oxaliplatin hệ G3.0-PEG, G3.5-PEG G4.0-PEG - Phân tích cấu trúc phức chất hệ PAMAMPEG[CAR], PAMAM-PEG[OXA] đánh giá hiệu suất mang thuốc carboplatin oxaliplatin hệ chất mang - Khảo sát tương hợp sinh học hệ PAMAM-PEG - Khảo sát độc tính tế bào hệ PAMAM-PEG[CAR] PAMAM-PEG[OXA] ba dòng tế bào: ung thư tử cung HeLa, ung thư phổi A549 ung thư vú MCF-7 Ý nghĩa khoa học luận án - Biến tính PAMAM (hai hệ chẵn G3.0 G4.0 lệ lẻ G3.5) PEG với tỉ lệ khác để tạo hệ chất mang thuốc định hướng đến tế bào ung thư - Các hệ chất mang PAMAM-PEG tăng khả mang thuốc chống ung thư carboplatin oxaliplatin (tăng hiệu suất nang hóa) - Các hệ chất PAMAM-PEG mang thuốc chống ung thư carboplatin oxaliplatin có khả nhả thuốc chậm ổn định (dưới 50% sau 24 giờ) điều kiện in vitro - Các hệ chất mang PAMAM-PEG phức PAMAMPEG[CAR], PAMAM-PEG[OXA] giảm độc tính thuốc chống ung thư carboplatin oxaliplatin đồng thời thể hoạt tính ức chế hiệu phát triển tế bào ung thư (trên dòng tế bào: ung thư tử cung HeLa, ung thư phổi A549 ung thư vú MCF-7) Đóng góp luận án Sử dụng vật liệu PAMAM-PEG mang hai thuốc chống ung thư (carboplatin oxaliplatin) khảo sát tính chất mang, nhả thuốc, tương hợp sinh học, độc tính tế bào (trên ba dịng ung thư: vú, phổi, tử cung) Phương pháp nghiên cứu Các phương pháp nghiên cứu sử dụng luận án bao gồm: - Phương pháp tổng hợp dendrimer PAMAM đến hệ G4.0: phản ứng alkyl hóa (phản ứng Michael) phản ứng amid hóa; - Phương pháp biến tính PAMAM PEG (thế hệ chẵn mPEG-NPC lệ lẻ mPEG-NH2) - Phương pháp nang hóa; - Phương pháp phóng thích thuốc; - Phương pháp khảo sát độ tương hợp sinh học dòng tế bào L929; - Phương pháp khảo sát độc tính tế bào ba dòng tế bào ung thư: ung thư tử cung HeLa, ung thư phổi A549 ung thư vú MCF-7 CHƯƠNG TỔNG QUAN Phần tổng quan gồm 25 trang trình bày nội dung: - Tổng quan bệnh ung thư phương pháp hóa trị - Thuốc chống ung thư dạng phức platin - Hệ chất mang nano dendrimer PAMAM - Tình hình nghiên cứu nước giới CHƯƠNG THỰC NGHIỆM Phần thực nghiệm gồm 25 trang trình bày nội dung: - Phương pháp tổng hợp dendrimer PAMAM - Phương pháp biến tính PAMAM PEG - Phương pháp nang hóa phóng thích thuốc - Phương pháp khảo sát độ tương hợp sinh học dòng tế bào L929 độ độc dòng tế bào ung thư (ung thư vú MCF-7, ung thư phổi A549 ung thư tử cung Hela) - Hóa chất thiết bị, dụng cụ nghiên cứu CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Tổng hợp PAMAM dendrimer đến hệ G4.0 3.1.1 Tổng hợp PAMAM dendrimer đến hệ G2.5 3.1.1.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR) Phổ 1H-NMR PAMAM dendrimer từ G-0.5 đến G2.5 có proton với độ chuyển dịch hóa học điển cơng trình cơng bố: -CH2CH2N< (a) δH = 2,6 ppm; -CH2CH2CO- (b) δH = 2,8-2,9 ppm; -CH2CH2CONH- (c) δH = 2,3-2,4 ppm; CH2CH2NH2 (d) δH = 2,7- 2,8 ppm; -CONHCH2CH2N- (e) δH = 3,2-3,4 ppm; -CH2CH2COOCH3- (g) δH = 2,4-2,5 ppm COOCH3 (h) δH = 3,7 ppm Điều minh chứng cấu trúc sản phẩm PAMAM dendrimer từ G-0.5 đến G2.5 phù hợp với cấu tạo theo lý thuyết 3.1.1.2 Phổ khối lượng (MS) So sánh khối lượng phân tử PAMAM dendrimer tổng hợp với lý thuyết cho thấy hệ số sai lệch trung bình 0,09% (Bảng 3.1) Bảng 3.1 Khối lượng phân tử PAMAM tổng hợp với lý thuyết Khối phổ Khối lượng theo lý Hệ số sai lệch Thế hệ (m/z) thuyết (m/z) (%) PAMAM 405,2015 404,45 0,18 G-0.5 517,3634 516,68 0,13 G0.0 1.205,6128 1.205,39 0,02 G0.5 1.429,9832 1.429,85 0,01 G1.0 2.806,4471 2.807,28 0,03 G1.5 PAMAM dendrimer G2.0 trở lên không xác định giá trị m/z Điều công bố nghiên cứu Schwartz Hood Nguyên nhân việc không xác định khối lượng phân tử PAMAM hệ cao PAMAM khó đạt giá trị lý thuyết hiệu ứng lập thể Trong số phương pháp dùng để xác định trọng lượng phân tử dendrimers MALDI-TOFMS, quang phổ khối ion hóa ion dương ESI-MS thẩm thấu gel sắc ký GPC áp dụng dendrimer hệ nhỏ đòi hỏi số điều kiện nghiêm ngặt để thực 1H-NMR cho thấy kỹ thuật hữu ích để xác định trọng lượng phân tử PAMAM 1H-NMR cho kết có độ xác tương đối cao Phổ 1H-NMR phổ MS chứng minh sản phẩm PAMAM dendrimer có cấu trúc theo lý thuyết 3.1.2 Tổng hợp PAMAM dendrimer hệ G3.0, G3.5 G4.0 Sản phẩm tổng hợp dạng chất rắn màu vàng, hút ẩm mạnh, dễ tan nước metanol Cấu trúc sản phẩm PAMAM G3.0, G3.5 G4.0 xác định với phổ UV-Vis, phổ FT-IR, phổ 1H-NMR Dữ liệu phổ 1H-NMR dùng để tính tốn khối lượng phân tử PAMAM G3.0, G3.5 G4.0 Hình thái kích thước hạt khảo sát TEM, DLS zeta 3.1.2.1 Phổ UV-Vis, phổ FT-IR phổ 1H-NMR Phổ UV-Vis PAMAM G3.0, G3.5 G4.0 có vân hấp thụ đặc trưng bước sóng 280 – 285 nm, tương ứng với hấp thụ nhóm amin bậc cấu trúc PAMAM G3.0, G3.5 G4.0 Các PAMAM có nhiều nhóm amin bậc PAMAM G3.5 thể cường độ hấp thụ mạnh Phổ 1H-NMR (Bảng 3.2) cho thấy tín hiệu đặc trưng PAMAM G3.0, G3.5 G4.0 Bảng 3.2 Các tín hiệu đặc trưng phổ 1H-NMR PAMAM G3.0, G3.5 G4.0 Đơn vị tính: δH (ppm) PAMAM (a) (b) (c) (d) (e) G3.0 2,80-2,83 2,37-2,40 2,60-2,61 3,26-3,30 2,73-2,76 G3.5 2,78-2,85 2,39-2,42 2,57-2,63 3,27-3,37 2,47-2,50 G4.0 2,83-3,00 3,20-3,28 2,73-2,83 3,56-3,70 3,28-3,37 (f) 3,69-3,73 Phổ FT-IR sản phẩm PAMAM dendrimer G3.0, G3.5 G4.0 khoảng 4.000 cm-1 đến 500 cm-1 có tín hiệu PAMAM G3.0 G4.0 3.410 – 3.265 cm-1 nhóm amin bậc (-NH-); 1.652 – 1.645 cm-1 C=O (liên kết amid) 1.556-1.552 cm-1 liên kết N-H PAMAM G3.5 có vân hấp thụ nhóm –OH axit cacboxylic bề mặt 3.415 – 3.265 cm-1, 1.730 cm-1 nhóm C=O (axit) Đây tín hiệu điển hình PAMAM G3.0, G3.5 G4.0 Từ phổ 1H-NMR, phổ FT-IR phổ UV-Vis khẳng định cấu trúc PAMAM dendrimer hệ G 3.0, G3.5 G 4.0 tổng hợp thành cơng 3.1.2.2 Tính tốn phân tử khối PAMAM 1H-NMR Khối lượng phân tử tính dựa vào giá trị tích phân tín hiệu (c) (d) PAMAM G3.0, (a) (d) PAMAM G3.5 PAMAM G4.0 phổ 1H-NMR ứng với số proton vị trí đặc trưng PAMAM G3.0 G3.5 G4.0 Kết tính tốn PAMAM G3.0, G3.5 G4.0 sai lệch so với lý thuyết 5,54%, 8,90% 14,44%; phù hợp với hiệu suất phản ứng (90%) nêu 3.1.2.3 Hình thái PAMAM Kết đo kích thước hạt TEM DLS cho thấy hạt PAMAM dendrimer có dạng hình cầu, độ đồng cao hạt không 10 nm Bảng 3.3 Kích thước hạt trung bình PAMAM G3.0, G3.5, G4.0 PAMAM DLS (nm) TEM (nm) G3.0 5,9 ± 1,1 3,09 ± 0,02 G3.5 6,6 ± 1,8 5,68 ± 0,06 G4.0 3,9 ± 0,1 4,04 ± 0,05 Kích thước hạt trung bình PAMAM G3.0 nhỏ PAMAM G3.5 phù hợp với lý thuyết, cho thấy tăng kích thước PAMAM hệ sau so với hệ trước PAMAM G4.0 có kích thước nhỏ PAMAM G3.5 số lượng 64 nhóm bề mặt khác nhóm chức (PAMAM G4.0 amin PAMAM G3.5 cacboxylat) nên PAMAM G4.0 có tượng nếp gấp ngược lực hấp dẫn nhóm chức bề mặt giảm, kéo theo độ trật tự thấp, nhánh dendrimer gập vào khiến cấu trúc dendrimer co lại, làm giảm không gian bên dendrimer Hiện tượng De Gennes Hervet công bố PAMAM G3.5 bị trương nở nhờ nhóm cacboxylat tương tác với nước nên kích thước DLS PAMAM G3.5 lớn PAMAM G4.0 3.1.2.4 Thế zeta Thế zeta trung bình PAMAM dendrimer G 3.0 44,63 ± 0,31 mV, PAMAM dendrimer G3.5 -48,7 ± 0,1 mV PAMAM dendrimer G4.0 24,13 ± 0,15 mV Kết phù hợp với lý thuyết minh chứng cho tổng hợp thành công PAMAM G3.0, G3.5 G4.0 PAMAM hệ chẵn G3.0 G4.0 với nhóm amin bề mặt mang điện tích dương zeta dương điện PAMAM hệ lẻ G3.5 với nhóm cacboxylat mang điện tích âm zeta âm điện PAMAM G4.0 có nhiều nhóm amin PAMAM G3.0 (64 nhóm so với 32 nhóm) tượng nếp gấp ngược nên zeta dương điện nhóm amin co lại vào Kết đo zeta cịn cho thấy hệ có độ bền cao (thế zeta 20 mV -20mV) Nguyên nhân lực đẩy tĩnh điện với cấu tạo hệ hình cầu theo mơ hình lý thuyết DLVO 3.1.3 Hiệu suất phản ứng tổng hợp PAMAM dendrimer Các số liệu hiệu suất phản ứng tổng hợp PAMAM dendrimer G-0.5 đến G4.0 chi tiết theo Bảng 3.4 Nhìn chung, hiệu suất phản ứng tổng hợp PAMAM dendrimer từ G-0.5 đến G4.0 cao, 70 % Bảng 3.4 Hiệu suất phản ứng tổng hợp PAMAM dendrimer Thế hệ PAMAM Khối lượng lý thuyết (mLT, g) G3.0 G3.5 G4.0 42,2590 67,8653 35,3382 Khối lượng thực (mTT, g) 37,7565 61,7586 30,6938 Hiệu suất (%) 89 91 87 3.2 Biến tính PAMAM dendrimer mPEG Theo nhiều kết nghiên cứu cơng bố mPEG biến tính với PAMAM hệ G3.0, G3.5 hay G4.0 có khối lượng phân tử có khác biệt đáng kể Điều chứng tỏ mPEG gắn thành công lên PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 Ngoài ra, số lượng liên hợp thực tế mPEG PAMAM xác định phổ 1H-NMR Do cấu trúc đối xứng nên proton phân tử có số xác định tỷ lệ proton cấu trúc dendrimer PAMAM tỷ lệ tích phân tín hiệu cộng hưởng phổ 1H-NMR Số nhóm mPEG liên hợp PAMAM G3.0 tỉ lệ 4:1 3,96; 8:1 7,78 16:1 11,07, tương ứng tỉ lệ 99%, 97% 69% Số nhóm mPEG cao khả liên hợp giảm giải thích hiệu ứng lập thể So sánh phổ mPEG-G3.5 với phổ mPEG-NH2 cho thấy vắng mặt tín hiệu cộng hưởng (e) –CO-O-CH3- khoảng 3,46 ppm, góp phần minh chứng cho tổng hợp thành cơng 3.2.4 Hình thái PAMAM biến tính PEG Ảnh TEM có hình cầu, kích thước khơng q 50 nm Kết đo kích thước hạt trung bình ảnh TEM PAMAM G3.0-PEG 27,15 ± 0,16 nm, PAMAM G3.5-PEG 22,69 ± 0,40 nm PAMAM G4.0-PEG 22,70 ± 0,39 nm Kết đo DLS PAMAM-PEG cho thấy kích thước hạt PAMAM biến tính PEG lớn PAMAM tương ứng Kết khẳng định lần cho việc gắn thành cơng mPEG lên PAMAM Bảng 3.5 Kích thước hạt (DLS) PAMAM G3.0-PEG theo tỉ lệ PEG Tỉ lệ PAMAM G3.0-PEG Kích thước (nm) 1:8 1:12 1:16 32,6 ± 0,9 34,9 ± 1,5 35,7 ± 0,7 PAMAM-PEG có kích thước lớn PAMAM nhóm PEG gắn vào bao phủ bề mặt dendrimer làm tăng kích thước hạt (Bảng 3.6) 11 Khi tăng hệ PAMAM từ G3.0-PEG lên G3.5-PEG kích thước hạt trung bình tăng, điều cho thấy tăng kích thước PAMAM hệ sau so với hệ trước, phù hợp với lý thuyết Bảng 3.6 Kích thước hạt trung bình PAMAM-PEG G3.0, G3.5, G4.0 PAMAM DLS (nm) TEM (nm) G3.0 5,9 ± 1,1 3,09 ± 0,03 G3.0-PEG 32,6 ± 0,9 27,15 ± 0,16 G3.5 6,6 ± 1,8 5,68 ± 0,06 G3.5-PEG 40,3 ± 0,9 22,69 ± 0,40 G4.0 3,98 ± 0,06 4,04 ± 0,05 G4.0-PEG 30,3 ± 1,8 22,70 ± 0,39 PAMAM G4.0-PEG có kích thước nhỏ PAMAM G3.0PEG tượng nếp gấp ngược PAMAM PAMAM G3.5-PEG có nhóm cacboxylat nên có tương tác nhóm cacboxylat với nước (mơi trường pH=7,4) dẫn đến trương nở PAMAM G3.5-PEG kích thước PAMAM G3.5-PEG lớn PAMAM G4.0.-PEG 3.2.5 Thế zeta Thế zeta minh chứng cho thay đổi điện tích hệ chất mang PAMAM sau biến tính với PEG, tác nhân khơng mang điện PAMAM G3.0-PEG zeta trung bình 26,30 ± 0,44 mV, giảm so với PAMAM G3.0 (44,63 ± 0,31 mV) nhóm mPEG gắn vào bao phủ nhóm chức amin bề mặt dendrimer, làm giảm điện tích dương dendrimer Tương tự PAMAM G3.5PEG zeta trung bình -0,53 ± 0,35 mV tăng so với PAMAM G3.5 (-48,7 ± 0,10 mV) mPEG gắn vào bao phủ nhóm chức cacboxylat bề mặt dendrimer PAMAM hệ lẻ G3.5 làm giảm điện tích âm dendrimer Trường hợp PAMAM G4.0-PEG zeta tăng so với PAMAM G4.0 giải thích mPEG gắn vào dendrimer nên 12 nhóm amin bị đẩy phía ngồi dẫn đến zeta PAMAM G4.0PEG dương điện PAMAM G4.0 (46,53 ± 0,06 mV so với 24,13 ± 0,15 mV) 3.3 Khảo sát khả nang hóa Hiệu suất nang hóa thuốc (%) PAMAM-PEG mang thuốc platin tỷ lệ trọng lượng thuốc platin mang hạt PAPAM-PEG so với lượng thuốc platin ban đầu, xác định thông qua lượng thuốc platin khơng nang hóa phương pháp HPLC (Bảng 3.7) Định lượng thuốc platin từ đường chuẩn nồng độ thuốc platin biết Thuốc platin tự sử dụng làm mẫu đối chứng Hệ PAMAM-PEG sử dụng hệ PAMAM-PEG tỉ lệ 1:8 hiệu suất lai hóa 90% so với hệ tỉ lệ cao 1:16 hay 1:32 khoảng 70% hiệu ứng lập thể Bảng 3.7 Hiệu suất nang hóa DLE, DLC DLE (%) DLC(%) PAMAM G3.0-PEG[CAR] 83,98 ± 0,24 7,75 ± 0,02 PAMAM G3.0-PEG[OXA] 85,31 ± 0,23 7,86 ± 0,02 PAMAM G4.0-PEG[CAR] 84,56 ± 0,52 7,80 ± 0,04 PAMAM G4.0-PEG[OXA] 86,41 ± 0,78 7,95 ± 0,07 PAMAM G3.5-PEG[CAR] 85,37 ± 0,34 7,87 ± 0,03 PAMAM G3.5-PEG[OXA] 77,63 ± 0,20 7,20 ± 0,02 Hệ PAMAM-PEG tỉ lệ 1:4 không chọn số lượng lai hóa thấp làm nhóm amin bề mặt PAMAM hệ chẵn PAMAM G3.0 G4.0 cịn nhiều có khả gây độc khả mang thuốc thấp khiến cho việc lai hóa với PEG khơng thực hiệu mong đợi 13 3.3.1 Đường chuẩn định lượng carboplatin oxaliplatin HPLC Tín hiệu carboplatin xuất thời gian lưu 2,3 phút Đường chuẩn định lượng carboplatin có r2 = 0,9998; phương trình hồi quy tuyến tính y = 5804x – 9523,3 Tín hiệu oxaliplatin xuất thời gian lưu 1,9 phút Đường chuẩn định lượng oxaliplatin có r2 = 0,9997; phương trình hồi quy tuyến tính y = 9275.2x – 5835.2 3.3.2 Kết nang hóa thuốc carboplatin với PAMAM-PEG Sản phẩm PAMAM-PEG mang thuốc carboplatin thu trạng thái rắn màu trắng ngà, dạng hạt nhỏ Khả nang hóa thuốc carboplatin cao tỉ lệ thuốc 10% chất mang khả mang thuốc DLC 7,7% (w/w) hiệu suất nang hóa thuốc DLE 83,9% 3.3.2.1 Phổ FT-IR Phổ hồng ngoại FT-IR PAMAM-PEG[CAR] gần tương tự PAMAM-PEG, nhiên có tăng cường độ khoảng số sóng 3.400 cm-1 liên kết N-H 1.600 cm-1 liên kết C=O PAMAM-PEG[CAR] hệ chẵn G3.0 G4.0 3.3.2.2 Ảnh TEM Ảnh TEM hệ PAMAM-PEG[CAR] cho thấy kích thước hạt khơng 50 nm kích thước tăng so với hệ PAMAM-PEG Điều lý giải hệ mang thuốc carboplatin carboplatin chiếm giữ vào khoang trống dendrimer làm tăng kích thước hệ Cụ thể, mang thuốc carboplatin, hệ PAMAM G3.0 – PEG tăng kích thước từ 27,15 nm lên 30,30 nm; hệ PAMAM G3.5 – PEG PAMAM G4.0 – PEG tăng mạnh kích thước từ 22,70 nm lên 36,04 nm 30,70 nm Thế hệ G3.5 G4.0 có nhiều nhóm chức bề 14 mặt (gấp đôi) so với hệ G3.0 nên hạt thuốc chiếm khoang trống bề mặt PAMAM Như tượng nếp gấp ngược giảm bớt nhờ hạt thuốc xâm chiếm Bên cạnh đó, thuốc cịn xâm chiếm PEG khiến polyme dãn nở thêm Tất yếu tố khiến cho hệ mang thuốc tăng kích thước đáng kể so với hệ mang trước 3.3.2.3 Thế zeta Thế zeta cho thấy thay đổi đáng kể điện tích hệ PAMAM-PEG mang carboplatin Đối với hệ G3.0 điện tích giảm dần (G3.0 44,63 mV, G3.0-PEG 26,30 mV G3.0-PEG[CAR] 0,2 mV) Nguyên nhân carboplatin PEG che phủ nhóm amin bề mặt dendrimer dẫn đến điện tích dương giảm Trái ngược lại, hệ G4.0 tăng mạnh điện tích (G4.0 24,13 mV, G4.0-PEG 46,53 mV G4.0-PEG[CAR] 62,60 mV) Nguyên nhân hệ G4.0 có tượng nếp gấp ngược nên nhóm amin bị gấp vào phía khoang dendrimer carboplatin chiếm chỗ khoang dendrimer PEG làm dendrimer mở rộng, đẩy nhóm amin phía ngồi dẫn đến điện tích dương tăng Trong đó, hệ G3.5 zeta thay đổi khơng đáng kể sau mang thuốc (từ -0,53 mV thành -0,63 mV) Mặc dù hệ G3.0 G3.5 khơng cịn zeta giá trị cao (trên 20 mV -20 mV) khiến cho hệ khơng cịn lực đẩy tĩnh điện mạnh hạt hệ giữ khả bền có PEG tác nhân đóng vai trị làm bền hệ 3.3.3 Kết nang hóa thuốc oxaliplatin với PAMAM-PEG Sản phẩm PAMAM-PEG mang thuốc oxaliplatin thu trạng thái rắn màu trắng ngà, dạng hạt nhỏ Khả nang hóa thuốc 15 oxaliplatin cao tỉ lệ thuốc 10% chất mang khả mang thuốc DLC đạt 7,2% (w/w) hiệu suất nang hóa thuốc DLE 77,6% 3.3.3.1 Phổ FT-IR Phổ FT-IR PAMAM-PEG[OXA] có tín hiệu tương tự PAMAM-PEG[CAR] PAMAM-PEG, nhiên có tăng cường độ khoảng số sóng 1.600 cm-1 liên kết C=O PAMAMPEG[OXA] hệ chẵn G3.0 G4.0 3.3.3.2 Ảnh TEM Ảnh TEM hệ PAMAM-PEG[OXA] cho thấy kích thước hạt tăng so với hệ PAMAM-PEG Hệ oxaliplatin hệ chẵn G3.0 G4.0 có kích thước hạt gẩn với hệ carboplatin hệ chẵn G3.0 G4.0 Ngược lại, hệ oxaliplatin hệ lẻ G3.5 có kích thước tăng mạnh so với hệ carboplatin Các hệ PAMAM-PEG mang oxaliplatin có kích thước tăng mang oxaliplatin phân tử oxaliplatin có khuynh hướng tương tác phân tử oxaliplatin qua liên kết hydro tạo nên tượng kết tụ phân tử oxaliplatin chiếm khoang trống dendrimer làm tăng kích thước hệ 3.3.3.3 Thế zeta Thế zeta hệ PAMAM-PEG G4.0 mang oxaliplatin tăng độ dương điện phân tử oxaliplatin chiếm khoảng trống dendrimer nên đẩy nhóm amin phía ngồi, mặt khác phân tử oxaliplatin hấp phụ tĩnh điện nhóm cacboxylat phân tử oxaliplatin liên kết tĩnh điện với nhóm amin bề mặt PAMAM hệ chẵn hệ PAMAM-PEG G4.0 tăng điện tích dương mang thuốc oxaliplatin (Bảng 3.8) 16 Bảng 3.8: Thế zeta PAMAM, PAMAM-PEG, PAMAMPEG[CAR], PAMAM-PEG[OXA] hệ G3.0, G3.5 G4.0 Zeta (mV) Hệ G3.0 Hệ G4.0 Hệ G3.5 PAMAM 44,63 ± 0,31 24,13 ± 0,15 -48,7 ± 0,1 PAMAM-PEG 26,30 ± 0,44 46,53 ± 0,06 -0,53 ± 0,35 CAR 34,90 ± 0,75 58,87 ± 0,35 0,80 ± 0,17 OXA 0,20 ± 0,17 62,60 ± 0,26 -0,63 ± 0,06 Trái lại, PAMAM-PEG G3.0 mang oxaliplatin giảm độ dương điện cấu trúc khơng gian oxaliplatin lớn nên có khuynh hướng chiếm khoang trống PEG làm cho polyme che phủ nhóm amin bề mặt PAMAM làm giảm điện tích dương 3.4 Khảo sát phóng thích Carboplatin Oxaliplatin 3.4.1 Khảo sát phóng thích thuốc Carboplatin Các kết cho thấy, loại chất mang thuốc carboplatin có khả phóng thích thuốc chậm, lượng thuốc phóng thích 50% sau 24 Tuy nhiên PAMAM G3.0-PEG nhả thuốc nhanh hơn, đạt 41,23% sau 24 giờ, PAMAM G3,5-PEG G4.0-PEG nhả thuốc hơn, đạt 9,25% 12,53% Điều giải thích hệ dendrimer tăng tương tác kỵ nước dendrimer thuốc tăng nên hệ dendrimer lớn khả phóng thích thuốc chậm Hệ chất mang PAMAM G3.5-PEG phóng thích carboplatin chậm PAMAM G4.0-PEG giải thích tương tác tĩnh điện Carboplatin hấp phụ bề mặt hệ chất mang PAMAM-PEG qua tương tác tĩnh điện, hệ PAMAM chẵn, nhóm amin bề mặt PAMAM tương tác tĩnh điện với nhóm cacboxylat carboplatin, hệ PAMAM lẻ, nhóm cacboxylat bề mặt PAMAM tương tác với nhóm amin carboplatin Tương tác tĩnh điện nhóm amin 17 carboplatin nhóm cacboxylat PAMAM G3.5 thuận lợi mặt không gian tương tác tĩnh điện nhóm cacboxylat carboplatin với nhóm amin bề mặt PAMAM G4.0 cấu trúc khơng gian carboplatin 3.4.2 Khảo sát phóng thích thuốc Oxaliplatin Các kết cho thấy, loại chất mang thuốc oxaliplatin có khả phóng thích thuốc chậm, lượng thuốc phóng thích 50% sau 24 Tuy nhiên, PAMAM G3.5-PEG phóng thích thuốc nhanh hơn, đạt 28,80% sau 24 giờ, PAMAM G3.0-PEG G4.0-PEG phóng thích thuốc hơn, đạt 8,89% 6,54% Điều giải thích PAMAM hệ chẵn có nhóm bề mặt nhóm amin nên tương tác tĩnh điện với nhóm COO- thuốc PAMAM G3.0-PEG G4.0-PEG phóng thích thuốc PAMAM G3.5-PEG PAMAM G4.0-PEG phóng thích oxaliplatin chậm PAMAM G3.0-PEG PAMAM G4.0-PEG có nhiều khoang trống dendrimer để giữ oxaliplatin PAMAM G3.0-PEG tăng hệ dendrimer tương tác kỵ nước dendrimer oxaliplatin tăng nên PAMAM G4.0-PEG phóng thích oxaliplatin chậm PAMAM G3.0-PEG Ngồi PAMAM G4.0-PEG có nhiều nhóm amin PAMAM G3.0-PEG nên liên kết tĩnh điện PAMAM G4.0-PEG oxaliplatin lớn PAMAM G3.0-PEG oxaliplatin PAMAM G4.0-PEG phóng thích oxaliplatin chậm PAMAM G3.5-PEG giải thích tương tác tĩnh điện oxaliplatin PAMAM Nhóm amin bề mặt PAMAM hệ chẵn tương tác tĩnh điện với nhóm cacboxylat oxaliplatin; nhóm cacboxylat bề mặt PAMAM hệ lẻ tương tác với nhóm amin 18 oxaliplatin Tương tác tĩnh điện nhóm cacboxylat oxaliplatin nhóm amin PAMAM G4.0 thuận lợi mặt không gian tương tác tĩnh điện nhóm amin oxaliplatin với nhóm cacboxylat bề mặt PAMAM G3.5 cấu trúc khơng gian oxaliplatin 3.4.3 Dự đốn mơ hình dược động học hệ PAMAMPEG mang thuốc platin Hai thuốc đối chứng carboplatin oxaliplatin cho thấy dạng đường cong phù hợp với dược động học đường tiêm Sau tiêm tĩnh mạch, thuốc có nồng độ tăng thời gian ngắn liều công (tiêm bolus), hàm lượng thuốc huyết tương nhanh chóng đạt đỉnh, sau giảm theo thời gian Tuy nhiên sau đưa thuốc vào hệ chất mang nano, diễn biến lại theo xu hướng khác Đối với thuốc carboplatin, đồ thị thể xu hướng thuốc đường uống Hàm lượng thuốc huyết tương tăng lên theo thời gian, đến đạt đỉnh (Cmax) giảm theo cấp số nhân Khi hàm lượng huyết tương tăng, lượng thuốc hấp thu vào máu cao lượng bị chuyển hóa thải trừ Đặc biệt, mẫu G3.0 PEG[CAR] cho đỉnh với khoảng diện tích đỉnh rộng, chứng tỏ thuốc sau tiêm, tác động huyết tương, hạt mang thuốc bị trương làm thuốc giải phóng ra, đạt đến mức nồng độ cao khoảng từ 12 đến 24 Điều cịn giải thích từ cấu trúc PAMAM G3.0 liệu mang thuốc PAMAM G3.0 có kích thước nhỏ với 32 nhánh bề mặt mang lượng thuốc với PAMAM G3.5 PAMAM G4.0 có kích thước lớn với số nhánh nhiều (64 nhánh) Do đó, PAMAM G3.0 dễ dàng phóng thích thuốc kết phóng thích thuốc vượt trội so với PAMAM G3.5 PAMAM G4.0 19 Tuy nhiên xu hướng mẫu PAMAM G3.5 lại khác hẳn Hàm lượng thuốc đạt tối đa khoảng thời gian đầu thuốc lại có đỉnh vị trí thứ xảy lúc khoảng 12h, cho thấy thuốc giải phóng nhanh giai đoạn đầu khoảng Sau đó, hạt chất mang tiếp tục giải phóng thuốc giai đoạn dẫn đến tình trạng có xuất đỉnh thứ Kết tương tự với mẫu G4.0 Sự khác biệt hàm lượng thuốc tối đa mẫu G4.0 thể giai đoạn sau hàm lượng thuốc tối đa thể giai đoạn đầu G3.5 Điều giải thích cấu trúc bề mặt khác PAMAM G3.5 PAMAM G4.0 Hệ mang thuốc PAMAM–PEG mang thuốc theo chế thuốc giữ khoang trống dendrimer (trong khoang trống dendrimer, thuốc dendrimer có tương tác vật lý, tương tác kỵ nước tương tác hydro) thuốc hấp phụ bề mặt dendrimer qua tương tác tĩnh điện thuốc nhóm bề mặt dendrimer Đối với PAMAM G3.5 có nhóm caxboxylat bề mặt, nhóm có xu hướng co cụm lại nên giai đoạn đầu PAMAM G3.5 phóng thích thuốc carboplatin nhiều PAMAM G4.0 Oxaliplatin có diễn biến tương tự Đồ thị cho thấy đỉnh hấp thụ thuốc Hàm lượng thuốc huyết tương tăng lên, đạt đỉnh, sau giảm đi, lúc đầu nhanh, sau tăng chậm trở lại cuối giảm nhanh Bên cạnh đó, thời điểm ban đầu từ đến giờ, đồ thị cho thấy thuốc ảnh hưởng theo dạng đường tiêm mẫu, sau từ khoảng thời gian đến 32 thuốc có lại có xu hướng đường uống, nghĩa thuốc giải phóng từ từ khiến cho hàm lượng thuốc máu tăng trở lại 20 3.5 Khảo sát độ tương hợp sinh học với tế bào L929 Khảo sát độ tương hợp sinh học mẫu chứng PAMAM biến tính với PEG tỉ lệ 0, 4, 8,16 32 sau 48 hai nồng độ 250 ug/mL 500 ug/mL Kết thử nghiệm độ tương hợp sinh học in vitro PAMAM PAMAM-PEG dòng nguyên bào sợi chuột L929 cho thấy, độ độc PAMAM G3.0 G4.0 cao PAMAM G3.5, với lý thuyết, nhóm chức amin mang điện tích dương tương tác với màng tế bào mang điện tích âm gây phá hủy màng tế bào khiến PAMAM có độ độc tế bào cao PAMAM G4.0 có tỉ lệ tế bào sống cao PAMAM G3.0 G4.0 nhiều nhóm amin G3.0 G4.0 có tượng nếp gấp ngược (thể qua zeta G4.0 24,13 ± 0,15 mV dương điện G3.0 44,63 ± 0,31 mV) nên nhóm amin bị cuộn bên dendrimer Các PAMAM biến tính với PEG giảm độ độc PEG có khả che phủ nhóm chức bề mặt, từ làm giảm điện tích bề mặt PAMAM Kết phù hợp với lý thuyết kết công bố Đối với PAMAM G3.0, gắn nhóm PEG độ độc cao, PAMAM G3.0 gắn 16 nhóm PEG có độ độc thấp, khả tương hợp sinh học cao, phù hợp để mang thuốc PAMAM G3.5 gắn PEG từ nhóm trở lên có độ tương hợp sinh học cao, tỉ lệ tế bào sống sau 24 cao 90% Tương tự PAMAM G3.0, PAMAM G4.0 gắn nhóm PEG có độ độc cịn tương đối cao, gắn nhóm PEG trở lên có khả tương hợp sinh học cao, phù hợp làm chất mang thuốc PAMAM biến tính PEG tăng từ 0-4 tỉ lệ tế bào sống tăng tỉ lệ biến tính PAMAM-PEG từ trở lên PAMAM-PEG 21 G4.0 tỉ lệ tế bào sống PAMAM-PEG G3.0 PEG đạt đến ngưỡng định đẩy nhóm amin PAMAM G4.0 phía ngồi làm điện tích dương PAMAM-PEG G4.0 tăng so với PAMAMPEG G3.0 (thế zeta PAMAM-PEG G4.0 tỉ lệ 1:8 46,53 ± 0,06 mV; so với zeta PAMAM-PEG G3.0 tỉ lệ 1:8 26,30 ± 0,44 mV) Khi tăng hàm lượng chất mang lên từ 250 đến 500 µg/mL tỉ lệ sống tế bào giảm hàm lượng cao số lượng nhóm amin nhiều nên tương tác dendrimer với tế bào tăng, tỉ lệ tế bào sống giảm 3.6 Khảo sát độc tính tế bào Các hệ PAMAM-PEG mang thuốc platin khảo sát độc tính tế bào ba dòng tế bào ung thư: HeLa, A549, MCF-7 Tỉ lệ tế bào sống sau 48 với năm nồng độ từ 10 ug/mL đến 25, 50, 75 100 ug/mL Mẫu chứng mẫu thuốc khảo sát nồng độ sau 48 Hệ PAMAM G4.0-PEG mang carboplatin oxaliplatin tiêu diệt tế bào ung thư HeLa, MCF-7 hiệu hàm lượng từ 75-100 µg/mL sau 48 Hệ PAMAM G3.0-PEG mang carboplatin oxaliplatin tiêu diệt tế bào ung thư phổi A549 hiệu hàm lượng từ 50-100 µg/mL sau 48 Nhìn chung PAMAM hệ chẵn tiêu diệt tế bào ung thư HeLa, A549 MCF-7 cao hệ lẻ, hệ PAMAM G4.0-PEG hệ chất mang có khả thúc đẩy tiêu diệt tế bào ung thư HeLa, MCF-7 Mỗi loại tế bào ung thư chịu tác động khác thuốc chống ung thư chất mang thuốc khác 22 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Đã tổng hợp thành công dendrimer PAMAM đến hệ G4.0 từ tâm etylendiamin với hiệu suất cao 70% Đã biến tính thành công hệ dendrimer: G3.0, G3.5 G4.0 PEG với tỉ lệ: 1:4; 1:8; 1:16 1:32 Đã khảo sát hiệu nang hóa phóng thích thuốc chống ung thư carboplatin oxaliplatin hệ G3.0, G3.5 G4.0 biến tính PEG Kết khảo sát cho thấy khả mang thuốc phóng thích thuốc phụ thuộc vào hệ dendrimer, nhóm bề mặt dendrimer cấu trúc phân tử thuốc Đã dự đốn mơ hình dược động học hệ PAMAMPEG[CAR] PAMAM-PEG[OXA] Đối với thuốc carboplatin, đồ thị thể thuốc có xu hướng thuốc đường uống Đối với thuốc oxaliplatin, đồ thị thể hai đỉnh hàm lượng cao thấp (đường tiêm sau đường uống) Đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào để đánh giá tương hợp sinh học hệ chất mang PAMAM biến tính PEG Đã khảo sát độc tính hệ chất mang PAMAM biến tính PEG mang thuốc carboplatin oxaliplatin dòng tế bào: ung thư tử cung HeLa, ung thư phổi A549 ung thư vú MCF-7 Hệ PAMAM G4.0-PEG hệ chất mang có khả thúc đẩy tiêu diệt tế bào ung thư HeLa, MCF-7 Kiến nghị tiếp tục nghiên cứu in vivo làm sở phát triển hệ dẫn truyền thuốc PAMAM mang thuốc chống ung thư; thử nghiệm độc tính cấp độc tính bán trường diễn Nghiên cứu biến tính bề mặt PAMAM với tác nhân hướng đích acid folic nhóm chức có huỳnh quang để theo dõi khả hướng đích fluorescein isothiocyante AlexaFluor 23 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1- Tổng hợp thành công hệ chất mang poly(amidoamine) – polyetylen glycol (PAMAM-PEG) G3.0, G3.5 G4.0 mang carboplatin, oxaliplatin 2- Khảo sát khả nang hóa hệ chất mang poly(amidoamine) – polyetylen glycol (PAMAM-PEG) G3.0, G3.5 G4.0 với carboplatin oxaliplatin Kết cho thấy hiệu suất nang hóa cao đạt khoảng 80% 3- Dự đốn mơ hình dược động học hệ PAMAM-PEG mang thuốc platin với carboplatin thể xu hướng đường uống oxaliplatin có xu hướng đường tiêm sau đường uống 4- Khảo sát tính tương hợp sinh học hệ chất mang PAMAM biến tính PEG 5- Khảo sát độc tính hệ chất mang PAMAM biến tính PEG mang thuốc carboplatin, oxaliplatin dịng tế bào: ung thư tử cung HeLa, ung thư phổi A549 ung thư vú MCF-7 Các hệ chất PAMAM-PEG mang thuốc platin làm giảm độc tính thuốc chữa ung thư carboplatin oxaliplatin đồng thời thể hoạt tính dịng tế bào ung thư Hệ PAMAM-PEG G4.0 hệ chất mang có khả thúc đẩy tiêu diệt tế bào ung thư HeLa, MCF-7 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Minh Nhat Ho, Long Giang Bach, Thi Hiep Nguyen, Minh Hieu Ho, Dai Hai Nguyen, Cuu Khoa Nguyen, Cong Hao Nguyen, Ngoc Vinh Nguyen, Thai Thanh Hoang Thi (2019) PEGylated poly(amidoamine) dendrimersbased drug loading vehicles for delivering carboplatin in treatment of various cancerous cells, Journal of Nanoparticle Research, 21(2): 43-55 Dinh Tien Dung Nguyen, Long Giang Bach, Thi Hiep Nguyen, Minh Hieu Ho, Minh Nhat Ho, Dai Hai Nguyen, Cuu Khoa Nguyen, Thai Thanh Hoang Thi (2019) Preparation and characterization of oxaliplatin drug delivery vehicle based on PEGylated half-generation PAMAM dendrimer, Journal of Polymer Research, 26: 116-130 Minh Thanh Vu, Long Giang Bach, Duy Chinh Nguyen, Minh Nhat Ho, Ngoc Hoi Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Dai Hai Nguyen, Cuu Khoa Nguyen, Thai Thanh Hoang Thi (2019) Modified Carboxyl-Terminated PAMAM Dendrimers as Great Cytocompatible Nano-Based Drug Delivery System, International Journal of Molecular Sciences, 20(8):2016-2030 Minh Nhat Ho, Ngoc Quyen Tran, Cuu Khoa Nguyen, Dai Hai Nguyen (2015) PAMAM dendrimer as drug delivery vehicles for transition platinum-based anticancer agents Proceedings of the 4th Asia-Pacific Chemical and Biological Microfluidics Conferences (136-142) Da Nang, Vietnam Minh Nhat Ho, Thanh Luan Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Cuu Khoa Nguyen, Dai Hai Nguyen (2016) Development of Poly(ethylene glycol)conjugated Poly(amidoamine) dendrimer as a redox-sensitive nanocarriers for cancer therapy Proceedings of the 8th International Workshop on Advanced Materials Science and Nanotechnology (446449) Ha Long, Vietnam Minh Nhat Ho, Thanh Thao Bui, Ngoc Quyen Tran, Cuu Khoa Nguyen, Dai Hai Nguyen (2017) PAMAM dendrimer G3.5 as drug delivery vehicles for transition carboplatin Proceedings of the 6th International workshop on Nanotechnology and Application (487-490) Phan Thiet, Vietnam 25 ... án: ? ?Nghiên cứu tổng hợp hệ nano dendrimer poly(amidoamine) mang thuốc chống ung thư (carboplatin oxaliplatin) ” Mục tiêu Nghiên cứu tổng hợp hệ nanodendrimer PAMAM mang thuốc chống ung thư carboplatin... bào: ung thư tử cung HeLa, ung thư phổi A549 ung thư vú MCF-7) Đóng góp luận án Sử dụng vật liệu PAMAM-PEG mang hai thuốc chống ung thư (carboplatin oxaliplatin) khảo sát tính chất mang, nhả thuốc, ... ung thư: ung thư tử cung HeLa, ung thư phổi A549 ung thư vú MCF-7 CHƯƠNG TỔNG QUAN Phần tổng quan gồm 25 trang trình bày nội dung: - Tổng quan bệnh ung thư phương pháp hóa trị - Thuốc chống ung