Mục tiêu nghiên cứu của Luận án nhằm xác định được vai trò của một số yếu tố như ánh sáng, loại và nồng độ đường, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, môi trường khoáng, acid amin và polyamine đối với sự ra hoa của cây T. fournieri in vitro. Mời các bạn cùng tham khảo!
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN QUÁ TRÌNH RA HOA CỦA CÂY HOA MÕM CHÓ (Torenia fournieri L.) NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Mã số: 42 01 12 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC TP HCM – 2020 Công trình hồn thành tại: Viện Sinh học Nhiệt đới Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: GS TS Dương Tấn Nhựt TS Nguyễn Hữu Hổ Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … , ngày … tháng … năm 202… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Torenia fournieri quan tâm nhà khoa học vẻ đẹp giản dị, dễ dàng chăm sóc trồng với nhiều mục đích khác trồng chậu, ven đường đi, nhà, ngồi trời, trồng nơi có khí hậu nóng, ơn hồ hay lạnh Ngồi giá trị trang trí, T fournieri với vịng đời ngắn, đáp ứng nhanh với thay đổi môi trường nuôi cấy, loại mơ hình thí nghiệm hữu ích cho nhà nghiên cứu, đặc biệt thích hợp cho việc nghiên cứu tượng sinh lý T fournieri sử dụng làm nguồn vật liệu cho nghiên cứu in vitro chuyển gene, tạo biến dị dịng soma, nhân giống vơ tính, tạo hoa in vitro… Mặc dù, có số nghiên cứu hoa in vitro T fournieri, việc làm sáng tỏ thêm mối quan hệ hoa tác động chất điều hòa sinh trưởng thực vật, nguồn carbon, mơi trường dinh dưỡng khống số yếu tố khác polyamine, acid amin cần thiết để làm sáng tỏ chế phức tạp q trình hoa lồi Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào với kỹ thuật sinh học phân tử góp phần cung cấp thêm kiến thức trình hoa thực vật Cho đến nay, bên cạnh A thaliana, loại mơ hình sử dụng nhiều cho việc nghiên cứu hoa, T fournieri sử dụng làm nguồn vật liệu để nghiên cứu trình hoa in vitro Trong nghiên cứu hoa thực vật, điều kiện nuôi cấy in vitro điều kiện lý tưởng để thực nghiên cứu sâu trình Trong điều kiện in vitro, nhà khoa học chủ động điều chỉnh số yếu tố cường độ ánh sáng, quang kỳ, nhiệt độ, đường, chất khống, chất điều hịa sinh trưởng thực vật tùy theo mục đích nghiên cứu Những thay đổi thành phần môi trường, chất điều hòa sinh trưởng thực vật thay đổi cụ thể điều kiện ni cấy đẩy nhanh tốc độ sinh trưởng, rút ngắn giai đoạn sinh trưởng dẫn đến hoa sớm Với kỹ thuật này, nhà khoa học hướng tới việc nghiên cứu sâu tượng sinh lý trình hoa Đây bước tiến quan trọng đường chinh phục thiên nhiên người Xuất phát từ vấn đề trên, đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến trình hoa hoa Mõm chó (Torenia fournieri L.) nuôi cấy in vitro” tiến hành thực Mục tiêu đề tài Mục tiêu đề tài xác định vai trò số yếu tố ánh sáng, loại nồng độ đường, chất điều hịa sinh trưởng thực vật, mơi trường khoáng, acid amin polyamine hoa T fournieri in vitro Nội dung nghiên cứu Nội dung Nghiên cứu vai trò số yếu tố đến hoa T fournieri in vitro Nội dung 2: Quan sát hình thái, cấu trúc mô phân sinh hoạt động biến dưỡng T fournieri in vitro trình hoa CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Torenia fournieri (T fournieri) Đặc điểm thực vật học Phân loại v Giới: Plantae (Thực vật) v Ngành: Magnoliophyta (ngành Ngọc Lan) v Lớp: Magnoliopsida (Lớp Ngọc Lan) v Bộ: Lamiales (Hoa môi) v Họ: Scrophulariaceae (Huyền sâm hay Mõm chó) v Chi: Torenia v Lồi: Torenia fournieri L Hình dạng ngồi T fournieri mơ tả sau: v Thân: màu xanh, cao từ 15-35 cm, thường mọc thẳng, số lồi có dạng thân bị v Lá: màu xanh bóng, dài đến cm, có dạng đơn giản, hình trứng (trái xoan), bờ có cưa, xếp theo kiểu đối xứng vòng v Hoa: đa dạng màu sắc hình dạng Các màu truyền thống gồm: tía, tím, xanh; màu kể là: trắng, đỏ, hồng, màu kép, vàng Hoa thường có cấu tạo bốn cánh (đơi có nhiều hơn) với hai mơi Môi trên: lớn cánh, bị che khuất phần, thường có dạng xoăn gấp nếp Mơi dưới: nhỏ hơn, thùy trịn, thường có chấm vàng đặc trưng Tuy nhiên, vài loài mới, chấm bị đi, tồn bơng hoa có màu Torenia fournieri thuộc nhóm thực vật mầm, thân thảo lâu năm hầu hết trồng năm T fournieri lưỡng bội (n = 9) Cây tứ bội thể (n = 18) tạo cách xử lý colchicine có hoa tương đối lớn mang lại tiềm phát triển giống thương mại Tuy nhiên, tứ bội này, khả sống sót phấn hoa giảm đáng kể, hình thành hạt phân bố nhiễm sắc thể không đồng giai đoạn phân chia tế bào (anaphase) so sánh với bố mẹ lưỡng T fournieri lồi hoa ưa thích màu sắc đa dạng, dễ chăm sóc thích hợp cho nhiều mục đích trồng chậu, làm cảnh, làm hàng rào hay đơn giản trồng để che phủ mặt đất Ngồi giá trị trang trí, T fournieri cịn loại mơ hình thí nghiệm hữu ích cho nhà tế bào học nghiên cứu lai tạo dễ thực tính chất nhơ túi phôi T fournieri sử dụng để nghiên cứu vị trí di chuyển nhiễm sắc thể tâm động giai đoạn đầu trình tạo phơi lai 1.2 Các đường hoa thực vật Các chế tiến hoá thực vật diễn cách chặt chẽ để đảm bảo hoa phải xảy vào thời điểm tối ưu giúp cho trình sinh sản thành công Sự phối hợp chế điều hoà cần thống nhiều yếu tố từ môi trường với yếu tố nội sinh để trình chuyển tiếp hoa diễn vào thời điểm Trên thực tế, có đường hoa thực vật bao gồm quang kỳ, đường lượng, chất điều hòa sinh trưởng đường tự chủ hoa nghiên cứu từ mơ hình A thaliana Tuy nhiên, khơng phải tất thực vật có hoa hoa theo bốn đường Tuỳ theo loài, điều kiện sống định thực vật có yếu tố kích thích khác phù hợp cho trình sinh sản 1.3 Những thành tựu nghiên cứu nước hoa in vitro Torenia 1.3.1 Một số nghiên cứu nước Chất điều hoà sinh trưởng thực vật ln giữ vai trị quan trọng thực vật điều khiển hoa chất điều hòa sinh trưởng nghiên cứu rộng rãi Lê Hồng Thuỷ Tiên (2006) nghiên cứu hoa in vitro dừa cạn (Catharanthus roseus) dã yên thảo (Petunia hybrida), hoa thành công môi trường MS bổ sung 0,05 mg/l TDZ 0,1 mg/l NAA Tổ hợp cytokinin auxin sử dụng nhiều để cảm ứng hoa BA NAA (có thể IAA, IBA) tím phi (Saintpaulia ionantha Wendl), mào gà (Celosia cristala), hoa hồng mini (Rosa hybrida) Bên cạnh đó, GA3 sử dụng cảm ứng hoa in vitro thành cơng lan sị (Dischidia pectinoides Pearson) Ngoài tác động cảm ứng hoa, chất điều hịa sinh trưởng thực vật cịn đóng vai trị hỗ trợ cho phát triển hoa hồn chỉnh rút ngắn thời gian hoa Ở mào gà (Celosia cristala), PBZ nồng độ 2,0 mg/l làm tăng tỷ lệ hoa cảm ứng hoa sớm, thời gian 30 ngày thay 50 ngày sau nuôi cấy Kinetin với nồng độ 1,0 mg/l thúc đẩy hình thành thêm phác hoa nhỏ, nồng độ thấp xuất nhiều bắc, làm ảnh hưởng đến tăng trưởng hoa Đối với hoa hướng dương (Helianthus annuus), môi trường bổ sung 50 g/l sucrose kết hợp 1,0 mg/l IBA giúp phận hoa phát triển hoàn chỉnh 1.3.2 Một số nghiên cứu nước Hiện nay, có nhiều nghiên cứu hoa in vitro loài lan thuộc chi Dendrobium loài D madame, D chao-praya-smile D candididum Ở loài lan khác C goeringii C hybridium, hoa ống nghiệm ghi nhận nghiên cứu Li-Ming Ji-Liang (2006) Cảm ứng hoa in vitro cách sử dụng cytokinin gibberellin nghiên cứu Pharbitis nil, Passiflora suberosa Lilium longiflorum Một số nỗ lực thành công việc tạo hoa hồng in vitro báo cáo Năm 2013, Zeng đồng tác giả nghiên cứu thành công hoa in vitro hoa hồng mini (Rosa hybrida cv Fairy Dance) Sự hoa ống nghiệm nghiên cứu nuôi cấy phôi soma số B vulgaris D giganteus John Nadgauda (1997) tạo hoa in vitro Bambusa vulgaris var vittata B arundinacea Một số loài tre khác dùng làm nguồn vật liệu để nghiên cứu hoa B edulis, D hookeri D latiflorus Những nỗ lực nghiên cứu hoa in vitro thành công thực số dược liệu Seidlova đồng tác giả (1981) nghiên cứu ảnh hưởng ABA hoa ngày ngắn Chenopodium rubrum Ở nhân sâm (Panax ginseng), Tang (2000) nghiên cứu hoa ống nghiệm từ nuôi cấy phôi Những thay đổi hàm lượng chất điều hịa sinh trưởng nội sinh q trình phân biệt chồi hoa chồi sinh dưỡng nuôi cấy lớp mỏng tế bào Cichorium intybus nghiên cứu Ying-zhang Bi-wen (1996) Sự hoa ống nghiệm nghiên cứu thuốc có giá trị Solanum nigrum, Centaurium pulchellum Chamomilla recutita, Vadawale đồng tác giả (2006) nghiên cứu thành công hoa ngũ chảo (Vitex negundo) in vitro CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Cây hoa T fournieri, giống hoa màu tím trắng sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu Lá hoa T fournieri ex vitro khử trùng sơ bề mặt với xà phịng lỗng đặt vòi nước chảy 30 phút Chuyển mẫu vào tủ cấy, lắc mẫu dung dịch HgCl2 0,1% với 1-2 giọt tween 20 thời gian phút Sau đó, mẫu rửa lại nước cất khử trùng lần cấy vào môi trường Murashige Skoog (MS) bổ sung 30 g/l sucrose, g/l agar 0,5 mg/l BA để tái sinh chồi Sau đó, mẫu chồi cấy chuyền sang môi trường MS để tạo mẫu chồi khỏe mạnh đồng nhất, chồi đạt chiều cao 2,0 cm sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho thí nghiệm 2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu vai trò số yếu tố đến hoa T fournieri in vitro 2.2.1.1 Thí nghiệm 1.1: Nghiên cứu vai trị ánh sáng đến hoa T fournieri in vitro 2.2.1.2 Thí nghiệm 1.2: Nghiên cứu vai trị đường đến hoa T fournieri in vitro 2.2.1.3 Thí nghiệm 1.3: Nghiên cứu vai trị chất điều hoà sinh trưởng thực vật ngoại sinh đến hoa T fournieri in vitro 2.2.1.4 Thí nghiệm 1.4: Nghiên cứu vai trị mơi trường khống đến hoa T fournieri in vitro 2.2.1.5 Thí nghiệm 1.5: Nghiên cứu vai trị acid amin (L-tyrosine, arginine proline) đến hoa T fournieri in vitro 2.2.1.6 Thí nghiệm 1.6: Nghiên cứu vai trò polyamine (spermidine, spermine, putrescine) đến hoa T fournieri in vitro 2.2.2 Nội dung 2: Quan sát hình thái, cấu trúc mơ phân sinh hoạt động biến dưỡng T fournieri in vitro trình hoa 2.3 Điều kiện ni cấy Các thí nghiệm ni cấy đặt điều kiện chiếu sáng với thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày, cường độ ánh sáng 45 ± µmol m-2 s-1, nhiệt độ: 25 ± 2°C, độ ẩm trung bình: 60 ± 5% 2.4 Phương pháp nghiên cứu • Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật • Phương pháp giải phẫu hình thái mơ phân sinh • Phương pháp đo hàm lượng chlorophyll thực vật • Phương pháp đo hàm lượng đường tổng số thực vật • Phương pháp đo cường độ quang hợp hơ hấp thực vật • Phương pháp đo diện tích • Phương pháp thu thập, thống kê xử lý số liệu CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung Ảnh hưởng số yếu tố lên hoa T fournieri in vitro 3.1.1 Vai trò ánh sáng đến hoa T fournieri in vitro Một đường quan trọng cảm ứng hoa thực vật đường ánh sáng Chất lượng, cường độ thời gian chiếu sáng ánh sáng ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng phát triển thực vật Nghiên cứu Dương Tấn Nhựt đồng tác giả (2013) T fournieri cho thấy T fournieri nuôi cấy điều kiện chiếu sáng với cường độ 45 µmol m-2 s-1 thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày, sau 60 ngày ni cấy, có thân to cứng cáp, xanh tỷ lệ hoa cao (70,06%) Kế thừa nghiên cứu trước đó, nghiên cứu chất lượng hay bước sóng ánh sáng khảo sát nhằm xác định vai trị bước sóng ánh sáng lên hoa T fournieri in vitro Chất lượng ánh sáng khác ảnh hưởng khác đến hoa T fournieri in vitro Sau 40 ngày nuôi cấy, kết bảng 3.1 cho thấy có khác biệt có ý nghĩa thống kê nghiệm thức sử dụng đèn LED nghiệm thức sử dụng đèn huỳnh quang Tỷ lệ hoa T fournieri in vitro cao 50% LED đỏ kết hợp với 50% LED xanh tỷ lệ hoa 19,59% với số nụ hoa/chồi 0,33 Khi tăng tỷ lệ ánh sáng LED đỏ lên 60% tỷ lệ hoa giảm 13,34% Khi tỷ lệ ánh sáng LED đỏ vượt qua tỷ lệ hoa bắt đầu giảm mạnh Điều phù hợp với nghiên cứu Dewir đồng tác giả (2006) Euphorbia millii, hoa ống nghiệm giảm tỷ lệ đèn LED đỏ tăng thực vật, chất mẫu cấy khả mẫu cấy sử dụng Tỷ lệ chồi hoa (%) nguồn carbon khác Hình 3.1 Ảnh hưởng loại nồng độ đường lên hoa T fournieri in vitro sau 40 ngày nuôi cấy Việc phân biệt cảm ứng hoa phát triển hoa liên quan đến hoạt động đường vấn đề cần xem xét Trong loại đường cụ thể khơng kích thích cảm ứng hoa, có tác động tích cực đến phát triển hoa ghi nhận T fournieri Trong nghiên cứu này, sucrose không ảnh hưởng đáng kể đến cảm ứng hình thành hoa, nghiên cứu trước T fournieri, bổ sung sucrose với nồng độ 60 g/l vào mơi 11 trường cảm ứng hoa (mơi trường ¼MS) tỷ lệ hoa số nụ hoa cao so với nghiệm thức đối chứng (nghiệm thức sử dụng môi trường cảm ứng) Điều cho thấy, sucrose khơng có vai trị cảm ứng hoa mà có vai trị thúc đẩy phát triển hoa T fournieri in vitro 3.1.3 Vai trị chất điều hồ sinh trưởng thực vật hoa T fournieri in vitro Ảnh hưởng GA3 kết hợp với ABA lên cảm ứng hoa T fournieri in vitro Tanimoto đồng tác giả (1985) cho thấy nuôi cấy chồi T fournieri môi trường không bổ sung CĐHST thực vật, hình thành hoa bị ảnh hưởng nhân tố nội sinh bên mẫu, có hàm lượng ABA nội sinh Do đó, bổ sung 0,1 mg/l ABA vào môi trường nuôi cấy kích thích hình thành hoa mẫu chồi T fournieri in vitro Kết phù hợp với kết thí nghiệm này, sử dụng ABA nồng độ khác cảm ứng hình thành hoa Ở nồng độ 1,5 mg/l ABA cho tỷ lệ hình thành hoa cao so với nghiệm thức lại (các nghiệm thức kết hợp ABA với GA3) cao so với nghiệm thức đối chứng, tỷ lệ hoa nghiệm thức 80% so với 40% nghiệm thức đối chứng (Bảng 3.2) Điều cho thấy, T fournieri, ABA đóng vai trị quan trong cảm ứng hình thành hoa Một số nghiên cứu gần cho thấy tác động ABA cảm ứng hoa giải thích biểu gene abi3, abi5 basic leucine zipper, gene đóng vai trị quan trọng cảm ứng hoa cách điều hòa biểu gene flc Một protein khác tham gia điều khiển hoa HAB1 (HYPERSENSITIVE TO ABA 1), yếu tố ức chế đáp ứng tín 12 hiệu ABA Biểu protein HAB1 tìm thấy cảm ứng hoa A thaliana Protein HAB1 tương tác với phức hợp protein SWI/SNF Nhóm tác giả cho tương tác protein HAB1 phức hợp SWI/SNF (phức hợp chromatin) phiên mã để đáp ứng lại tín hiệu ABA cần thiết cho điều hòa gene liên quan đến đáp ứng tín hiệu ABA Có nhiều gene miRNA ghi nhận có liên quan đến hoa theo đường ABA Gene miR159 liên quan đến phát triển hoa, điều khiển biểu gene myb101, myb33 điều hòa ABA Gene miR160 điều khiển phát sinh hình thái hoa điều khiển ABA Mặt khác, biểu mức miR172c làm giảm nước thúc đẩy hoa sớm điểu khiển biểu gene ft lfy điều kiện ngày dài Gene miR172 cảm ứng ABA, liên quan đến chịu hạn làm tăng độ nhạy ABA, đẩy nhanh đáp ứng với khô hạn Trong nghiên cứu này, thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng GA3 riêng lẻ hay GA3 kết hợp với ABA nồng độ khác lên hoa T fournieri in vitro, sau 40 ngày nuôi cấy, kết thu cho thấy tỷ lệ hoa nghiệm thức thấp so với nghiệm thức sử dụng ABA riêng lẻ nghiệm thức đối chứng Điều cho thấy GA3 ảnh hưởng không đáng kể đến cảm ứng hoa lồi Vai trị GA3 lên cảm ứng hoa không phụ thuộc vào quang kỳ chưa chứng minh cụ thể, GA3 nhân tố thúc đẩy hoa lồi khơng ảnh hưởng lên hoa loài khác 13 Bảng 3.2 Ảnh hưởng GA3 kết hợp với ABA lên hoa T fournieri in vitro sau 40 ngày nuôi cấy CĐHSTTV Tỷ lệ chồi Số nụ Chiều cao GA3 ABA hoa (%) hoa /mẫu chồi (cm) (mg/l) (mg/l) bc bcd 0,0 40,00 5,92 0,63bc 0,5 40,00bc 6,37b 0,63bc ab bcd 0,0 1,0 46,67 5,58 0,73ab a a 1,5 80,00 8,08 1,33a 2,0 20,00bcd 5,45bcd 0,30bc bcd bcd 0,0 13,33 5,60 0,20bc bcd bcd 0,5 26,67 5,08 0,37bc 0,5 bcd b 1,0 20,00 6,41 0,27bc 1,5 23,33bcd 6,19bc 0,47bc d bcd 2,0 0,00 5,43 0,00c d bcd 0,0 0,00 6,12 0,00c 0,5 0,00d 6,37b 0,00c d bcd 1,0 1,0 0,00 5,56 0,00c d bcd 1,5 3,33 5,73 0,07bc cd bcd 2,0 10,00 5,98 0,13bc 0,0 6,67cd 5,91bcd 0,10bc cd bcd 0,5 6,67 5,27 0,13bc d cd 1,5 1,0 0,00 4,63 0,00c 1,5 3,33d 4,59d 0,03c cd cd 2,0 10,00 4,65 0,17bc cd bcd 0,0 3,33 5,32 0,03c cd bcd 0,5 10,00 5,59 0,10bc 2,0 d bcd 1,0 0,00 5,50 0,00c 1,5 0,00d 5,43bcd 0,00c d bcd 2,0 3,33 5,11 0,03c PGA * * * PABA * * * PGA*ABA * * * Trong cột, số có chữ theo sau khác có khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 5% (*) 14 Ảnh hưởng GA3 kết hợp với BA lên cảm ứng hoa T fournieri in vitro Đối với T fournieri, kết cho thấy kết hợp BA với GA3, chồi T fournieri in vitro khơng có hình thành hoa, hình thành chồi với chiều cao chồi trung bình khoảng 3,0 cm, đốt thân dài có tượng thuỷ tinh thể Các kết tương tự thu nghiên cứu Tylophora indica GA3 báo cáo thích hợp cho tái sinh chồi in vitro, thúc đẩy tăng trưởng, sản xuất sinh khối kéo dài mạch xylem Ảnh hưởng BA kết hợp với NAA lên cảm ứng hoa T fournieri in vitro Tương tự nghiệm thức GA3 kết hợp với BA, sau 40 ngày nuôi cấy môi trường MS bổ sung BA NAA, kết cho thấy loại chất điều hịa sinh trường khơng ảnh hưởng đến hoa T fournieri in vitro Trên môi trường bổ sung BA nồng độ thấp (0,5 mg/l BA), chiều cao chồi trung bình cao so với mẫu cấy môi trường bổ sung BA nồng độ cao có hình thành rễ mẫu cấy 3.1.4 Vai trị mơi trường khống đến hoa T fournieri in vitro Nhằm đánh giá ảnh hưởng mơi trường khống sinh trưởng hình thành hoa T fournieri in vitro, thí nghiệm thực với mơi trường MS cải biến môi trường đến hình thành hoa T fournieri in vitro thực Sau 40 ngày ni cấy, tỷ lệ hình thành hoa mơi trường ¼MS 60,00% cao so với đối chứng mơi trường cịn lại Các thành phần đa lượng mơi trường ¼MS ½MS bị giảm theo tỷ lệ ½; ¼ thành phần vi lượng khơng đổi so với môi trường MS, thay đổi dẫn đến tỷ lệ C/N môi trường 15 bị thay đổi Điều giải thích nguyên tố đa lượng, đặc biệt N, diện với hàm lượng cao phần ức chế chuyển đổi từ pha sinh dưỡng sang pha sinh sản hình thành chồi hoa T fournieri Trong mơi trường ni cấy, giảm hàm lượng khống đa lượng dẫn theo hàm lượng N giảm theo hàm lượng C khơng đổi, dẫn đến tỷ lệ C/N cao, điều kích thích hoa, ngược lại tỷ lệ C/N thấp, phát sinh dinh dưỡng chiếm ưu Theo Tanimoto Harada (1981), tỷ lệ C/N có vai trị quan trọng chuyển tiếp hoa thực vật Tỷ lệ C/N mơi trường ¼MS cao so với môi trường MS, nuôi cấy môi trường có tỷ lệ C/N cao vào trạng thái sinh sản, kết phù hợp với nghiên cứu Wang đồng tác giả (2002) Bảng 3.3 Ảnh hưởng mơi trường khống lên hoa T fournieri in vitro sau 40 ngày nuôi cấy NT Tỷ lệ chồi hoa (%) Số nụ hoa/chi ẵMS 43,33ab 0,47 MSẵ 23,33bc 0,33 a ẳMS 60,0 0,70 MS¼ 6,67c 0,07 MS 16,67bc 0,27 P * ns Chiều cao chồi (cm) 6,20b 6,34b 8,70a 9,13a 5,25b * Trong cột, số có chữ theo sau khác có khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 5% (*); ns: khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê 3.1.5 Vai trị acid amin (proline, arginine L-tyrosine) đến hoa T fournieri in vitro Trong loại acid amine khảo sát, kết cho thấy hình thành hoa thay đổi tùy vào loại nồng độ acid amin bổ sung vào môi trường nuôi cấy Đối với T fournieri, arginine nồng độ 1,5 mg/l thích hợp cho hình thành hoa (Hình 3.2) Vai trị acid amin đến cảm ứng hoa khơng rõ ràng hầu hết 16 nghiệm thức sử dụng acid amin cảm ứng hoa xuất ngày thứ 80 sau nuôi cấy, so với yếu tố khác hình thành hoa T5,0 T4,5 T4,0 T3,5 T3,0 T2,5 T2,0 T1,5 T1,0 A5,0 A4,5 A4,0 A3,5 A3,0 A2,5 A2,0 A1,5 A1,0 P5,0 P4,5 P4,0 P3,5 P3,0 P2,5 P2,0 P1,5 P1,0 MS TY LE RA HOA CCC 80 60 40 20 T5,0 T4,5 T4,0 T3,5 T3,0 T2,5 T2,0 T1,5 T1,0 A5,0 A4,5 A4,0 A3,5 A3,0 A2,5 A2,0 A1,5 A1,0 P5,0 P4,5 P4,0 P3,5 P3,0 P2,5 P2,0 P1,5 P1,0 MS Acid amine xảy ngày thứ 40 sau ni cấy Hình 3.2 Ảnh hưởng acid amin lên hoa T fournieri in vitro sau 80 ngày nuôi cấy P1.0, P1.5, P2.0, P2.5, P3.0, P3.5, P4.0, P4.5, P5.0: tương ứng với proline nồng độ từ 1,0 đến 5,0 mg/l; A1.0, A1.5, A2.0, A2.5, A3.0, A3.5, A4.0, A4.5, A5.0: tương ứng với arginine nồng độ từ 1.0 đến 5.0 mg/l; T1.0, T1.5, T2.0, T2.5, T3.0, T3.5, T4.0, T4.5, T5.0: tương ứng với L-tyrosine nồng độ từ 1,0 đến 5,0 mg/l 17 3.1.6 Vai trò polyamine (spermidine, spermine, putrescine) đến hoa T fournieri in vitro Polyamine (PA) xem nhóm chất điều hịa sinh trưởng thực vật, tác động PA lên cảm ứng hoa tùy thuộc vào loại thực vật khác nhau, nồng độ loại PA khảo sát Năm loại enzyme sinh tổng hợp quan trọng liên quan đến sinh tổng hợp PA thực vật bậc cao nghiên cứu: arginine decarboxylase (ADC), ornithine decarboxylase (ODC), S- adenosylmethionine decarboxylase (SAMDC), Spd synthase (SPDC) Spm synthase (SPMS) Các chức sinh lý quan trọng PA nội sinh cảm ứng hoa hình thành quan sơ khởi hoa xác nhận nhiều nghiên cứu khác Triamine Spd, quan trọng ba PA nói trên, có liên quan đến nhiều q trình sinh lý Trong Polianthes tuberosa, Spd Cad điểm đánh dấu cho biệt hóa tạo hoa Các thí nghiệm Cucurbita pepo Ginkgo biloba phát Spd chiếm ưu trình biệt hóa tạo hoa Khi Spd đạt đến mức độ định dẫn đến việc thúc đẩy biểu gen hoa, kích hoạt tổng hợp protein đặc biệt cuối hình thành sơ khởi hoa Điều giải thích vai trị quan trọng Spd ngoại sinh hoa T fournieri in vitro Trong nghiên cứu này, loại polyamine khác ảnh hưởng khác đến cảm ứng hoa T fournieri in vitro Spermidine spermine thích hợp cho cảm ứng hoa T fournieri, tỷ lệ hình thành hoa đạt 43,33% số nụ hoa/mẫu đạt 0,47 nụ hoa nuôi cấy T fournieri môi trường bổ sung 40 mg/l spermidine Tỷ lệ hình thành hoa T fournieri mơi trường có bổ sung 40 mg/l spermine 43,33% số chồi hoa/mẫu đạt 0,80 chồi hoa/mẫu 18 TY LE RA HOA CCC 60 40 20 PUT40 PUT30 PUT20 PUT10 PUT1 SPM40 SPM30 SPM20 SPM10 SPM1 SPD40 SPD30 SPD20 SPD10 SPD1 MS Polyamine PUT40 PUT30 PUT20 PUT10 PUT1 SPM40 SPM30 SPM20 SPM10 SPM1 SPD40 SPD30 SPD20 SPD10 SPD1 MS Hình 3.3 Ảnh hưởng polyamine lên hoa T fournieri in vitro sau 80 ngày nuôi cấy SPD1, SPD10, SPD20, SPD30, SPD40: tương ứng với spermidine nồng độ từ 1,0 đến 40 mg/l; SPM1, SPM10, SPM20, SPM30, SPM40: tương ứng với spermine nồng độ từ 1,0 đến 40 mg/l; PUT1, PUT 10, PUT 20, PUT 30, PUT 40: tương ứng với putrescine nồng độ từ 1,0 đến 40 mg/l; MS: nghiệm thức đối chứng sử dụng môi trường MS; CCC: chiều cao chồi Nhiều nghiên cứu PA ngoại sinh ảnh hưởng đến cảm ứng hoa số Spirodela punctata, thuốc Pharbitis nil PA ngoại sinh chứng minh đẩy nhanh q trình biệt hóa tạo hoa hàm lượng PA cao chồi đỉnh có lợi cho việc bắt đầu trì biệt hóa tạo nụ hoa cúc Ở A thaliana, việc bổ sung PA ngoại sinh thúc đẩy đáng kể phản ứng hoa loài Tuy nhiên, PA gây ức chế hoa loài Lemna aequinoctialis điều kiện cảm ứng quang kỳ Tùy theo loại PA khác mà tác động đến trình hoa 19 loại khác Trong nghiên cứu này, Put loại PA không ảnh hưởng đến hoa T fournieri in vitro Trong nghiên cứu này, so sánh yếu tố ảnh hưởng đến hoa khác ánh sáng, đường chất điều hòa sinh trưởng thực vật hay mơi trường khống yếu tố PA cảm ứng hoa ngày thứ 80 sau nuôi cấy, ngày thứ 40 sau nuôi cấy hầu hết nghiệm thức sử dụng polyamine khơng có hình thành hoa Tuy nhiên, chồi T fournieri in vitro ni cấy mơi trường ¼MS bổ sung spermidine nồng độ từ 0,2-0,4 mg/l spermidine tỷ lệ hoa tăng từ 72,22-77,78% cao so với nghiệm thức đối chứng (61,11%) ngày thứ 40 sau ni cấy (Hình 3.3) Điều cho thấy PA khơng đóng vai trị quan trọng lên cảm ứng hoa có vai trị việc thúc đẩy phát triển hoa 3.2 Nội dung 2: Sự thay đổi hình thái, cấu trúc mơ phân sinh chồi hoạt động biến dưỡng trình hoa T fournieri in vitro 3.2.1 Hình thái hoa thay đổi mô phân sinh chồi trình hoa T fournieri in vitro Trong trình hoa T fournieri in vitro, ngày thứ 10, 20 hầu hết khơng có xuất nụ hoa, đến ngày thứ 30 thấy có xuất nụ hoa, đến ngày thứ 40 nụ hoa phát triển lớn hơn, sau ngày thứ 50 60 nụ hoa phát triển to nở thành hoa hoàn chỉnh Nụ hoa T fournieri in vitro giai đoạn 40 ngày sau nuôi cấy cắt dọc để quan sát nhận thấy hoa có cấu trúc hồn chỉnh, khơng có khác biệt kiểu hình so với hoa trồng bên ngồi Dựa theo mơ hình cấu trúc hoa ABC, hoa T fournieri in vitro phát triển hồn tồn bình thường, với cấu trúc gồm đài hoa, cánh hoa, nhị noãn Hoa T fournieri in vitro thường hình thành đỉnh chồi nách 20 Trong nghiên cứu này, vấn đề ghi nhận màu hoa chuyển sang màu tím nhạt hay màu trắng hồn tồn, có khác biệt so với vật liệu nghiên cứu ban đầu giống hoa màu tím trắng Điều Dương Tấn Nhựt đồng tác giả (2013) giải thích thay đổi màu sắc hoa T fournieri in vitro tương tác thành phần khoáng môi trường nuôi cấy mà ảnh hưởng biến đổi di truyền Quá trình cảm ứng hoa trải qua nhiều bước, có thay đổi cấu trúc mô phân sinh hoa Ở trạng thái sinh dưỡng, mơ phân sinh có kích thước nhỏ, chưa có biệt rõ ràng Khi cảm ứng hoa diễn ra, hàng loạt thay đổi mặt sinh lý mô phân sinh chồi xảy để chuẩn bị cho bước vào trình chuyển tiếp từ giai đoạn sinh dưỡng sang giai đoạn sinh sản Điều quan trọng để hoa diễn thành cơng (Glover, 2007) Khi cịn giai đoạn sinh dưỡng, mơ phân sinh chồi T fournieri in vitro có dạng hình đĩa, phẳng, cấu trúc khơng rõ ràng mang hai phác thể Trong giai đoạn cảm ứng hoa, đường kính mơ phân sinh tăng lên, cấu trúc rõ ràng chuyển từ dạng hình đĩa sang dạng hình vịm Cụ thể là, tế bào vùng trung tâm vùng ngoại biên bắt đầu nhô lên, sơ khởi đài xuất hiện, sau sơ khởi cánh hoa, sơ khởi nhị, sau kéo dài cánh hoa cuối nụ hoa phát triển 3.2.2 Mối liên hệ biến đổi sinh lý hình thái mơ phân sinh chồi trong q trình hoa Trong trình cảm ứng hoa thực vật, thường có thay đổi mặt sinh lý trước có biến đổi mặt hình thái Trong q trình ni cấy, giai đoạn từ 0-10 ngày, chồi T fournieri cấy chuyển sang môi trường nên sinh lý mẫu cấy chưa ổn định dẫn đến cường độ hô hấp gia tăng, cường độ hô hấp đạt cao ngày 21 thứ 10 sau ni cấy (0,55 µmO2/10cm2/phút) Chỉ tiêu giảm từ ngày 10 đến ngày thứ 20 sau tăng lên vào ngày thứ 40 sau ni cấy Ngược lại, tiêu cường độ quang hợp, chồi T fournieri in vitro giai đoạn từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 20 có cường độ quang hợp tăng nhanh, sau giảm giai đoạn sau 30 ngày ni cấy Điều giải thích giai đoạn phát triển sinh dưỡng cường độ quang hợp tăng mạnh để giúp cho tổng hợp chất dinh dưỡng cần thiết Khi bước vào giai đoạn hoa, thực vật cần nhiều lượng chất cần thiết cho hình thành phát triển hoa nên q trình hơ hấp tăng nhanh giúp phân giải chất dự trữ tạo chất cần thiết cho phản ứng sinh tổng hợp Ở giai đoạn từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 30 sau ni cấy, hàm lượng đường có mẫu T fournieri tăng đáng kể (40,078-68,254 µg/g) tăng cao ngày thứ 30 Vấn đề Bernier đồng tác giả (1993) ghi nhận nghiên cứu Sinapis alba, có gia tăng hàm lượng sucrose đỉnh chồi vào thời điểm chuyển tiếp hoa KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Kết nghiên cứu cho thấy tất yếu tố khảo sát tác động đến cảm ứng hoa T fournieri in vitro ảnh hưởng khác tùy thuộc vào loại yếu tố, nồng độ thời gian nuôi cấy khác Đối với nghiệm thức ánh sáng, tỷ lệ kết hợp đèn LED xanh LED đỏ khác ảnh hưởng khác lên hoa T fournieri in vitro Ở điều kiện chiếu sáng có tỷ lệ kết hợp 50% LED đỏ 50% LED xanh có tỷ lệ hoa tốt nhất, tỷ lệ hoa 19,59% Các chồi ni cấy mơi trường 22 có bổ sung đường với nồng độ loại khác tỷ lệ chồi hoa khác nhau, chồi T fournieri nuôi cấy môi trường MS bổ sung 50 g/l glucose có tỷ lệ chồi hoa cao nghiệm thức sử dụng nồng độ đường lại, tỷ lệ hoa 51,48% sau 40 ngày nuôi cấy Những loại đường đơn glucose fructose ảnh hưởng đến hoa tốt so với loại đường đôi sucrose maltose Môi trường ¼MS môi trường cảm ứng hoa tốt so với mơi trường khống cịn lại với tỷ lệ hình thành hoa 60% sau 40 ngày ni cấy Các nghiệm thức sử dụng acid amin polyamine khơng có cảm ứng hoa vào ngày thứ 40 sau nuôi cấy, tượng hoa xảy ngày thứ 80, so với yếu tố khác cảm ứng hoa xảy trễ Khi đánh giả ảnh hưởng loại acid amin arginine, proline, L-tyrosine lên hoa, arginine nồng độ 1,5 mg/l thích hợp cho hoa T fournieri in vitro, tỷ lệ chồi hoa đạt 60,0% Đối với polyamine, spermidine spermine thích hợp cho cảm ứng hoa T fournieri in vitro, tỷ lệ chồi hoa đạt 43,33% số nụ hoa/mẫu đạt 0,47 nụ hoa nuôi cấy T fournieri môi trường bổ sung 40 mg/l spermidine Tỷ lệ chồi hoa T fournieri mơi trường có bổ sung 40 mg/l spermine 43,33% Bên cạnh yếu tố trên, ABA dường yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoa Torenia fournieri in vitro Môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l ABA thích hợp cho cảm ứng hoa T fournieri in vitro với tỷ lệ chồi hoa 80% Sự biến đổi trình hoa: • Trong q trình ni cấy, giai đoạn từ 0-10 ngày, chồi T fournieri có cường độ hô hấp đạt cao ngày thứ 10 sau ni cấy (0,55 µmO2/10cm2/phút) Chỉ tiêu giảm từ ngày 10 đến ngày thứ 20, sau tăng vào ngày thứ 40 sau nuôi cấy Ngược lại, cường độ 23 quang hợp chồi T fournieri in vitro giai đoạn từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 20 tăng nhanh, sau giảm giai đoạn sau 30 ngày nuôi cấy Ở giai đoạn từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 30 sau nuôi cấy, hàm lượng đường có mẫu T fournieri in vitro tăng đáng kể tăng cao ngày thứ 30, hàm lượng đường giai đoạn 68,254 µg/g Kết tương tự đánh giá tác động đèn LED đến trình hoa T fournieri in vitro, hầu hết nghiệm thức hàm lượng đường nội sinh tăng đáng kể thời điểm ngày thứ 30 sau nuôi cấy, trùng với thời điểm ghi nhận bắt đầu cảm ứng hoa Kiến nghị Để nắm rõ trình hoa T fournieri in vitro, số nghiên cứu cần thực thêm như: v Nghiên cứu tiếp tục tác động ánh sáng đèn LED với tỷ lệ ánh sáng xanh cao lên trình hoa T fournieri in vitro v Nghiên cứu biểu gene liên quan đến trình hoa T fournieri in vitro tác động yếu tố khác NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Acid abscisic (ABA) nồng độ 1,5 mg/l đóng vai trị quan trọng lên khả hoa Torenia fournieri in vitro với tỷ lệ hoa đạt 80% Những loại đường đơn glucose fructose có tác động đến hoa T fournieri in vitro tốt so với loại đường đôi sucrose maltose Bên cạnh đó, arginine, spermidine spermine ảnh hưởng đáng kể đến hình thành hoa T fournieri in vitro 24 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Trần Trọng Tuấn, Trần Thị Mỹ Trâm, Phạm Thị Ngọc Thúy, Nguyễn Hữu Hổ, Dương Tấn Nhựt (2015) Ảnh hưởng amino acid polyamine lên trình hoa in vitro hoa Mõm chó (Torenia fournieri L.) Tạp chí cơng nghệ sinh học, 13(3): 929-937 Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Hữu Hổ, Dương Tấn Nhựt (2015) Ảnh hưởng gibberrellic acid, proline spermidine lên hình thành hoa Torenia (Torenia fournieri L.) Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 13(1): 123-130 Trần Trọng Tuấn, Đỗ Đức Thăng, Nguyễn Hữu Hổ, Dương Tấn Nhựt (2015) Ảnh hưởng ánh sáng đường lên trình hoa hoa mõm chó (Torenia fournieri L.) ni cấy in vitro Tạp chí Công nghệ Sinh học, 13(4A): 1303-1311 Dương Tấn Nhựt, Lê Văn Thức, Trần Trọng Tuấn, Trương Thị Diệu Hiền, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, Vũ Quốc Luận (2013) Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến hình thành hoa in vitro Torenia (Torenia fournieri L.) Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 51(6): 689-702 Duong Tan Nhut, Nguyen Thanh Hai, Pham Thi Minh Thu, Nguyen Ngoc Thi, Truong Thi Dieu Hien, Tran Trong Tuan, Nguyen Ba Nam, Nguyen Phuc Huy, Hoang Xuan Chien, and Shri Mohan Jain (2013) Protocol for inducing flower color somaclonal variation in torenia (Torenia fournieri Lind.) In: Lambardi M., Ozudogru E.A., Jain S.H, ed., Protocol for micropropagation of selected economically – important horticultural plants Humana Press, Springer: 455-462 ... không ảnh hưởng đến hoa T fournieri in vitro Trong nghiên cứu này, so sánh yếu tố ảnh hưởng đến hoa khác ánh sáng, đường chất điều hòa sinh trưởng thực vật hay mơi trường khống yếu tố PA cảm ứng hoa. .. 1: Nghiên cứu vai trò số yếu tố đến hoa T fournieri in vitro 2.2.1.1 Thí nghiệm 1.1: Nghiên cứu vai trị ánh sáng đến hoa T fournieri in vitro 2.2.1.2 Thí nghiệm 1.2: Nghiên cứu vai trị đường đến. .. kê xử lý số liệu CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung Ảnh hưởng số yếu tố lên hoa T fournieri in vitro 3.1.1 Vai trò ánh sáng đến hoa T fournieri in vitro Một đường quan trọng cảm ứng hoa thực