Nghiên cứu vi sinh vật phân giải tanin dùng trong sản xuất phân bón tại chỗ cho các vùng trồng chè sạch

MỞ ĐẦU Chè là một trong những thức uống phổ biến nhất trên thế giới. Ngoài những giá trị cảm quan như mùi thơm và vị đặc trưng, chè còn có những giá trị y học đáng quý. Sản phẩm chè rất đa dạng và phong phú bao gồm nhiều loại chè như chè xanh, chè đen, chè vàng, chè Phổ Nhĩ và chè hòa tan... Tuy nhiên trong chè có chứa nhiều tannin. Tannin có độc tính và là hợp chất kìm hãm sự trao đổi các protein phức tạp trong vi sinh vật, làm dày màng tế bào thực vật khiến quá trình tiêu hoá trở nên khó khăn hơn. Nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh tannase. Tannase thuỷ phân tannin để ngưng tụ sản phẩm,một trong số chúng được sử dụng như một nguồn năng lượng. Ứng dụng chính của enzim này là sản xuất axit gallic. Axit gallic là cơ chất cho quá trình hoá học và trao đổi enzim của propyl gallate. Sử dụng như một chất chống oxi hoá cho dầu và mỡ cũng như trong công nghiệp đồ uống. Tannase phân giải trà xanh có tác dụng ức chế N- nitrosamine, một loại tác nhân gây ung thư, quái thai được tìm thấy trong một số chất bảo quản thịt. Ứng dụng của tannase trong việc phân giải tannin được biết đến rất rộng rãi. Gần đây, các nghiên cứu cho thấy trong quá trình phân giải tannin có sự tham gia của rất nhiều các loại vi sinh vật như : vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men và các chủng nấm sợi như Aspergillium niger, Penicillium spp.. Tuy nhiên,các bài báo cũng như các nghiên cứu khoa học hầu hết chỉ tập trung vào nấm sợi, thông tin về các nhóm vi sinh vật khác (như vi khuẩn, nấm men và xạ khuẩn) tham gia vào quá trình lên men gần như là không có. Ngành sản xuất và chế biến các sản phẩm từ chè của Việt nam có thêm nhiều cơ hội và thách thức sau khi chúng ta gia nhập WTO. Chất lượng chính là cách cửa để đưa chúng ta vươn xa trong kinh tế. Để chè thành phẩm có chất lượng tốt thì 30% phụ thuộc vào chế biến còn 70% là do quá trình cung cấp nguyên liệu. Đặc biệt sau mỗi vụ thu hoạch quá trình đốn chè rất quan trọng bởi nó ảnh hưởng trực tiếp tới sản lượng ra của búp chè lứa sau. Sản lượng chè đốn hàng năm của các vùng trồng chè là rất lớn nhưng hầu hết bà con nông dân đều bỏ qua nguồn nguyên liệu này. Nhằm tăng tốc độ phân huỷ của các loại phụ phẩm chè ngay tại gốc cây, việc ứng dụng các chế phẩm vi sinh cũng là một trong những phương pháp hữu hiệu nhằm rút ngắn thời gian phân huỷ và nâng cao tính kinh tế phục vụ cho bà con nông dân. Từ đó chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu vi sinh vật phân giải tanin dùng trong sản xuất phân bón tại chỗ cho các vùng trồng chè sạch”.

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp nhận hướng dẫn, giúp đỡ, bảo động viên thầy cô, bạn bè gia đình Trước tiên tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đào Thị Lương, người dẫn dắt bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, anh chị làm việc Viện Vi Sinh Vật Công Nghệ Sinh Học- Đại Học Quốc Gia Hà Nội giúp tơi q trình hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa CN Sinh viện đại học Mở Hà Nội dạy dỗ tơi q trình học tập Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ, hỗ trợ để tơi hồn thành luận văn Hà Nội, tháng 12 năm 2012 Sinh viên Nguyễn Thuỳ Anh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Nguồn gốc chè .3 1.2 Giới thiệu hợp chất tannin 1.2.1 Định nghĩa tannin 1.2.2 Cấu trúc hoá học phân loại 1.2.2.1 Cấu trúc hoá học 1.2.2.2 Phân loại 1.2.3 Tính chất tannin .6 1.2.3.1 Tính chất vật lí .6 1.2.3.2 Tính chất hố học 1.3 Giới thiệu enzim tannase [27] 1.3.1 Lịch sử phát triển 1.3.2 Cấu trúc 1.3.3 Vi sinh vật sinh tannase .8 1.3.4 Điều kiện nuôi cấy 1.3.4.1 Phương pháp nuôi cấy 10 1.3.4.2 Cơ chất môi trường nuôi cấy 10 1.3.4.3 Nhiệt độ lên men 13 1.3.4.4 pH môi trường .14 1.3.4.5 Thời gian lên men 14 1.3.5 Ứng dụng tannase 15 1.4 Tình hình sử dụng phế thải chè làm phân bón hữu 16 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 2.1 Nguồn vi sinh vật thiết bị 19 2.1.1 Nguồn vi sinh vật .19 2.1.2 Thiết bị, hố chất mơi trường 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Xử lí mẫu đất 21 2.2.2 Phương pháp phân lập giữ giống 21 2.2.3 Phương pháp đếm số lượng bào tử .21 2.2.3 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hoá 22 2.2.4 Phương pháp thu dịch enzym, khả phân hủy chất nuôi chè 22 2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzym ngoại bào 23 2.2.6 Phương pháp định lượng 23 2.2.7 Các điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh trưởng chủng nấm sợi 25 2.2.7.1 Lựa chọn nhiệt độ thích hợp .25 2.2.7.2 Lựa chọn pH thích hợp .25 2.2.7.3 Lựa chọn chất ni thích hợp 25 2.2.7.4 Lựa chọn thời gian thích hợp 26 2.2.7.5 Lựa chọn tỷ lệ giống cấy .26 2.2.6 Các điều kiện ni cấy thích hợp cho khả sinh tannase phân hủy chè 26 2.2.6.1 Độ ẩm thích hợp 26 2.2.6.2 Tỷ lệ giống cấy thích hợp 26 2.2.6.3 Bổ sung dịch khoáng 26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .27 3.1 Phân lập tuyển chọn 27 3.1.1 Phân lập .27 3.1.2 Tuyển chọn 27 3.1.2.1 Nuôi lắc môi trường chè có bổ sung tannic axit (1%) .27 3.1.2.2 Khả phân huỷ chè 29 3.2 Phân loại 31 3.3 Nghiên cứu điều kiện ni cấu thích hợp cho sinh trưởng 32 3.3.1 Lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng 32 3.3.2 Lựa chọn pH ni cấy thích hợp .33 3.3.3 Lựa chọn chất nuôi cấy thích hợp 33 3.3.4 Lựa chọn độ ẩm thích hợp 34 3.3.5 Lựa chọn tỉ lệ giống cấy thích hợp 35 3.3.6 Lựa chọn thời gian ni cấy thích hợp 36 3.4 Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả sinh tannase phân huỷ chè .37 3.4.1 Độ ẩm thích hợp cho khả sinh tannase chè chủng HB6.1 37 3.4.2 Tỷ lệ giống cấy thích hợp cho khả sinh tannase chè chủng HB6.1 .38 3.4.3 Bổ sung dịch khống thích hợp cho khả sinh tannase chè chủng HB6.1 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THẢM KHẢO .41 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit DeoxyriboNucleic CFU Colony Forming Unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc CMC CarboxylMethyl Cellulose HVA Humic acid - Vitamin Agar - Môi trường thạch humic vitamin ISP-4 International Streptomyces Project - - Môi trường ISP-4 PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng khuếch đại gen PDA Potato Dextrose Agar - Môi trường thạch khoai tây YM Yeast extract - Malt extract - Môi trường cao men cao malt YG Yeast extract – glucose – Môi trường cao men đường glucose DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sinh tannase cao 28 Bảng 3.2 Khả phân huỷ chè khô .29 Bảng 3.3 Khả sinh enzim ngoại bào phân giải chất .31 Bảng 3.4 Đường kính khuẩn lạc chủng HB6.1 32 Bảng 3.5 Lựa chọn pH ni cấy thích hợp 33Bảng 3.6 Cơ chất thích hợp chủng HB6.1 34 Bảng 3.7 Lựa chọn độ ẩm thích hợp chủng HB6.1 35 Bảng 3.8 Tỷ lệ giống thích hợp chủng HB6.1 35 Bảng 3.9 Thời gian ni thích hợp chủng HB6.1 36 Bảng 3.10 Độ ẩm thích hợp cho khả sinh tannase phân hủy chè khô chủng HB6.1 37 Bảng 3.11 Tỷ lệ giống cấy thích hợp cho khả sinh tannase phân hủy chè khô chủng HB6.1 38 Bảng 3.12 Bổ sung dịch khoáng thích hợp cho khả sinh tannase phân hủy chè khô chủng HB6.1 39 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1: Cấu trúc phân tử tannin .4 Hình 1.2 : Cấu trúc axit gallic axit digallic .5 Hình 1.3: Cấu trúc Catechin Epicatechin .6 Hình 1.4 : Quá trình thủy phân axit tannic enzim tannase Hình 3.1: Hình dạng khuẩn lạc quan sinh sản chủng HB6.1 môi trường Czapeck 32 Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn sinh khối thu chủng HB6.1 pH khác 33 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn số lượng bào tử chủng HB6.1 nuôi chất khác 34 Hình 3.4 : Đồ thị biểu diễn số lượng bào tử chủng HB6.1 nuôi độ ẩm khác 35 Hình 3.5 : Đồ thị biểu diễn số lượng bào tử chủng HB6.1 nuôi tỷ lệ giống cấy khác 36 Hình 3.6 : Đồ thị biểu diễn số lượng bào tử chủng HB6.1 nuôi thời gian khác 37 MỞ ĐẦU Chè thức uống phổ biến giới Ngoài giá trị cảm quan mùi thơm vị đặc trưng, chè cịn có giá trị y học đáng quý Sản phẩm chè đa dạng phong phú bao gồm nhiều loại chè chè xanh, chè đen, chè vàng, chè Phổ Nhĩ chè hòa tan Tuy nhiên chè có chứa nhiều tannin Tannin có độc tính hợp chất kìm hãm trao đổi protein phức tạp vi sinh vật, làm dày màng tế bào thực vật khiến trình tiêu hố trở nên khó khăn Nhiều loại vi sinh vật có khả sinh tannase Tannase thuỷ phân tannin để ngưng tụ sản phẩm,một số chúng sử dụng nguồn lượng Ứng dụng enzim sản xuất axit gallic Axit gallic chất cho q trình hố học trao đổi enzim propyl gallate Sử dụng chất chống oxi hoá cho dầu mỡ công nghiệp đồ uống Tannase phân giải trà xanh có tác dụng ức chế N- nitrosamine, loại tác nhân gây ung thư, quái thai tìm thấy số chất bảo quản thịt Ứng dụng tannase việc phân giải tannin biết đến rộng rãi Gần đây, nghiên cứu cho thấy trình phân giải tannin có tham gia nhiều loại vi sinh vật : vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men chủng nấm sợi Aspergillium niger, Penicillium spp Tuy nhiên,các báo nghiên cứu khoa học hầu hết tập trung vào nấm sợi, thơng tin nhóm vi sinh vật khác (như vi khuẩn, nấm men xạ khuẩn) tham gia vào trình lên men gần khơng có Ngành sản xuất chế biến sản phẩm từ chè Việt nam có thêm nhiều hội thách thức sau gia nhập WTO Chất lượng cách cửa để đưa vươn xa kinh tế Để chè thành phẩm có chất lượng tốt 30% phụ thuộc vào chế biến cịn 70% q trình cung cấp ngun liệu Đặc biệt sau vụ thu hoạch trình đốn chè quan trọng ảnh hưởng trực tiếp tới sản lượng búp chè lứa sau Sản lượng chè đốn hàng năm vùng trồng chè lớn hầu hết bà nông dân bỏ qua nguồn nguyên liệu Nhằm tăng tốc độ phân huỷ loại phụ phẩm chè gốc cây, việc ứng dụng chế phẩm vi sinh phương pháp hữu hiệu nhằm rút ngắn thời gian phân huỷ nâng cao tính kinh tế phục vụ cho bà nơng dân Từ chúng tơi tiến hành “Nghiên cứu vi sinh vật phân giải tanin dùng sản xuất phân bón chỗ cho vùng trồng chè sạch” CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Nguồn gốc chè Các cơng trình nghiên cứu khảo sát trước cho nguồn gốc chè vùng cao ngun Vân nam Trung quốc, nơi có điều kiện khí hậu ẩm ướt quanh năm Theo tài liệu Trung quốc cách 4.000 năm người Trung quốc biết dùng chè làm dược liệu, sau dùng chè để uống Năm 1823, R.Bruce phát chè dại to vùng Atxam (Ấn Độ) từ học giả người Anh cho quê hương chè Ấn Độ Trung quốc Những cơng trình nghiên cứu Dejmukhatze (1961-1976) phức catechin chè từ nguồn gốc khác nhau, so sánh thành phần chất catechin loại chè trồng mọc hoang dại nêu lên luận điểm tiến hố, sở xác minh nguồn gốc chè Dejmukhatze kết luận chè cổ xưa mọc hoang dại tổng hợp chủ yếu (-)epi catechin (+)epi catechin galat, chúng phát triển chậm khả tổng hợp (-)epigalo catechin galat để tạo thành (+) galo catechin Khi nghiên cứu chè dại Việt nam, ông nhận thấy, chúng tổng hợp chủ yếu (-)epi catechin (+)epi catechin galat (chiếm 70% tổng số loại catechin) Khi chè dại di thực lên phía Bắc, chúng thích ứng dần với điều kiện sinh thái cách có thành phần catechin phức tạp Từ biến đổi sinh hoá chè mọc hoang dại chè trồng trọt, chăm sóc, Dejmukhatze cho rằng, nguồn gốc chè Việt Nam [3] Hiện chè phân bố rộng điều kiện tự nhiên khác nhau, từ 30 độ vĩ nam đến 45 độ vĩ bắc, nơi có điều kiện tự nhiên khí hậu khác xa vùng nguyên sản Những thành tựu khoa học nhà chọn giống Liên Xô (cũ), Trung quốc, Nhật Bản, Đài Loan tạo nhiều giống chè có khả thích ứng với điều kiện khí hậu khác nhau, tạo nhiều triển vọng cho nghề trồng chè giới tannase chè khô với mức độ khác nhau, có chủng sinh tannase tốt khả phân hủy chè Chủng HB6.1 có khả sinh enzim tannase cao đồng thời phân hủy chè tốt lựa chọn cho nghiên cứu 3.1.2.3 Khả sinh enzim ngoại bào chủng HB6.1 Cấy chủng HB6.1 vào môi trường Czapeck, bổ sung tannic axit 1% 1% chè khô Sau 48h nuôi cấy lắc 150 vịng/phút 30 oC, đem dịch ni cấy ly tâm thu dịch enzym Nhỏ dịch nuôi vào giếng đĩa thạch có chứa chất sau: tinh bột tan (xác định hoạt tính amylase), CMC (xác định hoạt tính CMC-ase), pectin (xác định hoạt tính pectinase), xylan (xác định hoạt tính xylanase), tween 80 (hoạt tính lipase) casein (hoạt tính protease) Đặt 37 oC 24 h, xác định hoạt tính enzim ngoại bào Kết thể Bảng 3.3: 30 Bảng 3.3 Khả sinh enzim ngoại bào phân giải chất Cơ chất Casein Vòng phân giải CMC Pectin Tinh Tween 80 Xylan bột 10 chất (D-d,mm) Kết luận: Bảng 3.3 cho thấy khả sinh enzim tannase cao, chủng HB6.1 cịn có khả sinh enzim ngoại bào phân giải chất CMC, tinh bột, pectin, xylan không sinh enzim phân giải chất casein tween 80 3.2 Phân loại Việc phân loại chủng HB6.1 góp vai trị quan trọng việc tuyển chọn chủng có đặc tính tốt dùng cho sản xuất, thay vi sinh vật tự nhiên trình phân hủy lá, cánh chè nhằm đạt hiệu cao, rút ngắn thời gian nâng cao chất lượng phân bón Bên cạnh đó, chúng tơi cần lựa chọn chủng đưa vào sản xuất chủng an tồn cho người, vật ni, trồng môi trường sinh thái Đặc điểm quan sát thạch đĩa: Khuẩn lạc môi trường Czapeck phát triển tương đối nhanh, kích thước khuẩn lạc 6-7 cm sau ngày nuôi cấy Khuẩn lạc màu đen tuyền, khơng giọt tiết, khơng tiết sắc tố ngồi mơi trường Sợi nấm màu trắng Mặt trái khuẩn lạc không màu Các đặc điểm quan sát kính hiển vi: Cuống sinh bào tử hình thành từ sợi khí sinh từ sợi sinh dưỡng Cuống sinh bào tử điển hình, đơn giản, khơng phân nhánh, có màu nâu nhạt, kích thước dài ngắn khác 15-18 x 30-200 µm, phần đỉnh phình rộng thành bọng hình cầu, gần cầu, kích thước 60-65 µm Thể bình tầng, tầng kích thước 5-6,5 x 15- 25; tầng kích thước 3-4 x 6-12 µm Bào tử hình cầu, nhẵn, đường kính 2-3,5 µm Đây hình thái Aspergillus niger (Klich,2002) 31 Hình 3.1: Hình dạng khuẩn lạc quan sinh sản chủng HB6.1 môi trường Czapeck Aspergillus niger loài nấm mốc thuộc giới eukaryotes Theo quan an toàn thực phẩm dược phẩm Mỹ (FDA), Aspergillus niger sản phẩm sinh từ Aspergillus niger công nhận thực phẩm an tồn Aspergillus niger đóng vai trị quan trọng nghiên cứu khoa học sản xuất công nghiệp, sử dụng công nghiệp sản xuất enzim thủy phân, citric axit axit hữu khác 3.3 Nghiên cứu điều kiện ni cấu thích hợp cho sinh trưởng 3.3.1 Lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng Chủng nấm sợi HB6.1 cấy chấm đĩa thạch có mơi trường Czapeck đặt thang nhiệt độ khác nhau: 20, 25, 30, 35 40 oC Sau ngày đo kích thước khuẩn lạc đĩa Kết thể Bảng 3.4: Bảng 3.4 Đường kính khuẩn lạc chủng HB6.1 Nhiệt độ (oC) Đường kính khuẩn lạc (cm) 20 1.9 x 2.4 25 3.8 x 3.5 30 3.9 x 3.5 35 3.5 x 2.9 40 Kết luận: Chủng nấm sợi HB6.1 có khả sinh trưởng dải nhiệt độ từ 20 oC đến 40oC, thích hợp 25-30oC Đây khoảng nhiệt thích hợp cho việc phân hủy chè gốc 32 3.3.2 Lựa chọn pH ni cấy thích hợp Chủng nấm sợi HB6.1 ni cấy lắc 200 vịng/ phút 30 oC, mơi trường Czapeck, pH thay đổi từ - Sau 48 giờ, thu dịch cân khối lượng sinh khối sau nuôi Kết thể Bảng 3.5: Bảng 3.5 Lựa chọn pH ni cấy thích hợp pH Sinh khối (g) 0.08 0,11 0,19 0,28 0,39 0,30 0,21 0,11 Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn sinh khối thu chủng HB6.1 pH khác Kết luận: Chủng nấm sợi HB6.1 có khả sinh trưởng dải pH rộng từ pH=3 đến pH=8, thích hợp pH=6 Đây pH đất trồng chè 3.3.3 Lựa chọn chất ni cấy thích hợp Chủng nấm sợi HB6.1 nuôi cấy loại môi trường chất là: Ngô, gạo, cám, cám: trấu ngày nhiệt độ 30 oC Sau pha loãng tween 80 (0.01% ) nồng độ 10-6; 10-8, xác định chất thích hợp phương pháp pha loãng đếm số lượng khuẩn lạc Kết thể Bảng 3.6: Bảng 3.6 Cơ chất thích hợp chủng HB6.1 Cơ chất Số lượng bào Cám 266.108 Cám: trấu 328.108 tử (CFU/g) 33 Gạo 40.108 Ngơ 21.108 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn số lượng bào tử chủng HB6.1 nuôi chất khác Kết luận: Trong số chất sử dụng nghiên cứu này, cám cám: trấu sinh nhiều bào tử nhất, số lượng bào tử đạt 10 10 Hai chất chất chứa nhiều chất dinh dưỡng, giúp cho nấm sợi sinh trưởng tạo bào tử tốt Do chất cám: trấu sử dụng cho nghiên cứu để nuôi chủng nấm sợi HB6.1 3.3.4 Lựa chọn độ ẩm thích hợp Chủng nấm sợi HB6.1 nuôi môi trường cám trấu chọn độ ẩm khác từ 20% đến 70% Sau ngày tiến hành pha loãng đếm số lượng khuẩn lạc (thực 3.3.3) Kết thể Bảng 3.7: Bảng 3.7 Lựa chọn độ ẩm thích hợp chủng HB6.1 Độ ẩm (%) Số lượng bào tử 20 72.106 30 98.107 (CFU/g) 34 40 50 176.10 357.108 60 91.108 70 102.107 Hình 3.4 : Đồ thị biểu diễn số lượng bào tử chủng HB6.1 nuôi độ ẩm khác Kết luận: Chủng nấm sợi HB6.1 sinh trưởng mạnh cho số lượng bào tử lớn độ ẩm 40-50% 3.3.5 Lựa chọn tỉ lệ giống cấy thích hợp Chủng nấm sợi HB6.1 nuôi môi trường cám trấu tỷ lệ giống cấy khác nhau: 0.5 ; ; 3; ; 10% Sau ngày xác định số lượng khuẩn lạc (thực 3.3.3) Kết thể Bảng 3.8: Bảng 3.8 Tỷ lệ giống thích hợp chủng HB6.1 Tỷ lệ giống (%) Số lượng bào tử 0.5 108.108 1.0 119.108 (CFU/g) 35 284.108 365.108 10 241.108 Hình 3.5 : Đồ thị biểu diễn số lượng bào tử chủng HB6.1 nuôi tỷ lệ giống cấy khác Kết luận: Ở tỷ lệ giống cấy khác từ 0,5-10%, khơng có thay đổi nhiều số lượng khuẩn lạc chủng nấm sợi HB6.1 Để tiết kiệm chi phí , chúng tơi chọ tỷ lệ giống cấy thích hợp cho nghiên cứu sau 5% bào tử nồng độ 108/ml 3.3.6 Lựa chọn thời gian ni cấy thích hợp Chủng nấm sợi HB6.1 ni môi trường chất chọn thời gian khác ; ; ngày Sau ngày xác định số lượng khuẩn lạc (thực 3.3.3) Kết thể Bảng 3.9: Bảng 3.9 Thời gian ni thích hợp chủng HB6.1 Thời gian (ngày) Số lượng bào tử (CFU/g) 424.105 682.107 36 419.108 416.108 Hình 3.6 : Đồ thị biểu diễn số lượng bào tử chủng HB6.1 nuôi thời gian khác Kết luận: Số lượng bào tử chủng nấm sợi HB 6.1 đạt cao thời gian ngày 3.4 Điều kiện ni cấy thích hợp cho khả sinh tannase phân huỷ chè 3.4.1 Độ ẩm thích hợp cho khả sinh tannase chè chủng HB6.1 Chủng nấm sợi HB6.1 nuôi môi trường chè khô độ ẩm từ 20% đến 80% Sau ngày tiến hành định lượng tannase khối lượng chè sau nuôi Kết thể Bảng 3.10 : Bảng 3.10 Độ ẩm thích hợp cho khả sinh tannase phân hủy chè khô chủng HB6.1 Độ ẩm (%) Khối lượng (g) 20 30 40 50 60 70 80 ĐC 6.70 6.55 6.12 5.59 5.89 6.22 6.82 7.85 Tỷ lệ giảm khối lượng (%) 14.6 16.6 22.0 28.8 25.0 20.8 13.1 0.0 37 Hoạt tính tannase (U/g) 0.405 0.591 0.707 0.776 0.694 0.583 0.479 0.0 Kết luận: Độ ẩm 50% thích hợp cho chủng HB6.1 sinh tannase phân hủy chè khô 3.4.2 Tỷ lệ giống cấy thích hợp cho khả sinh tannase chè chủng HB6.1 Chủng nấm sợi HB6.1 nuôi môi trường chè khô độ ẩm 50% tỷ lệ giống cấy: 0.1%; 0.5%; 1%; 5%; 10% Sau ngày tiến hành định lượng tannase khối lượng chè sau nuôi Kết thể Bảng 3.11: Bảng 3.11 Tỷ lệ giống cấy thích hợp cho khả sinh tannase phân hủy chè khô chủng HB6.1 Tỷ lệ giống (%) Khối lượng (g) Tỷ lệ giảm khối Hoạt tính 0,1 0,5 6.02 5.73 lượng (%) 19.9 23.8 tannase (U/g) 0.580 0.632 5.46 27.4 0.746 5.36 28.7 0.799 10 5.26 30.1 0.764 ĐC 7.52 0.0 0.0 Kết luận: Tỷ lệ giống cấy 1% thích hợp cho chủng nấm sợi HB6.1 sinh tannase phân hủy chè khô 3.4.3 Bổ sung dịch khống thích hợp cho khả sinh tannase chè chủng HB6.1 Chủng nấm sợi HB6.1 nuôi môi trường chè khô, độ ẩm 50%, nhiệt độ 30oC, làm ẩm khoáng khác (kí hiệu từ K1 -K6) Sau ngày tiến hành định lượng tannase khối lượng sinh khối chè Kết thể Bảng 3.12: Bảng 3.12 Bổ sung dịch khống thích hợp cho khả sinh tannase phân hủy chè 38 khô chủng HB6.1 Dịch khoáng Khối lượng (g) Tỷ lệ giảm khối Hoạt tính tannase (U/g) K1 K2 5,01 5.42 lượng (%) 31.6 25.9 K3 5.61 23.4 K4 5.44 25.7 K5 5.86 19.9 K6 6.45 11.9 ĐC 7.32 0.0 0.817 0.666 0.588 0.509 0.438 0.413 0.0 Kết luận: Dịch khống K1 thích hợp cho chủng nấm sợi HB6.1 sinh tannase phân hủy chè khô 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ mẫu đất trồng chè Hồ Bình, Phú Thọ chủng vi sinh vật lưu giữ Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật – ĐHQGHN, phân lập sơ tuyển 49 chủng vi sinh vật có khả sinh tannase Tuyển chọn chủng nấm sợi HB6.1 khả sinh tannase phân hủy chè tốt Chủng nấm sợi HB6.1 định danh Aspergillus niger dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái cuống sinh bào tử bào tử Điều kiện thích hợp cho sinh trưởng tạo bào tử chủng nấm sợi HB6.1 nuôi môi trường chất cám: trấu; pH 6; độ ẩm 50%; nhiệt độ 30oC; tỉ lệ giống cấy 1%; thời gian ni ngày Điều kiện ni cấy thích hợp cho khả sinh tannase phân hủy chè khô là: độ ẩm 50%; tỷ lệ giống cấy %; dịch khống K1 có hoạt tính tannase 0.817 U/g giảm 31,6% khối lượng chè Kiến nghị - Nghiên cứu sản xuất thành chế phẩm thử nghiệm đồng ruộng 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Dương Văn Hợp (2011), Xây dựng Atlas 10 loài Bacillus viết handbook chi Bacillus Báo cáo khoa học, Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học Đỗ Văn Ngọc (2006) Cây chè Shan vùng cao - trồng có lợi phát triển vùng núi cao miền Bắc Việt Nam Hội thảo nghiên cứu phát triển chè Shan, Hiệp hội chè Việt Nam Đỗ Văn Ngọc Trịnh Văn Loan (2008) Các biến đổi hóa sinh q trình chế biến bảo quản chè, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003) Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Thị Hiền (2010) Công nghệ sản xuất chè, cà phê cacao, NXB Lao động, Hà Nội Tiếng Anh Aguilar CN, Augur C, Favela-Torres E, Viniegra-González G J, 2001b Production of tannase by Aspergillus niger Aa-20 in submerged and solidstate fermentation: influence of glucose and tannic acid Ind Microbiol Biotechnol; 26(5):296-302 Ayed, L and M Hamdi,2002 Culture conditions of tannase production by Lactobacillus platarum Biotechnol Lett.,24: 1763-1765 Banerjee,D.,S Mahapatra and B.R Pati,2007 Gallic acid production by submerged fermentation of Aspergillus aculeatus DBF9 Res J Microbiol.,2 : 462-468 Battestin, V G.A Macedo,2007 Tannase production by Paecilomyces variotii Bioresour Technol.,98: 1832-1837 10 Belur, P.D., G.Mugeraya, K.R Nirmala and N Basavaraj, 2010 Production of novel cell-associated tannase from newly isolated Serratia ficaria DTC J Microbiol Biotechnol.,20: 722-726 41 11 Bradoo, S.,R Gupta and R.k Saxenaa, 1997 Parametric optimization and biochemical regulation of extracellular tannase from Aspergillus japoinicus Process Biochem.,32: 135-139 12 Deschamps, A.M.,G Otuk and J.M Lebeault, 1983 Production of tannase and degradation of chestnut tannins by bacteria J Ferment Technol., 61: 55-59 13 Darah I, Sumathi G, Jain K, Lim SH Tannase enzyme production by entrapped cells of Aspergillus niger FETL FT3 in submerged culture system Bioprocess Biosyst Eng 2011 Sep; 34(7):795-801 14 Edwald Hendrick Alberste Cloning Expression and characterization of tannase from Aspergillus species 15 Haizhen Mo, Yang Zhu and Zongmao Chen(2008) Microbial fermented tea et al potential source of natural food preservatives Trends in Food Science & Technology 19 16 Hatomoto, O.,T Watarai, M.Kikuchi, K Mizusawa and H Sekine,1996 Cloning and sequencing of the gene encoding tannase and structural study of the tannase subnit from Aspergillus oryzae Gene, 175 : 215-221 17 Jean, D.,H Pourrat,A Pourrat and A.Carnat,1981 Assay of tannase (tannin acyl hydrolase EC3.1.1.20) by gas chromatography Anal Chem., 110: 369372 18 Kee - Ching Jeng, Chin - Shuh Chen, Yu - Pun Fang, Rolls Chien - Wei Hou, and Yuh - Shuen Chen ;Vol 55, No 21, 2007 Effect of Microbial Fermentation on Content of Statin, GABA, and Polyphenols in Pu-Erh Tea J Agric Food Chem 19 Knudson, L., 1913 Tannic acid fermentation - I J Biol Chem., 14 : 159184 20 Klich MA (2002) Identification of common Aspergillus Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht The Netherlands 21 Kumar, R.A.,P Gunasekaran and M Lakshmanan, 1999 Biodegradion of 42 tannic acid by Citrobacter freundii isolated from tannary effluent J.Basic Microbiol., 39: 161-168 22 Lekha, P.K and B.K Losane,1994 Comperative titers, location and properties of tannin acyl hydrolase produced by Aspergillus niger PKL 104 in solid state, liquid surface and submerged fermaentation Process Biochem.,29 : 497-503 23 Lekha, P.k and B.K Losane, 1997 Production and application of tannin acyl hydrolase : State of art Adv Applied microbiol., 44: 215:260 24 Mondal K.C.(2001) Colorimetric assay method for determination of the tannin acyl hydrolase (EC3.1.1.20) activity Anal Biochem 295: 168-171 25 Mata-Gomez M, Rodriguez LV, Ramos EL, Renovato J, Cruz-Hernandez MA, Rodriguez R, Contreras J, Aguilar CN Culture conditions dictate protease and tannase production in submerged and solid-state cultures of Aspergillus niger Aa-20 J Microbiol Biotechnol 2009 Sep; 19(9):987-996 26 Osawa, R and T.P Walsh,1993 Visual reading method for detection of bacterial tannase Appl Environ Microbiol., 59: 1251-1252 27 P.D Belur and g Mugeraya (2011 Academic Journals Inc ) Microbial production of Tannase : State of the art 28 Ramirez-Cornel, M.A.,G Viniegra-Gonzalez, A.Darvill and C Augur, 2003 a novel tannase from Aspergillus niger with a-glucosidase activity Microbiology,149: 2941-2946 29 Sabu, A ,C Augur, C Swati and A Pandey, 2006 Tannase production by lactobacillus sp ASR-S1 under solid state fermentation Process Biochem.,41: 575-580 30 Sanderson, G.W.; Coggon, P Green tea conversion using tannase and natural tea enzyme U.S Patent 3,812,266 1974 Tannase essay – Srivastava – 09 31 S Sharma, T.K Bhat, R.K Dawra, Isolation, purification and properties of tannase from Aspergillus niger van Tieghem,World J Microbiol 43 Biotechnol 15 (1999) 673–677 32 Saxena, S and R.K Saxena, 2004 Statistical optimization of tannase production from penicillum variable using fruits (chebulic myrobalan) of Terminalia chebula Biotechnol Applied Biochem., 39: 99-106 33 Seth, M and S Chand, 2000 Biosynthesis of tannase and hydrolysis of tannins to gallic acid by Aspergillus awamori-optimisation of process parameters Process Biochem., 36: 39-44 34 Van de Lagemaat, J and D.L Pyle, 2001 Solid state fermentation and bioremediation : Development of continuous process for the production of fungal tannase Chem Eng J., 84 : 115-123 35 Zhao Z J., Tong H.R., Zhou L., Wang E.X and Liu Q.J ;30 (2010) Fungal colonization of Pu - erh tea in YUNNAN Journal of Food Safety 44 ... vi sinh phương pháp hữu hiệu nhằm rút ngắn thời gian phân huỷ nâng cao tính kinh tế phục vụ cho bà nơng dân Từ chúng tơi tiến hành ? ?Nghiên cứu vi sinh vật phân giải tanin dùng sản xuất phân bón. .. vật thiết bị 2.1.1 Nguồn vi sinh vật Các chủng vi sinh vật dùng nghiên cứu phân lập từ mẫu đất trồng chè Hồ Bình, Phú Thọ chủng lưu giữ Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật – ĐHQGHN (VTCC) 2.1.2... phương cách hữu hiệu nhằm rút ngắn thời gian phân hủy Ở Vi? ??t Nam, nhiều đề tài nghiên cứu ủ phân hữu vi sinh nghiên cứu triển khai vùng sản xuất nông nghiệp khu xử lý rác thải thành phố Các đề