Phân lập toxin có hoạt tính chống đông máu từ nọc bò cạp heterometrus laoticus và toxin có hoạt tính giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thư từ nọc rắn bungarus fasciatus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - TRẦN VŨ THIÊN PHÂN LẬP TOXIN CĨ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐƠNG MÁU TỪ NỌC BỊ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS VÀ TOXIN CĨ HOẠT TÍNH GIẢM ĐAU, KHÁNG TĂNG SINH TẾ BÀO UNG THƢ TỪ NỌC RẮN BUNGARUS FASCIATUS Chuyên ngành: Hóa hữu Mã sỗ: 44 01 14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TSKH Hồng Ngọc Anh TS Phùng Văn Trung TP.Hồ Chí Minh – 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án cơng trình nghiên cứu tơi dƣới hƣớng dẫn khoa học TSKH Hoàng Ngọc Anh TS Phùng Văn Trung Các số liệu, kết luận án trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Trần Vũ Thiên ii LỜI CẢM ƠN Luận án hoàn thành Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trong trình nghiên cứu, tác giả nhận nhiều giúp đỡ quý báu thầy cô, nhà khoa học, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, cảm phục kính trọng tới TSKH Hoàng Ngọc Anh TS Phùng Văn Trung - người Thầy tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực luận án Tôi vô biết ơn GS.TSKH Utkin Yuri Nikolaevich, Viện Sinh hóa hữu mang tên Shemyakin-Ovchinnikov, Moskva, Viện Hàn lâm Khoa học Nga giúp đỡ nhiều việc xác định cấu trúc phân tử chất Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng tập thể cán Viện quan tâm giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ths.Dược sĩ Nguyễn Thị Thùy Trang – giảng viên môn Dược Lý, trường Đại học Nguyễn Tất Thành, TS Phạm Đình Chương – giảng viên môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Tôn Đức Thắng em Trần Thụy Trúc Vy, Trần Thái Đạt – sinh viên trường Đại học Tôn Đức Thắng, hỗ trợ nhiều việc thực khảo sát tác dụng dược lý nọc bò cạp nọc rắn góp ý quý báu việc thực hồn thiện luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn quan tâm giúp đỡ Học viện Khoa học Cơng nghệ, phận đào tạo, phịng Quản lý tổng hợp tạo điều kiện giúp đỡ hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn tới Lãnh đạo Trường Đại học Trà Vinh đồng nghiệp ủng hộ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian làm nghiên cứu sinh Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới tồn thể gia đình, bạn bè người thân ln ln quan tâm, khích lệ, động viên tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Trần Vũ Thiên iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan…………………………………………………………………… ……i Lời cảm ơn…………………………………………………………….………… … ii Mục lục……………………………………………………………………… … iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt………………………………………… viii Danh mục bảng……………………………………………………… …… … xi Danh mục hình vẽ, đồ thị………………………………………… ………… …xiii MỞ ĐẦU…………………………………………………………………… … CHƢƠNG TỔNG QUAN…………………………………………….……… … 1.1 Giới thiệu bò cạp……………………………………………….……… … 1.2 Giới thiệu chung rắn…………………………………………………… … 1.2.1 Giới thiệu rắn cạp nong……………………………………… …… … 1.2.2 Phân bố sinh thái……………………………………………………… … 1.3 Tình hình nghiên cứu nọc bò cạp…………………………… ……… … 1.3.1 Tình hình nghiên cứu nọc bị cạp giới…………………… … 1.3.2 Tình hình nghiên cứu bị cạp Việt Nam……………………………… ….11 1.4 Tình hình nghiên cứu nọc rắn………………………………….……… ….12 1.4.1 Tình hình nghiên cứu nọc rắn giới ………………………… ….12 1.4.2 Những nghiên cứu rắn cạp nong Việt Nam…… …… ………… ….24 CHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM………… ….27 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu……………………………………………………… ….27 2.1.1 Khảo sát phân lập chất có hoạt tính chống đơng máu từ nọc bò cạp H laoticus………………… ………………………………… ….27 2.1.2 Khảo sát phân lập chất có hoạt tính giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thƣ từ nọc rắn cạp nong B fasciatus……………… … ….27 2.2 Thiết bị nghiên cứu………………………………………………………… ….27 2.3 Phƣơng pháp phân lập xác định toxin từ nọc bò cạp H laoticus…… 28 iv 2.3.1 Sơ đồ tách, làm xác định toxin từ nọc bò cạp H laoticus…… ….28 2.3.2 Tách protein nọc bò cạp H laoticus sắc ký lọc gel cột với Sephadex G-50…………………………………………………… ….29 2.3.3 Phân tách phân đoạn nọc bò cạp H laoticus sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo (RP-HPLC)………………………………………… ….31 2.3.4 Khảo sát tác động phân đoạn thứ cấp phân đoạn nọc bị cạp H laoticus lên q trình đơng – chảy máu………………………… ….32 2.3.5 Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính chống đơng máu ….38 2.4 Phƣơng pháp phân lập xác định toxin từ nọc rắn cạp nong B fasciatus ….38 2.4.1 Sơ đồ tách, làm xác định toxin từ nọc rắn cạp nong B fasciatus ….38 2.4.2 Tách protein nọc rắn cạp nong B fasciatus sắc ký lọc gel gel Superdex HR75 .39 2.4.3 Khảo sát KLPT phân đoạn tách từ nọc rắn cạp nong B fasciatus phƣơng pháp điện di…………………………………… 2.4.4 Khảo sát tác dụng giảm đau…………………………………………… ….41 ….44 2.4.4.1 Khảo sát tác dụng giảm đau ngoại biên nọc rắn cạp nong B fasciatus toàn phần phân đoạn ……….………….…………… ….45 2.4.4.2 Khảo sát tác dụng giảm đau trung ƣơng nọc rắn cạp nong B fasciatus toàn phần phân đoạn ………………………………… …46 2.4.5 Tách phân đoạn thứ cấp phân đoạn BF4 nọc rắn cạp nong B fasciatus sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo (RP-HPLC)………… …48 2.4.6 Khảo sát hoạt tính giảm đau số phân đoạn thứ cấp tách từ phân đoạn BF4……………… ………………………………………… …49 2.4.7 Phân tích thống kê kết thử hoạt tính giảm đau…………………… …50 2.4.8 Phƣơng pháp xác định KLPT protein có hoạt tính giảm đau……… …50 2.4.9 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ nọc thô phân đoạn rắn cạp nong B fasciatus theo phƣơng pháp MTT…………………… .…51 v 2.4.10 Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào …55 2.4.10.1 Xác định KLPT dựa MALDI TOF/TOF MS ……………… …55 2.4.10.2 Xác định trình tự amino acid dựa LC-MS/MS.………… … 55 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN…………… ….57 3.1 Kết bò cạp H laoticus……………………………………… ….57 3.1.1 Sắc ký lọc gel nọc bò cạp H laoticus………………….……….……… ….57 3.1.2 Tách phân đoạn nọc bò cạp H laoticus sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo (RP-HPLC) ……………………….…………………………… ….59 3.1.3 Tác động phân đoạn thứ cấp phân đoạn nọc bò cạp H laoticus lên q trình đơng - chảy máu……………………………… …… ….60 3.1.4 Làm hợp chất có hoạt tính chống đơng máu từ phân đoạn 5.5 5.22……….………………………………………………………………… ….63 3.1.4.1 Làm phân đoạn 5.5 …………………………………………… .63 3.1.4.2 Làm phân đoạn 5.22 ……………………………… ………… ….64 3.1.5 Hoạt tính chống đơng máu phân đoạn hợp chất sạch: 5.5.1, 5.22.3, 5.21.1 (dipeptide Leu – Trp)……………………………… … ….65 3.1.6 Xác định cấu trúc chất có hoạt tính chống đơng máu (5.5.1 5.22.3) từ phân đoạn 5.5 5.22 MS NMR………… …………… 69 3.1.6.1 Cấu trúc toxin 5.5.1…………………………………………… 69 3.1.6.2 Cấu trúc toxin 5.22.3 ………………………………………… …72 3.2 Kết rắn cạp nong B fasciatus…………………………… … ….75 3.2.1 Sắc ký lọc gel nọc rắn cạp nong B fasciatus…………… … ….75 3.2.2 Xác định KLPT phân đoạn tách từ nọc rắn cạp nong B fasciatus phƣơng pháp điện di ….76 3.2.3 Tác dụng giảm đau ngoại biên nọc rắn cạp nong B fasciatus toàn phần phân đoạn………………… ………………………………… ….78 3.2.4 Tác dụng giảm đau trung ƣơng nọc rắn cạp nong B fasciatus toàn phần phân đoạn………………….…………… ……………….…… ….79 3.2.5 Phân tách phân đoạn BF4 từ nọc rắn cạp nong B fasciatus có hoạt vi tính giảm đau sắc ký lỏng hiệu cao (RP-HPLC)….……………… ….81 3.2.6 Hoạt tính giảm đau số phân đoạn thứ cấp phân đoạn BF4 ….81 3.2.6.1 Giảm đau ngoại biên………………………………… …………… ….81 3.2.6.2 Giảm đau trung ƣơng………………………………… ………… ….84 3.2.7 Xác định KLPT protein BF4.11 protein BF4.12 có hoạt tính giảm đau……… …………………………… …………….… ….86 3.2.8 Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ nọc rắn cạp nong B fasciatus………………………………………………………….…………… ….87 3.2.8.1 Khả gây độc tế bào ung thƣ vú MCF-7 nọc thô (BF) phân đoạn (BF1 – BF5) ……………………………………….……… ….87 3.2.8.2 Khả gây độc tế bào ung thƣ phổi A549 nọc thô (BF) phân đoạn (BF1 – BF5) ……………………….…………………… ….89 3.2.9 Phân lập phân đoạn BF3 sắc ký lỏng hiệu cao (RP-HPLC) ….91 3.2.10 Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ vú MCF-7 ung thƣ phổi A549 phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3, BF3.4) từ phân đoạn BF3… ….92 3.2.10.1 Khả gây độc tế bào ung thƣ vú MCF-7 phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3, BF3.4) …………………………………… ….92 3.2.10.2 Khả gây độc tế bào ung thƣ phổi A549 phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3, BF3.4)…………………………………… ….94 3.2.11 Khả gây độc tế bào thƣờng HK2 ngƣời nọc thô (BF), phân đoạn (BF1 – BF5) phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3, BF3.4)……………………………………………………………………… 96 3.2.12 Xác định cấu trúc bậc (trình tự amino acid) protein 3.3 có hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ vú MCF-7 ung thƣ phổi A549………… ….97 3.2.12.1 Xác định KLPT BF3.3 dựa MALDI TOF/TOF MS … ….97 3.2.12.2 Xác định trình tự amino acid protein 3.3 dựa LCMS/MS…………………………………………………………………… ….98 KẾT LUẬN ………………………………………………………… 101 vii KIẾN NGHỊ…………………………………………………………… ……… 103 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ XUẤT BẢN………………………………… 104 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………….…………… .106 PHỤ LỤC………………………………………………………………………… .118 viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh 3FTx ADP Three – Finger Toxin Adenosine di phosphate aPTT Activated partial thromboplastin time Adenocarcinoma human alveolar basal A549 B fasciatus BF BF – CT BF – LAAO epithelial cells Bungarus fasciatus Bungarus fasciatus Bungarus fasciatus Cytotoxin oxidase Bungarus fasciatus Phospholipase A2 BFV Bungarus fasciatus venom BF1 - BF5 Fraction – Fraction BF3.1 - BF3.4 Fraction 3.1 – Fraction 3.4 cDMEM Rắn cạp nong Bungarus fasciatus – L - amino acid BFPA C Diễn giải Nọc rắn cạp nong tồn phần (thơ) Phân đoạn đến (sau chạy sắc ký lọc gel nọc rắn cạp nong) Phân đoạn thứ cấp 3.1 đến 3.4 phân đoạn (sau chạy sắc ký pha đảo nọc rắn cạp nong) Cell viability (% of control) Lƣợng tế bào sống (%) Concentration (µg/mL) Nồng độ (µg/mL) Control Chứng Complete Dulbecco's Modified Eagle Medium Da DMSO Daltons Dimethyl sulfoxide ĐC Standard drug Đối chứng ix EAC Ehrlich ascites carcinoma EC50 Half maximal effective concentration EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ESI-MS FBS FDA H laoticus HPLC IC50 Electrospray ionization mass spectrometry Fetal Bovine Serum Food and Drug Administration Heterometrus laoticus High Performance Liquid Chromatography The half maximal inhibitory concentration Nồng độ hiệu trung bình Bị cạp đen Nồng độ ức chế 50% IL Interleukin kDa KiloDalton KLPT Molecular mass Khối lƣợng phân tử, Da LD LD50 Lethal dose Mean lethal dose Liều tử vong Liều tử vong trung bình MALDI MCF-7 MS MTT Matrix-assisted laser desorption/ionization Michigan Cancer Foundation Mass spectroscopy 3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-teyrazolium bromide MW Molecular weight nAChRs Nicotinic Acetylcholine receptors NB NMR P PAGE PBS Peripheral Nuclear Magnetic Resonance Probability Polyacrylamide gel electrophoresis Photphat buffer saline PĐ Fraction Thuốc thử MTT Phân tử lƣợng trung bình, g/mol Ngoại biên Độ tin cậy Phân đoạn (sau chạy sắc ký) 131 Phụ lục 9: Phổ 1H-NMR 13C-NMR Adenosine (Tham khảo BMRB) 132 Phụ lục 10: Phổ 1H-NMR 13C-NMR 5.22.3 Phổ 1H-NMR 5.22.3 133 134 135 Phổ 13C-NMR 5.22.3 136 137 Phụ lục 11: Phổ HR-ESI-MS/MS protein 4.11 138 Phụ lục 12: Phổ HR-ESI-MS/MS protein 4.12 139 Phụ lục 13: Kết khảo sát khả kháng tăng sinh tế bào nọc thô (BF) phân đoạn (BF1 – BF5) lên tế bào ung thƣ vú MCF-7 ung thƣ phổi A549 sau 24 h, 48 h 72 h (* р