Tiến hành nghiên cứu tối ưu phương pháp tạo mô sẹo phôi hóa và tái sinh cây cho hoàn thiện quy trình biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium cho hai giống lúa Japonica J02 và ĐS1. Kết quả nghiên cứu cho thấy mô sẹo phát sinh trên nền môi trường NB cho kích thước mô sẹo phôi hoá lớn hơn trên nền môi trường MS.
Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 11(120)/2020 not rice in the field, the fertilizer was not supplied and there not water the water level in the field was withdrawn previously to harvest rice, leading to the amount of CH4 and N2O at 1-week after harvesting decreased compared to the time of rice cultivation Total greenhouse gas emissions for the whole season (or global warming potential in tCO2e/ha) in the improved model in ecological sub-regions was reduced in comparison to farmer’s cultivation Thus, the research results showed that advanced rice cultivation methods contribute to reducing greenhouse gas emissions in agriculture more effectively than traditional farming methods Keywords: CH4 gas, N2O gas, global warming potential, ecological sub-region Ngày nhận bài: 06/9/2020 Ngày phản biện: 20/9/2020 Người phản biện: PGS TS Mai Văn Trịnh Ngày duyệt đăng: 25/11/2020 HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP BIẾN NẠP GEN QUA VI KHUẨN Agrobacterium SỬ DỤNG MƠ SẸO PHƠI HỐ CHO GIỐNG LÚA J02 VÀ ĐS1 Hoàng Thị Giang1, Vũ Thị Hường1, Trần Hiền Linh1 TÓM TẮT Tiến hành nghiên cứu tối ưu phương pháp tạo mơ sẹo phơi hóa tái sinh cho hồn thiện quy trình biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium cho hai giống lúa Japonica J02 ĐS1 Kết nghiên cứu cho thấy mô sẹo phát sinh môi trường NB cho kích thước mơ sẹo phơi hố lớn môi trường MS Cấu trúc khối mô sẹo tơi tỷ lệ tạo mơ sẹo đạt 89%, thích hợp cho biến nạp gen Nền môi trường NB kết hợp chiếu sáng 12 h cho tỷ lệ tái sinh cao Để đồng ni cấy mơ sẹo phơi hố, mật độ quang vi khuẩn 0,3 xác định thích hợp Đánh giá biểu gen GUS mô sẹo chuyển gen chuyển gen tái sinh, điều chứng tỏ hiệu quy trình biến nạp Hiệu biến nạp gen hai giống lúa nghiên cứu đạt 60,0 - 66,94% Keywords: Agrobacterium, biến nạp gen, lúa Japonica, mơ sẹo phơi hố I ĐẶT VẤN ĐỀ Lúa lương thực quan trọng Việt Nam với sản lượng dự kiến năm 2020 đạt 43,5 triệu thóc, xuất 6,5 - 6,7 triệu gạo (Bộ Nông nghiệp PTNT, 2020) Việt Nam nước xuất gạo thứ giới, chiếm gần 20% thị phần tồn cầu, góp phần quan trọng vào việc ổn định an ninh lương thực khu vực giới Tuy nhiên, sản xuất lúa gạo nước ta phải đối mặt với nhiều thách thức áp lực tăng suất dân số tăng nhanh, diện tích canh tác bị thu hẹp ảnh hưởng biến đổi khí hậu gây thiệt hại lớn cho ngành trồng lúa Hơn nữa, yêu cầu chất lượng gạo ngày cao với phát triển kinh tế xã hội nhu cầu cải thiện điều kiện sống người dân Một số giống lúa chủ lực Việt Nam suất cao chất lượng tốt không thơm thường mẫn cảm với loại bệnh dịch hại Trong đó, hai giống Japonica J02 ĐS1 giống chất lượng tốt lại khơng có mùi thơm dễ nhiễm bệnh khơ vằn Vì vậy, việc chọn tạo cải tiến tính trạng mong muốn giống lúa chủ lực Japonica J02 ĐS1 sản xuất cần thiết Gần đây, chỉnh sửa hệ gen sử dụng cơng nghệ CRISPR/Cas9 đời nhanh chóng trở thành công cụ mạnh mẽ việc nghiên cứu cải tạo giống Li cộng tác viên (2016) ứng dụng thành công công nghệ CRISPR/Cas9 để gây đột biến số gen liên quan đến suất lúa Gn1a, DEP1, GS3 IPA1 liên quan đến số hạt/bơng, cấu trúc bơng, kích thước hạt cấu trúc lúa Butt cộng tác viên (2018) sử dụng công nghệ CRISPR/Cas9 để gây đột biến gen CCD7, tham gia vào trình sinh tổng hợp Strigolactone, loại hoocmon gây ức chế trình đẻ nhánh Cây lúa đột biến gen CCD7 đẻ nhiều nhánh có chiều cao thấp đối chứng Tuy vậy, phần lớn nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 tiến hành giống lúa mô hình, khó để áp dụng cho giống lúa thương mại chưa có quy trình biến nạp gen cho giống Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp 42 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 11(120)/2020 Cây lúa chuyển gen tạo qua biến nạp gen trực tiếp vào tế bào trần xung điện Toriyama cộng tác viên (1988), PEG Zhang cộng tác viên (1988), súng bắn gen Christou cộng tác viên (1991), vi khuẩn Agrobacterium tumefacicens Hiei cộng tác viên (1994) Trong đó, cơng trình Hiei cộng tác viên (1994) đánh dấu bước tiến quan trọng kỹ thuật biến nạp gen vào lúa Japonica sử dụng A tumefaciens Hiei cộng tác viên (1994) xây dựng phương pháp biến nạp gen hiệu vào mô sẹo phơi hố cho số giống lúa Japonica Tsukinohikari, Asanohikari Koshihikari Từ đó, kỹ thuật áp dụng rộng rãi cải tiến nhiều phịng thí nghiệm giới Tại Việt Nam, nhiều quan nghiên cứu Viện Di truyền Nông nghiệp nghiên cứu cải tiến thành công phương pháp biến nạp gen vào giống lúa Japonica Taichung 65 thông qua vi khuẩn A tumefaciens với hiệu suất biến nạp gen cao (90,24%) (HoàngThị Giang ctv., 2015) phục vụ nghiên cứu chức gen Trong báo này, nghiên cứu cải tiến phương pháp tạo mô sẹo, tái sinh hoàn chỉnh hoàn thiện phương pháp biến nạp gen qua vi khuẩn A tumefaciens phù hợp cho hai giống lúa Japonica thương mại J02 ĐS1, phục vụ nghiên cứu chỉnh sửa hệ gen II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Gồm hạt lúa chín hai giống lúa Japonica J02 ĐS1 tác giả giống GS.TS Đỗ Năng Vịnh, Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp Vi khuẩn A tumefaciens chủng EHA105 mang vector pCAMBIA5300 GUS sử dụng để biến nạp gen Phịng thí nghiệm Việt Pháp, Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp Các môi trường sử dụng nghiên cứu gồm môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) môi trường NB (Hiei and Komari, 2008) Môi trường NB kết hợp thành phần khoáng đa lượng Chu (1975) thành phần khoáng vi lượng vitamin Gamborg cộng tác viên (1968) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm Áp dụng theo quy trình cải tiến Guiderdoni cộng tác viên (1998) Thí nghiệm Nghiên cứu mơi trường tạo mơ sẹo phơi hố: Hạt lúa chín bóc vỏ khử trùng cồn 70% dung dịch javel (Hoàng Thị Giang ctv., 2015) Cấy 10 hạt khử trùng lên đĩa petri (90 ˟ 150mm) (Hoàng Thị Giang ctv., 2015) có chứa mơi trường tạo mô sẹo với môi trường khác nhau: CT1: môi trường NB; CT2: môi trường MS Sau 23 - 26 ngày tiến hành đánh giá tỷ lệ mẫu tạo mơ sẹo, kích thước mơ sẹo phơi hố Độ tơi mơ sẹo đánh giá theo hình thức cho điểm: - mô sẹo tơi, - mơ sẹo chai rắn (Wanichananan ctv., 2010) Thí nghiệm Nghiên cứu môi trường tái sinh mô sẹo phôi hoá: Giai đoạn gồm bước tiền tái sinh tái Mơ sẹo phơi hố chuyển sang mơi trường tiền tái sinh (có bổ sung 30 g/l sucrose, 500 mg/l L-proline, 500 mg/l L-glutamine, 300 g/l caseine hydrolysat, 100 mg/l myo-inositol, mg/l ABA, mg/l BAP, mg/l NAA g/l phytagel) tuần, sau cấy sang mơi trường tái sinh (có bổ sung 30 g/l sucrose, 500 mg/l L-proline, 500 mg/l L-glutamine, 300 g/l caseine hydrolysat, 100 mg/l myo-inositol, mg/l BAP, 0,5 mg/l NAA 4,5 g/l phytagel), - mô sẹo/đĩa petri, để phịng ni với nhiệt độ phịng 26-28°C Thực cơng thức thí nghiệm: CT1: môi trường NB + 12 chiếu sáng; CT2: môi trường MS + 12 chiếu sáng; CT3: môi trường NB + 24 chiếu sáng; CT4: môi trường MS + 24 chiếu sáng Sau 3-4 tuần tiến hành đánh giá tỷ lệ tái sinh chồi Thí nghiệm Nghiên cứu phương pháp đồng ni cấy mô sẹo với vi khuẩn: Đồng nuôi cấy mô sẹo phơi hố với dịch khuẩn A tumefaciens mật độ quang (OD600nm) khác nhau: CT1: 0,01; CT2: 0,05; CT3: 0,1; CT4: 0,3; CT5: 0,5 Sau ngày đồng nuôi cấy với vi khuẩn, mẫu mô sẹo chuyển sang mơi trường chọn lọc lần I có bổ sung kháng sinh cefotaxime 400 mg/l, vancomycin 100 mg/l để loại bỏ vi khuẩn kháng sinh hygromycin 50 mg/l để sàng lọc tế bào chuyển gen Sau tuần tiến hành đánh giá tỷ lệ mẫu nhiễm hiệu biểu gen GUS Hiệu biểu gen GUS đánh giá phương pháp nhuộm mô với dung dịch X-Gluc Thí nghiệm Đánh giá hiệu biến nạp gen: Sau chọn lọc lần I, mẫu cấy chuyển sang môi trường chọn lọc II tuần để tăng hiệu chọn lọc kích thích phát sinh mô sẹo từ mẫu mô sẹo chuyển gen Các loại kháng sinh bổ sung vào môi trường chọn lọc I II tương tự Chuyển mô sẹo phát sinh kháng kháng sinh sang môi trường tiền tái sinh tái sinh, áp dụng mơi trường ni cấy từ kết thí nghiệm Hiệu biến nạp gen đánh giá tỷ lệ lúa tái sinh biểu gen GUS nhuộm mơ tổng số phân tích 43 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 11(120)/2020 Các thí nghiệm tiến hành với lần lặp, với 20-30 mẫu cấy cho cơng thức thí nghiệm lần lặp Ở bước thí nghiệm, trừ giai đoạn tái sinh, mẫu cấy ni tối 28oC 10/2020 Phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp 2.2.2 Phương pháp xử lý số liệu 3.1 Đánh giá hiệu số môi trường ni cấy tạo mơ sẹo phơi hóa Để thử nghiệm cho hai giống lúa Japonica thương mại Việt Nam, ngồi mơi trường NB mơ tả quy trình Hiei Guiderdoni cộng tác viên (1998) cải tiến, môi trường MS đưa vào đánh giá Kết thí nghiệm tổng hợp bảng Xử lý số liệu Excel dùng hàm Ttest phân tích ANOVA phần mềm IBM SPSS Statistics để kiểm định khác biệt cơng thức thí nghiệm 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu thực từ tháng 08/2019 - III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Bảng Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả tạo mơ sẹo phơi hóa Giống lúa J02 ĐS1 Cơng thức thí nghiệm Nền mơi trường Tổng số mẫu cấy CT1 CT2 CT1 CT2 MS NB MS NB 121 115 170 170 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) 93,33 ± 1,88a 89,44 ± 3,07a 93,53 ± 1,91a 96,47 ± 1,19a Kích thước mơ sẹo phơi hóa (mm) 9,35 ± 0,37a 9,95 ± 0,3b 8,48 ± 0,3a 9,23 ± 0,2b Độ tơi mô sẹo 1,0 ± 0a 1,0 ± 0a 1,0 ± 0a 1,0 ± 0a Ghi chú: Trong cột giống lúa, chữ khác thể sai khác có ý nghĩa thống kê với P < 0,05 Kết nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ phát sinh mô sẹo phôi hóa giống lúa nghiên cứu cao, đạt ≥ 89% hai môi trường NB MS khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê hai cơng thức thí nghiệm (Bảng 1) Kích thước mơ sẹo phơi hóa giống dao động từ 8,48 - 9,95 mm, nhiên môi trường NB cho kích thước mơ sẹo lớn mồi trường MS Trên cơng thức thí nghiệm, giống Japonica J02 ĐS1 hình thành mơ sẹo phơi hóa tơi (đạt điểm 1), dễ phân tách thành mô sẹo nhỏ 3.2 Ảnh hưởng số môi trường dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy đến hiệu tái sinh từ mô sẹo phôi hóa Với khả hình thành mơ sẹo phơi hóa tốt hai giống J02 ĐS1, tiếp tục sử dụng mơ sẹo phơi hóa thu để làm vật liệu đánh giá khả tái sinh Hình Tái sinh mơ sẹo phơi hóa Ghi chú: A: NB + 12 chiếu sáng; B: NB + 24 chiếu sáng; C: MS + 12 chiếu sáng; D: MS + 24 chiếu sáng 44 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 11(120)/2020 Các giống lúa Japonica đánh giá dễ tái sinh Theo quy trình cải tiến Guiderdoni cộng tác viên (1998), trình tái sinh chia làm hai giai đoạn: tiền tái sinh tái sinh hồn chỉnh Mơi trường ni cấy cho giai đoạn tiền tái sinh bổ sung mg/l BAP, mg/l NAA, mg/l ABA, nuôi cấy tuần tối để tăng cường khả phân hóa tế bào Sau tuần chuyển sang môi trường tái sinh với mg/l BAP 0,5 mg/l NAA Khi chuyển sang môi trường tái sinh quan sát thấy từ mô sẹo ban đầu phát sinh mô sẹo Sau khoảng 10 ngày bắt đầu xuất đốm màu xanh mơ sẹo hình thành chồi (Hình 1) Kết nghiên cứu tổng hợp bảng Bảng Ảnh hưởng môi trường thời gian chiếu sáng đến hiệu tái sinh Giống lúa Nền Thời gian Tỷ lệ ∑ mẫu môi chiếu tái sinh chồi cấy trường sáng(h) (%) NB J02 MS NB ĐS1 MS 12 58 79,33 ± 3,23a 24 60 80,00 ± 3,33 12 72 55,56 ± 5,56b 24 26 53,33 ± 3,33b 12 46 51,67 ± 6,67a 24 32 7,62 ± 3,62c 12 96 31,25 ± 6,63b 24 48 4,17 ± 4,17c a Ghi chú: Trong cột giống lúa, chữ khác thể sai khác có ý nghĩa thống kê với P < 0,05 Số liệu bảng cho thấy giống J02 dễ tái sinh ĐS1, cụ thể, tỷ lệ tái sinh chồi dao động từ 53,33 - 79,33% giống J02 4,17 - 51,67% giống ĐS1 Đối với giống J02, thời gian chiếu sáng không ảnh hưởng tới tỷ lệ tái sinh chồi, ghi nhận khác biệt có ý nghĩa thống kê mơi trường NB MS Trong đó, môi trường NB cho tỷ lệ tái sinh cao hơn, đạt ~80%, cịn mơi trường MS đạt 53 - 55% (Hình 1) Thí nghiệm giống ĐS1 ghi nhận kết khác so với giống J02 Thời gian chiếu sáng 12 cho hiệu tái sinh vượt trội so với thời gian gian chiếu sáng 24 (