Xác định mã vạch ADN cho loài cây sưa đỏ (dalbergia tonkinensis), phục vụ giám định loài

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đƣợc khóa luận này, với lịng biết ơn sâu sắc nhất, tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Trƣờng Đại học Lâm nghiệp giúp đỡ bảo tận tình tơi suốt q trình thực khóa luận trƣờng, đặc biệt giúp đỡ thầy cô bên môn Công nghệ gen Di truyền phân tử Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Hà Văn Huân, TS Bùi Thị Mai Hƣơng tận tình giúp đỡ bảo tơi q trình hồn thành khóa luận Đặc biệt, Khóa luận nhận đƣợc hỗ trợ từ Đề tài cấp Nhà nƣớc "Xây dựng sở liệu mã vạch ADN (DNA barcode) cho số loài lâm nghiệp gỗ lớn, lâm sản ngồi gỗ có giá trị kinh tế" PGS.TS Hà Văn Huân làm Chủ nhiệm Với kiến thức kỹ thầy cô truyền dạy khơng giúp tơi hồn thành khóa luận mà cịn tài sản q báu theo giúp tơi sau Cảm ơn anh chị thuộc Viện Công nghệ sinh học quan tâm giúp đỡ suốt thời gian thực khóa luận Chân thành cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên hỗ trợ suốt thời gian qua Mặc dù có nhiều cố gắng để hồn thành khóa luận cách hồn chỉnh nhất, song khơng thể tránh khỏi thiếu sót Do vậy, tơi mong đƣợc góp ý thầy bạn để kiến thức tơi đƣợc hồn thiện Xuân Mai, ngày 08 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Đinh Kim Ngân i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Sƣa đỏ 1.1.1 Phân loại khoa học 1.1.2 Phân bố, sinh thái 1.1.3 Đặc điểm sinh học 1.1.4 Giá trị sử dụng 1.2 Tổng quan DNA barcode 1.2.1 Giới thiệu mã vạch DNA barcode 1.2.2 Một số DNA barcode đƣợc sử dụng 1.2.3.Tình hình nghiên cứu DNA barcode thực vật 14 CHƢƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 20 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 20 2.3.1.Vật liệu nghiên cứu 20 2.3.2 Hóa chất 20 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Tách chiết DNA tổng số 22 2.4.2 Phƣơng pháp nhân gen đích kỹ thuật PCR 25 2.4.2.1 Các bƣớc tiến hành phản ƣng PCR 25 ii Thể tích phản ứng PCR mẫu 50 l 25 2.4.3 Tinh sản phẩm PCR 27 2.4.4 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Kết tách chiết DAN tổng số 28 3.2 Kết nhân vùng gen nghiên cứu kỹ thuật PCR 29 3.3 Phân tích kết 29 3.3.1 Xác định phân tích trình tự DNA vùng gen nghiên cứu 29 3.3.2 So sánh khả phân biệt đoạn trình tự 47 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 4.1 Kết luận 49 4.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ATP Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat BME β-mereaptoethanol β-mereaptoethanol BOLD Barcode of Life data Barcode of Life data Bp Base pair Cặp base CBOL Consortium for the Barcode Consortium for the of Life Barcode of Life CITES Convention on International Trade in Endangered Công ƣớc buôn bán Species of Wild Fauna and quốc tế loài nguy cấp Flora cpDNA Chloroplast DNA CTAB Cetyl trimethylammonium bromide Cetyl trimethylammonium bromide Cytb Cytochrome b Cytochrome b 10 DNA (ADN) Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic 11 dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate Deoxyribonucleotid triphosphate 12 EBA Extraction Buffer A Đệm tách A 13 EBB Extraction Buffer B Đệm tách B 14 EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid 15 F-Primer Foward-Primer Mồi xuôi 16 IGS Intergenic Spacer vùng liên gen gen lục lạp iv axit ethylenediamine tetraacetic 17 ITS Internal Transcribed Spacer vùng DNA nằm gen 18 Kb Kilobase (1000 base) 1000 cặp base 19 mtDNA Mitochondrial DNA DNA ty thể 20 NAD(P)H Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ sinh học 22 ORF Open Reading Frame Khung đọc mở 23 PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase 24 PVP Polyvinyl pyrrolidone Polyvinyl pyrrolidone 25 RFLP Restriction fragment length polymorphism Phân tích đa hình trình tự DNA 26 RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic 27 rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome 28 SDS Sodium Dodecyl Sulphate Sodium Dodecyl Sulphate 29 R-Primer Reverse primer Mồi ngƣợc 30 TAE Tris-Acetate-EDTA 31 tRNA Transfer RNA ARN vận chuyển 31 UV Untraviolet Tia cực tím 21 v Tris-Acetate-EDTA DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại khoa học Sƣa đỏ Bảng 1.2 Thông tin số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp 11 Bảng 2.1 Kí hiệu mẫu Sƣa đỏ sử dụng cho nghiên cứu 20 Bảng 2.2 Thành phần đệm tách A (100ml) 21 Bảng 2.3 Thành phần đệm tách B (100ml) 21 Bảng 2.4 Thành phần đệm TE (100ml) 21 Bảng 2.5 Trình tự thơng tin cặp mồi đƣợc sử dụng 25 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 3.2 Một số lồi có trình tự gen matK tƣơng đồng với lồi Dalbergia tonkinensis Prain ngân hàng gen NCBI 32 Bảng 3.3 Một số lồi có trình tự gen rbcL tƣơng đồng với lồi Dalbergia tonkinensis Prain ngân hàng gen NCBI 36 Bảng 3.4 Một số lồi có trình tự gen trnH-psbA tƣơng đồng với lồi Dalbergia tonkinensis Prain ngân hàng gen NCBI 39 Bảng 3.5 Một số lồi có trình tự gen ITS tƣơng đồng với loài Dalbergia tonkinensis Prain ngân hàng gen NCBI 43 Bảng 3.6 Một số lồi có trình tự gen ITS2 tƣơng đồng với loài Dalbergia tonkinensis Prain ngân hàng gen NCBI 46 Bảng 3.7 Bảng so sánh khả phân biệt Các đoạn trình tự matK, rbcL, trnH-psbA 48 Bảng 3.8 Bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự ITS, ITS2 48 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái Sƣa đỏ Hình 1.2 Hình thái Sƣa đỏ Hình 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số mẫu Sƣa đỏ 28 Hình 3.2 Kết PCR gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS, ITS2 mẫu Sƣa đỏ 29 Hình 3.3 Sự khác biệt cấp độ loài theo đoạn gen matK lồi Dalbergia tonkinensis Prain với trình tự với trình tự gen lồi Dalbergia hainanensis 31 Hình 3.4 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn matK tạo NCBI 33 Hình 3.5 Sự khác biệt cấp độ lồi theo đoạn gen rbcL loài Dalbergia tonkinensis Prain với trình tự với trình tự gen lồi Dalbergia hainanensis 35 Hình 3.6 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn rbcL tạo NCBI 37 Hình 3.7 Sự khác biệt cấp độ loài theo đoạn gen trnH-psbA loài Dalbergia tonkinensis Prain với trình tự với trình tự gen loài Dalbergia hainanensis 38 Hình 3.8 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn trnH-psbA tạo NCBI 40 Hình 3.9 Sự khác biệt cấp độ loài theo đoạn gen IST lồi Dalbergia tonkinensis Prain với trình tự với trình tự gen lồi Dalbergia odorifera voucher GD2 42 Hình 3.10 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn ITS tạo NCBI 44 Hình 3.11 Sự khác biệt cấp độ lồi theo đoạn gen IST2 loài Dalbergia tonkinensis Prain với trình tự với trình tự gen lồi Dalbergia odorifera voucher GD2 45 Hình 3.12 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn IST2 tạo NCBI 47 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Sƣa đỏ (hay gọi Huỳnh Đàn lõi đỏ, Huê, Trắc thối…) tên khoa học Dalbergia Tonkinensis Prain thuộc họ Đậu (Fabaceae) Là gỗ nhóm IA (đƣợc xếp vào loại quý hiếm, cấm khai thác sử dụng với mục đích thƣơng mại năm 1994) Chủ yếu phân bổ Việt Nam đƣợc tìm thấy rải rác Hải Nam, Trung Quốc [25] Gỗ Sƣa cho mùi thơm quyến rũ thoảng nhẹ kiểu hƣơng trầm, đặc biệt gỗ thớ mịn có vân bốn mặt không hai mặt nhƣ loại gỗ khác, đƣa ánh sáng óng ánh bảy màu Sƣa lồi gỗ q có giá trị kinh tế sử dụng cao Mặc dù đƣợc luật pháp quan chức tích cực bảo vệ nhƣng đến loài bị khai thác theo kiểu tận diệt tự nhiên Các hầu hết dạng tuổi nhỏ đƣợc gây trồng với nhiều mục đích khác từ nguồn giống khó xác định quản lý Tuy vậy, thơng tin lồi cịn [8] Hiện nay, lồi bị đe dọa mơi trƣờng sống Tại Việt Nam phủ xếp vào nhóm cần bảo vệ nghiêm ngặt, cho phép trồng khoanh nuôi Trong công tác kiểm nghiệm nay, phƣơng pháp chủ yếu đƣợc sử dụng dựa hình thái học (quan sát mắt qua tiêu hiển vi) Tuy nhiên, phƣơng pháp gặp trở ngại sau nguyên liệu thực vật qua xử lý hình thái gần giống nhau, gây khó khăn việc phân loại nghiên cứu nhân giống Hiện nay, sử dụng phƣơng pháp mã vạch ADN công cụ hữu hiệu phục vụ định danh lồi xác, nhanh chóng, tự động hóa cách sử dụng vùng ADN chuẩn hay gọi thị mã vạch DNA Chính vậy, tơi thực đề tài nghiên cứu “Xác định mã vạch ADN cho Sƣa đỏ (Dalbergia tonkinensis Prain) phục vụ giám định loài” CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Sƣa đỏ 1.1.1 Phân loại khoa học Bảng 1.1 Phân loại khoa học Sưa đỏ Giới (Regnum) Plantae Bộ (Ordo) Fabales Họ (Familia) Fabaceae Phân họ (Subfamilia) Faboideae Tông (Tribus) Dalbergieae Chi (Genus) Dalbergia Loài (Species) D tonkinensis 1.1.2 Phân bố, sinh thái Mùa hoa từ tháng - 7, chín từ tháng - 12 Cây tái sinh hạt chồi nơi có độ che phủ dƣới 50% Cây mọc rải rác rừng, đất có tầng dày, giàu chất dinh dƣỡng, độ cao từ thấp tới 600 - 700 m, tới 1000 m Trong nƣớc, Sƣa đỏ thƣờng phân bố khu vực nhƣ: Đà Nẵng, Quảng Nam (Hiên, Giàng, Phƣớc Sơn), Kontum (Đắk Tô, Sa Thầy), Gia Lai, Đắk Lắk, Lâm Đồng, Bình Dƣơng, Tây Ninh, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu, Kiên Giang Trên giới thƣờng phân bố nƣớc: Thái Lan, Lào, Campuchia [25] 1.1.3 Đặc điểm sinh học Hình 1.1 Hình thái Sưa đỏ Hình 1.2 Hình thái Sưa đỏ Là gỗ nhỡ, rụng theo mùa, cao từ - 12 m (cũng cao tới 15m), sinh trƣởng trung bình Thân dạng hợp trục, dáng phân tán Vỏ thân màu vàng nâu hay xám, nứt dọc Cành non màu xanh, có lơng mịn thƣa Lá mọc cách, cấu tạo dạng kép lơng chim lẻ, kép có từ - 17 chét đính so le cuống Lá chét hình xoan thn, đầu nhọn có mũi Từ tƣơng đồng trình tự, nhận thấy khơng có khác cấp độ cá thể lồi Sƣa đỏ Do lấy trình tự mẫu đại diện cho lồi để phân tích kết So sánh khác biệt cấp độ loài theo đoạn gen trnH-psbA lồi Dalbergia tonkinensis Prain với trình tự với trình tự gen lồi Dalbergia hainanensis cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số MF926268.1 Sự sai khác trình tự đoạn gen đƣợc thể nhƣ hình 3.7: Range 1: 72 to 382GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match Alig nment stati sti cs fo r matc h #1 Score Expect Identities Gaps Strand 536 bits(290) 1e-148 304/311(98%) 0/311(0%) Plus/Plus Query ACTGCCTTGATCCACTTGGCTACATCCGCCCTTAATAAAAATCTCCGAGACTAAACCAtt 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 72 ACTGCCTTGATCCACTTGGCTACATCCGCCCTTAATAAAAATCTCCGAGACTAAACCATT 131 Query 61 tatactcttttcttttgttattatttttctgtttcttctctaactttagtttttactcgt 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 132 TATACTCTTTTCTTTTGTTATTATTTTTCTGTTTCTTCTCTAACTTTAGTTTTTACTCGT 191 Query 121 ttcCTAAGATAGGATGGGGTACAAAAAGCAAAAGAATGGAAGCATTCATTTGtttttttt 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 192 TTCCTAAGATAGGATGGGGTACAAAAAGCAAAAGAATGGAAGCATTCATTTGTTTTTTTT 251 Query 181 tAACATATGACTTTGCAATGTaaaaaaaaaaaGTAAAGGAGCAATATCAACAGAGTTTCT 240 Sbjct 252 TAACATATGACTTTGCAATGTAAAAAAAAAAAGTAAAGGAGCAATAGAAACTCTGTTGAT 311 Query 241 ATTGCTCCTTTACTTTCAAAAACTCGTATCCTTTAAGACAAAAATATTATCCATTTATAG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||| ||| | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 312 ATTGCTCCTTTACTTTCAAAAACTCGTATCCTTTAAGACAAAAATATTATCCATTTATAG Query 301 ATGGAGCCTCG 371 311 ||||||||||| Sbjct 372 ATGGAGCCTCG 382 Hình 3.7 Sự khác biệt cấp độ o i theo đoạn gen trnH-psbA lồi Dalbergia tonkinensis Prain với trình tự với trình tự gen lồi Dalbergia hainanensis 38 Từ hình 3.7 nhận thấy tỷ lệ tƣơng đồng 98% Có điểm sai khác trình tự gen trnH-psbA nghiên cứu với trình tự đoạn gen trnH-psbA lồi Dalbergia hainanensis biết trƣớc ngân hàng NCBI Thay G T vị trí 227 Thay T A vị trí 232 Thay C G vị trí 233 Thay T A vị trí 234 Thay G T vị trí 238 Thay A C vị trí 239 Thay A C vị trí 228 Tiếp tục so sánh với đoạn gen trnH-psbA số lồi có trình tự tƣơng đồng ngân hàng gen NCBI cách sử dụng công cụ BLAST thiết lập đƣợc phát sinh chủng loại Một số loài có trình tự gen trnH-psbA tƣơng đồng dùng so sánh với lồi Sƣa đỏ (Dalbergia tonkinensis Prain) đƣợc trình bày bảng sau: Bảng 3.4 Một số lồi có trình tự gen trnH-psbA tương đồng với loài Dalbergia tonkinensis Prain ngân hàng gen NCBI Dalbergia tonkinensis FR854163.1 Tỷ ệ tương đồng 100% Dalbergia hainanensis voucher W14906 KY484388.1 99% Dalbergia hainanensis MF926268.1 98% Dalbergia odorifera isolate Y801 MF668133.1 98% Dalbergia odorifera voucher GD2 KY489998.1 98% Dalbergia odorifera voucher GD1 KY489997.1 98% Dalbergia odorifera voucher W23722 KY484373.1 98% Dalbergia hupeana voucher W8353 KY484384.1 95% 10 Dalbergia cultrata isolate BB1088 KR534083.1 93% 12 Dalbergia odorifera isolate PS0262MT01 GU396739.1 89% STT Mã số Tên loài 39 Kết xây dựng phát sinh chủng loại đƣợc thể nhƣ hình sau: Hình 3.8 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn trnH-psbA tạo NCBI Từ phát sinh chủng loại dựa số liệu trình tự gen trnH-psbA ta thấy lồi Dalbergia tonkinensis Prain có quan hệ gen gần với lồi Dalbergia hainanensis, Dalbergia tonkinensis, Dalbergia hainanensis voucher W14906,… có quan hệ xa với loài Dalbergia odorifera isolate PS0262MT01, Dalbergia hupeana voucher W8353, … 3.3.1.4 Trình tự đoạn gen ITS Kết xác định trình tự nucleotide cho thấy, đoạn gen ITS đƣợc nhân có kích thƣớc 819 bp, khơng có sai khác mẫu nghiên cứu, kết tƣơng đồng 100% 40 Kết giải trình tự đoạn gen ITS mẫu Sƣa đỏ nhƣ sau: GATCGCGGCGACGTGGGCGGTTCGCTGCCCGCGACGTTGTGA GAAGTCCACTGAACCTTATCATTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAAC AAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGTCGATGCCTC AATCCAGAGAGACCCGCGGACACGTTTCAACACCCGGGACAGACG AAGCTGCCCAGCAGCTCGCCTTCCCGAAAAGTCGGGACGGAGCCG CGCCCCGCGGCCTCTCGTCCCGGCGAAACAACCAACAAACCCCGG CGCGGAAAGCGCCAAGGAATCAACAATCGCAGAGCGCGTCCCGTC GGCCCGGAAACGGTGCTCGCACGGGCGACGTCGCAACACTCGAGT CCAAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTTGCATCGATGA AGAACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCG TGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCACTAG GCCAAGGGCACGCCTGCCTGGGTGTCACCAATCGCCGCCCCAACC CCTGTGCCTCCGGCCACGGAGCGGGGCGAATGCTGGCCTCCCGTG AGCACCGCCTCGCGGCTGGCTGAAAATCGGGTTCGTGGTGGATGC AGCGCCATGACAGACGGTGGTTGAGCGTGTTCTCGAGGCCAGTCA TGAGGGCGGCATCCACCAGCTCCGTACCCAGCGACCCGCGAGCGA TGTCGATCGCCCACGACGCGACCTCAGGTCAGGCGGGGCTACCCG CTGAGTTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACGAG GATTCCCCTA Từ tƣơng đồng trình tự, nhận thấy khơng có khác cấp độ cá thể lồi Sƣa đỏ Do lấy trình tự mẫu đại diện cho loài để phân tích kết So sánh khác biệt cấp độ loài theo đoạn gen ITS loài Dalbergia tonkinensis Prain với trình tự với trình tự gen lồi Dalbergia odorifera voucher GD2 cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số KY489989.1 Sự sai khác trình tự đoạn gen đƣợc thể nhƣ hình 3.9: 41 Range 1: to 725GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match Alig nment stati sti cs fo r matc h #1 Score Expect Identities Gaps Strand 1317 bits(713) 0.0 721/725(99%) 0/725(0%) Plus/Plus Query 70 Sbjct Query 130 Sbjct 61 Query 190 Sbjct 121 Query 250 Sbjct 181 Query 310 Sbjct 241 Query 370 Sbjct 301 Query 430 Sbjct 361 Query 490 Sbjct 421 Query 550 Sbjct 481 Query 610 Sbjct 541 Query 670 Sbjct 601 Query 730 Sbjct 661 Query 790 Sbjct 721 GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGTCGATG ||||| | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGTCGATG 129 CCTCAATCCAGAGAGACCCGCGGACACGTTTCAACACCCGGGACAGACGAAGCTGCCCAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCAATCCAGAGAGACCCGCGGACACGTTTCAACACCCGGGACAGACGAAGCTGCCCAG 189 CAGCTCGCCTTCCCGAAAAGTCGGGACGGAGCCGCGCCCCGCGGCCTCTCGTCCCGGCGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | CAGCTCGCCTTCCCGAAAAGTCGGGACGGAGCCGCGCCCCGCGGCCTCTCGTCCCGGCAA 249 AACAACCAACAAACCCCGGCGCGGAAAGCGCCAAGGAATCAACAATCGCAGAGCGCGTCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACAACCAACAAACCCCGGCGCGGAAAGCGCCAAGGAATCAACAATCGCAGAGCGCGTCC 309 60 120 180 240 CGTCGGCCCGGAAACGGTGCTCGCACGGGCGACGTCGCAACACTCGAGTCCAAAACGACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGTCGGCCCGGAAACGGTGCTCGCACGGGCGACGTCGCAACACTCGAGTCCAAAACGACT 369 CTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTTGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTTGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTG 429 GTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCC 489 ACTAGGCCAAGGGCACGCCTGCCTGGGTGTCACCAATCGCCGCCCCAACCCCTGTGCCTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACTAGGCCAAGGGCACGCCTGCCTGGGTGTCACCAATCGCCGCCCCAACCCCTGTGCCTC 549 CGGCCACGGAGCGGGGCGAATGCTGGCCTCCCGTGAGCACCGCCTCGCGGCTGGCTGAAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGCCACGGAGCGGGGCGAATGCTGGCCTCCCGTGAGCACCGCCTCGCGGCTGGCTGAAA 609 ATCGGGTTCGTGGTGGATGCAGCGCCATGACAGACGGTGGTTGAGCGTGTTCTCGAGGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCGGGTTCGTGGTGGATGCAGCGCCATGACAGACGGTGGTTGAGCGTGTTCTCGAGGCC 300 360 420 480 540 669 600 AGTCATGAGGGCGGCATCCACCAGCTCCGTACCCAGCGACCCGCGAGCGATGTCGATCGC ||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGTCATGAGGGCGGCCTCCACCAGCTCCGTACCCAGCGACCCGCGAGCGATGTCGATCGC 729 CCACGACGCGACCTCAGGTCAGGCGGGGCTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAATAAGCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCACGACGCGACCTCAGGTCAGGCGGGGCTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAATAAGCG 789 GAGGA ||||| GAGGA 660 720 794 725 Hình 3.9 Sự khác biệt cấp độ o i theo đoạn gen IST lồi Dalbergia tonkinensis Prain với trình tự với trình tự gen lồi Dalbergia odorifera voucher GD2 42 Từ hình nhận thấy có điểm sai khác trình tự gen ITS nghiên cứu với trình tự đoạn gen lồi Dalbergia odorifera voucher GD2 biết trƣớc - Thay A C vị trí 685 Tiếp tục so sánh với đoạn gen ITS số lồi có trình tự tƣơng đồng ngân hàng gen NCBI cách sử dụng công cụ BLAST thiết lập đƣợc phát sinh chủng loại Một số lồi có trình tự gen ITS tƣơng đồng dùng so sánh với loài Sƣa đỏ (Dalbergia tonkinensis Prain) đƣợc trình bày bảng 3.5: Bảng 3.5 Một số lồi có trình tự gen ITS tương đồng với loài Dalbergia tonkinensis Prain ngân hàng gen NCBI Tỷ ệ STT Mã số Tên loài tương đồng Dalbergia odorifera voucher GD2 KY489989.1 99% Dalbergia tonkinensis FR854140.1 100% Dalbergia odorifera voucher GD1 KY489988.1 99% Dalbergia odorifera voucher K70769 KM521377.1 99% Dalbergia sissoo isolate Ds15 KM276197.1 95% Dalbergia tonkinensis isolate MC-561 KY213799.1 96% Dalbergia sissoo isolate Ds16 KM276198.1 95% Dalbergia glomerata AB828633.1 94% Dalbergia latifolia isolate Dlat22 KM276143.1 91% 10 Dalbergia latifolia isolate DlatE KM276119.1 91% 43 Kết xây dựng phát sinh chủng loại đƣợc thể nhƣ hình sau: Hình 3.10 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn ITS tạo NCBI Từ phát sinh chủng loại dựa số liệu trình tự gen ITS ta thấy lồi Dalbergia tonkinensis Prain có quan hệ gen gần với loài Dalbergia tonkinensis, Dalbergia odorifera voucher GD2,… có quan hệ xa với loài Dalbergia latifolia isolate Dlat22, Dalbergia tonkinensis isolate MC-561… 3.3.1.5 Trình tự đoạn gen ITS2 Kết xác định trình tự nucleotide cho thấy, đoạn gen ITS2 đƣợc nhân có kích thƣớc 377 bp, khơng có sai khác mẫu nghiên cứu, kết tƣơng đồng 100% Kết giải trình tự đoạn gen ITS2 mẫu Sƣa đỏ nhƣ sau: ATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGA GTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCACTAGGCCAAGGGCAC GCCTGCCTGGGTGTCACCAATCGCCGCCCCAACCCCTGTGCCTCCG GCCACGGAGCGGGGCGAATGCTGGCCTCCCGTGAGCACCGCCTCG CGGCTGGCTGAAAATCGGGTTCGTGGTGGATGCAGCGCCATGACA GACGGTGGTTGAGCGTGTTCTCGAGGCCAGTCATGAGGGCGGCCT CCACCAGCTCCGTACCCAGCGACCCGCGAGCGATGTCGATCGCCC ACGACGCGACCTCAGGTCAGGCGGGGCTACCCGCTGAGTTTAAGC ATATCAATAAGCGGAGGA 44 Từ tƣơng đồng trình tự, nhận thấy khơng có khác cấp độ cá thể loài Sƣa đỏ Do lấy trình tự mẫu đại diện cho lồi để phân tích kết So sánh khác biệt cấp độ loài theo đoạn gen ITS2 lồi Dalbergia tonkinensis Prain với trình tự với trình tự gen lồi Dalbergia odorifera voucher GD2 công bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số KY489989.1 Sự sai khác trình tự đoạn gen đƣợc thể nhƣ hình 3.11: Range 1: 349 to 725GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match Alig nment stati sti cs fo r matc h #1 Score Expect Identities Gaps Strand 697 bits(377) 0.0 377/377(100%) 0/377(0%) Plus/Plus Query ATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 349 ATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTT 408 Query 61 GCGCCCGAAGCCACTAGGCCAAGGGCACGCCTGCCTGGGTGTCACCAATCGCCGCCCCAA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 409 GCGCCCGAAGCCACTAGGCCAAGGGCACGCCTGCCTGGGTGTCACCAATCGCCGCCCCAA 468 Query 121 CCCCTGTGCCTCCGGCCACGGAGCGGGGCGAATGCTGGCCTCCCGTGAGCACCGCCTCGC 180 Sbjct 469 CCCCTGTGCCTCCGGCCACGGAGCGGGGCGAATGCTGGCCTCCCGTGAGCACCGCCTCGC 528 Query 181 GGCTGGCTGAAAATCGGGTTCGTGGTGGATGCAGCGCCATGACAGACGGTGGTTGAGCGT 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 529 GGCTGGCTGAAAATCGGGTTCGTGGTGGATGCAGCGCCATGACAGACGGTGGTTGAGCGT 588 Query 241 GTTCTCGAGGCCAGTCATGAGGGCGGCCTCCACCAGCTCCGTACCCAGCGACCCGCGAGC 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 589 Query 301 GTTCTCGAGGCCAGTCATGAGGGCGGCCTCCACCAGCTCCGTACCCAGCGACCCGCGAGC 648 GATGTCGATCGCCCACGACGCGACCTCAGGTCAGGCGGGGCTACCCGCTGAGTTTAAGCA 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 649 GATGTCGATCGCCCACGACGCGACCTCAGGTCAGGCGGGGCTACCCGCTGAGTTTAAGCA Query 361 TATCAATAAGCGGAGGA 708 377 ||||||||||||||||| Sbjct 709 TATCAATAAGCGGAGGA 725 Hình 3.11 Sự khác biệt cấp độ o i theo đoạn gen IST2 loài Dalbergia tonkinensis Prain với trình tự với trình tự gen lồi Dalbergia odorifera voucher GD2 45 Từ kết thu đƣợc, nhận thấy khơng có điểm sai khác trình tự gen ITS2 lồi Sƣa đỏ nghiên cứu với trình tự đoạn loài Dalbergia odorifera voucher GD2 biết trƣớc Tỷ lệ tƣơng đồng 100% Tiếp tục so sánh với đoạn gen ITS2 số lồi có trình tự tƣơng đồng ngân hàng gen NCBI cách sử dụng công cụ BLAST thiết lập đƣợc phát sinh chủng loại Một số lồi có trình tự gen ITS2 tƣơng đồng dùng so sánh với loài Sƣa đỏ (Dalbergia tonkinensis Prain) đƣợc trình bày bảng 3.6: Bảng 3.6 Một số lồi có trình tự gen ITS2 tương đồng với loài Dalbergia tonkinensis Prain ngân hàng gen NCBI Tỷ ệ STT Mã số Tên loài tương đồng Dalbergia odorifera voucher GD2 KY489989.1 100% Dalbergia tonkinensis FR854140.1 99% Dalbergia odorifera voucher GD1 KY489988.1 100% Dalbergia tonkinensis isolate MC561-L KY213796.1 99% Dalbergia sissoo isolate Ds15 KM276197.1 97% Dalbergia sissoo isolate Ds16 KM276198.1 96% Dalbergia odorifera voucher MC62 KM521389.1 100% Dalbergia glomerata AB828633.1 96% Dalbergia latifolia isolate Dlat22 KM276116.1 94% 10 Dalbergia latifolia isolate DlatE KM276119.1 94% 46 Kết xây dựng phát sinh chủng loại đƣợc thể nhƣ hình 3.12 Hình 3.12 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn IST2 tạo NCBI Từ phát sinh chủng loại dựa số liệu trình tự gen ITS2 ta thấy lồi Dalbergia tonkinensis Prain có quan hệ gen gần với loài Dalbergia tonkinensis, Dalbergia odorifera voucher GD2,… có quan hệ xa với lồi Dalbergia latifolia isolate Dlat22, Dalbergia glomerata … 3.3.2 So sánh khả phân biệt đoạn trình tự 3.3.2.1 Các đoạn trình tự matK, rbcL, trnH-psbA Dựa vào kết so sánh trình tự đoạn gen matK, rbcL trnH-psbA lồi nghiên cứu với trình tự gen lồi Dalbergia hainanensis công bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số MF926268.1, ta lập đƣợc bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự matK, rbcL trnH-psbA nhƣ sau: 47 Bảng 3.7 Bảng so sánh khả phân biệt Các đoạn trình tự matK, rbcL, trnH-psbA Tên đoạn gen matK rbcL trnH-psbA Kích thước trình tự 748 599 331 Tỷ ệ sai khác 0% 0,17% 2,11% Số điểm sai khác Kết phân tích cho thấy so sánh trình tự matK, rbcL, trnH-psbA Dalbergia tonkinensis Prain với trình tự gen lồi Dalbergia hainanensis cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số MF926268.1 Tỷ lệ sai khác matK, rbcL, trnH-psbA lần lƣợt (0% :0.17% : 2,11%) Tỉ lệ sai khác gen trnH-psbA cao 2,11% Mặc dù cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự để xác định xác lồi cần định danh 3.3.2.2 Các đoạn trình tự ITS, ITS2 Dựa vào kết so sánh trình tự đoạn gen ITS, ITS2 lồi nghiên cứu với trình tự gen lồi Dalbergia odorifera voucher GD2 cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số KY489989.1, ta lập đƣợc bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự ITS, ITS2 Bảng 3.8 Bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự ITS, ITS2 Tên đoạn gen ITS ITS2 819 377 0,12% 0% Số điểm sai khác Kích thước trình tự Tỷ ệ sai khác Kết phân tích cho thấy so sánh trình tự ITS, ITS2 Dalbergia tonkinensis Prain với trình tự gen lồi Dalbergia odorifera voucher GD2 công bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số KY489989.1 Tỷ lệ sai khác 0,12%: 0% 48 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã thu thập đƣợc đầy đủ 03 mẫu Sƣa đỏ (Dalbergia tonkinensis Prain) Tách chiết đƣợc DNA tổng số 03/03 mẫu Sƣa đỏ (Dalbergia tonkinensis Prain) Nhân thành công đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS, ITS2 từ DNA tổng số Sƣa đỏ kỹ thuật PCR Xác định đƣợc trình tự nucleotide đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS, ITS2 loài 4.2 Kiến nghị Đƣa trình tự gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS, ITS2 lên Ngân hàng Gen Quốc tế để phục vụ nghiên cứu sau Tiếp tục thu thập mẫu Sƣa đỏ nghiên cứu thêm để đánh giá tồn diện tính đa dạng di truyền loài Nhân mã vạch DNA khác đối tƣợng Sƣa đỏ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Đinh Hoàng Long, Đỗ Lê Thăng (2008), “Cơ sở di truyền học phân tử tế bào”, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong (2015), “Xác định mã vạch cho Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis)”, Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, số 5/2015, trang 123 – 124 Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (2005), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục – Hà Nội, trang 191 -198 Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Lê Đình Lƣơng, Quyền Đình Thi (2004), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Đức Lƣợng (2002), Công nghệ gen NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Hồng Mai, Nguyễn Mạnh Cƣờng, Ngũ Trƣờng Nhân, Nguyễn Phƣơng Đại Nguyên, Nguyễn Thị Phƣơng Trang (2015), “Đặc điểm phân tử vùng gen rpoC loài Trắc (Dalbergia cochinchinensis Pierre) Sƣa đỏ (Dalbergia tonkinensis Prain) Việt Nam ứng dụng phân loại”, Tiểu ban đa dạng sinh học bảo tồn Trần Minh Đức, Lê Thái Hùng (2012), “Một số kết khảo sát lồi Sƣa (Dalbergia tonkinensis Prain) tình hình trồng tỉnh Thừa Thiên Huế”, Tạp chí Khoa học , Đại học Huế, Tập 75A, Số 6, 19-28 TIẾNG ANH Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W (2003), “Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms”, J Evol Biol, (6), pp 558-576 10 CBOL, Plant Working Group (2009), DNA barcode for land plants PNAS, pp 106 11 Chen S.Y.H Han J Liu C Song J Et Al (2010), “Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species”, PloS ONE 5: e8613 12 Gao T.Y.H Song j Liu C Zhu Y Et Al (2010), “Identification of ITS2”, Journal of Ethnopharmacology, 130, pp 116 - 121 13 Hebert P.D.N , C.A Ball S L , Proc R Soc Lond B Biol Sci, 270, pp 313 - 321 14 Kress, J.W.Wurdack, K.J ,Zimmer, E A ,Weigt, L A & Janzen, D.H (2005), “Use of DNA barcodes to identify flowering plants”, Molecular Econogy, Proc Natl Acad Sci USA, 102, pp 8369 - 8374 15 Mark Y S H.P.D.N (2008), “Barcode of life”, Scientific American, pp 82 - 88 16 Shaw J., Lickey E.B., Schilling E E., Small R.L (2007),” Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III Amer J Bot, (94), pp 275-288 17 Storchova H., M S Olson (2007), “The architecture of the chloroplast psbA-trnH non coding region in angiosperms” Plant systematic and evolution Biomedical and life sciences, Vol 268, No 1-4, pp 235-256 18 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14 19 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources (9), pp.1086-1091 20 Vijayan K and Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 21 Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R (2010) “DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology (10), pp.205 22 Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single-copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade”, Genetics (174), pp 1407-1420 23 Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2010), “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5), pp.13102 24 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L and Hui Y (18 December, 2010) “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(24), pp 2706-2709 WEBSITE 25 https://vi.wikipedia.org/wiki/Sƣa ... pháp mã vạch ADN công cụ hữu hiệu phục vụ định danh lồi xác, nhanh chóng, tự động hóa cách sử dụng vùng ADN chuẩn hay cịn gọi thị mã vạch DNA Chính vậy, thực đề tài nghiên cứu ? ?Xác định mã vạch ADN. .. phân tử ADN mã vạch cho loài Sến mật (Madhuca pasquierii) phục vụ giám định loài? ??„ phân lập đoạn DNA barcoding cho loài Trà hoa vàng Tam đảo (Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh) phục vụ bảo tồn... dẫn đến khó khăn xác định lồi Do khơng thể sử dụng vùng DNA để xác định cho loài khác mà cần lựa chọn vùng DNA khác cho xác định loài khác [21], [22] Hiện hệ thống DNA barcode cho thực vật chƣa