Phân lập một số chủng nấm trichoderua từ đất trồng rừng

LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học Trƣờng Đại học Lâm nghiệp, để đánh giá kết học tập hồn thiện q trình học tập trƣờng, gắn lý thuyết vào thực tiễn Đƣợc đồng ý Trƣờng Đại học Lâm nghiệp, Viện Công nghệ Sinh học, giáo viên hƣớng dẫn, tiến hành thực khóa luận tốt nghiệp với đề tài “Phân lập số chủng TRICHODREMA từ đất trồng rừng" Đƣợc giúp đỡ thầy giáo trƣờng nói chung thầy cô Viện Công nghệ Sinh học nói riêng, gia đình, bạn bè với cố gắng, nỗ lực thân tơi hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới quý thầy, cô Trƣờng Đại học Lâm nghiệp, thầy cô Viện Công nghệ Sinh học học truyền đạt kiến thức quý báu cho thời gian học tập trƣờng Đặc biệt, xin chân thành cảm ơn Th.S Nguyễn Thị Minh Hằng ln quan tâm,tận tình hƣớng dẫn đóng góp kiến thức quý báu cho tơi thời gian hồn thành khóa luận Đồng thời,tơi xin chân thành cảm ơn môn Công nghệ vi sinh hóa sinh tồn thể cán mơn tận tình giúp đỡ tơi q trình thực nghiện cứu Viện để hoàn thành luận án Cuối xin cảm ơn gia đình, bạn bè ngƣời thân động viên giúp đỡ tơi thời gian qua Trong q trình nghiên cứu nhiều lý chủ quan, khách quan, khóa luận khơng tránh khỏi thiếu xót, hạn chế Tơi mong nhận đƣợc thơng cảm đóng góp ý kiến thầy, bạn sinh viên Tôi xin chân thành cảm ơn! Xuân Mai, ngày…tháng…năm 2018 Sinh viên thực Đinh Lê Đức MỤC LỤC CHƢƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu nấm Trichodrema 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Nguồn gốc 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.1.4 Đặc điểm sinh thái 1.1.5 Cơ chế tác động nấm Trichoderma lên nấm gây bệnh trồng 1.1.6 Cơ chế đối kháng Trichoderma 1.1.7 Ứng dụng nấm Trichoderma lĩnh vực 1.2 Tình hình nghiên cứu giới 1.3 Tình hình nghiên cứu nƣớc 10 CHƢƠNG 12 MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 MỤC TIÊU 12 2.2 Đối tượng nghiên cứu 12 2.3 Nội dung nghiên cứu 12 2.4 Phương pháp nghiên cứu 12 2.4.1 Phương pháp thu mẫu 12 2.4.2 Phương pháp phân lập nấm Trichodrema 12 2.4.3 Quan sát số đặc điểm sinh học nấm Trichodrema 15 2.4.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính đối kháng nấm Trichodrema chủng nấm bệnh Aspergillus flavus Aspergillus niger 16 Chƣơng 17 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 3.1.1 Phân lập tuyển chọn số chủng Trichodrema từ đất trồng rừng 17 3.2 Kết xác định hoạt tính đối kháng nấm Trichodrema với nấm mốc Aspergillus flavus Aspergillus niger 18 3.2.2 Khả đối kháng nấm Trichodrema với nấm mốc Aspergillus flavus 19 3.2.3 Khả đối kháng nấm Trichodrema với A.niger 20 CHƢƠNG 22 KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO 23 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Chú giải TSM Trichoderma Specific Medium PGA Potato Glucose Agar UV Ultraviolet DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sự tăng cƣờng phát triển rễ lĩnh vực trồng ngơ đậu tƣơng dịng T harzianum T-22 (G E Harman, Cornell University, Geneva) Hình 3.1 Các chủng nấm phân lập đƣợc 17 Hình 3.2: Trichodrema Aspergillus flavus trƣớc 24h ni cấy 18 Hình 3.3: Trichodrema Aspergillus flavus sau 24h nuôi cấy 19 Hình 3.4: Trichodrema với A.flavus đƣợc ni cấy mơi trƣờng PGA A HÌnh 3.5: Trichodrema A.niger trước ni cấy 20 Hình 3.6 Hiệu nấm đối kháng Hiệu nấm đối kháng ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam quốc gia nông nghiệp, đa dạng giống trồng với nhiều lồi chủ lực có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên sản xuất nông nghiệp, suất chất lƣợng trồng bị đe dọa dịch hại, đặc biệt bệnh hại Để bảo vệ suất chất lƣợng trồng, biện pháp hóa học đƣợc sử dụng rộng rãi sử dụng nhiều thuốc hóa học tạo tính kháng dịch hại gây ô nhiễm môi trƣờng khó phịng trừ đƣợc nhóm nấm gây bệnh hại trồng có nguồn gốc đất Chính thế, vi khuẩn nấm đối kháng đƣợc sử dụng rộng giới Việt Nam để phòng trừ bệnh hại trồng nhằm thân thiện với môi trƣờng phù hợp với sản xuất nông nghiệp theo hƣớng hữu Trong số vi sinh vật đối kháng, nấm Trichoderma đƣợc sử dụng nhiều phòng trừ bệnh hại trồng giới Việt Nam nhƣ T viride, T harzianum T hamatum Trichodrema loại nấm mốc có phổ đối kháng rộng loại nấm gây bệnh hại trồng có khả khích thích phát triển rễ Việc khai thác tiềm nấm Trichodrema dƣới dạng chế phẩm sinh học nhƣ tác nhân sinh học phòng trừ sâu bệnh haị trồng, giúp cho sinh trƣởng phát triển tốt đƣợc nƣớc giới có nƣớc ta quan tâm nhằm tạo sản phẩm nơng nghiệp khơng có dƣ lƣợng thuốc hóa học u cầu sức khỏe cộng đồng, xuất cân môi trƣờng sinh thái, hƣớng đến nơng nghiệp bền vững.Vì việc phân lập tuyển chọn chủng Trichodrema thích hợp với loại đất trồng nông nghiệp vô cần thiết Khóa luận tốt nghiệp nhằm mục đích phân lập số chủng Trichodrema từ đất với độ xác cao, kết hợp với định danh hình thái để phân biệt dạng nấm Trichodrema số loại đất trồng khác CHƢƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu nấm Trichodrema 1.1.1 Phân loại Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Euascomycetes Bộ: Hypocreacea Giống: Trichoderma 1.1.2 Nguồn gốc Nguồn gốc Trichoderma loại nấm đất Chúng đƣợc tìm thấy khắp nơi trừ vĩ độ cực Nam cực Bắc Nấm Trichoderma phổ biến khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, chúng sống rễ cây, đất hay sống xác sinh vật chết, xác bã hữu hay kí sinh loại nấm khác Mỗi dòng nấm Trichoderme khác yêu cầu nhiệt độ độ ẩm khác (Gary E Harman 2000) Trichoderma phát triển đất có độ pH từ 3.5 - nhƣng khơng thể phát triển điều kiện pH nhỏ 3.5 phát triển tốt độ pH trung tính 1.1.3 Đặc điểm hình thái Trichoderma loại nấm bất tồn, sinh sản vơ tính đính bào tử từ khuẩn ty: Khuẩn ty vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, cuối nhánh phát triển thành khối trịn mang bào tử trần khơng có vách ngăn, không màu, liên kết thành chùm nhỏ đầu cành nhờ chất nhầy Bào tử hình cầu, hình elip hình thn Khuẩn lạc nấm có màu trắng từ lục trắng đến màu lục, vàng, xanh Các chủng nấm Trichoderma phát triển nhanh, chúng đạt đƣờng kính khuẩn lạc từ - 9cm sau ngày ni cấy [1] Bào tử: Có màu xanh đặc trƣng, nhƣng có màu trắng nhƣ T.virens hay vàng hay xanh xám tuỳ thuộc vào dịng nấm Bào tử ln đơn bào, hình elip, oval, hình cầu, hay hình chữ nhật đa số bào tử trơn láng Kích thƣớc bào tử nấm Trichoderma không 5mm Bào tử chống chịu – Chlamydospores (Theo Gary J.Samuels 2004) Chlamydospores cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả sống sót đất - môi trƣờng sống nguyên thuỷ Trichoderma Chlamydospores đƣợc dùng để điều chế chất kiểm sốt sinh học khả sống sót mạnh mẽ chúng môi trƣờng không đƣợc cung cấp chất dinh dƣỡng Chlamydospores nấm Trichoderma harzianum tồn 110 - 130 ngày dù không cung cấp chất dinh dƣỡng 1.1.4 Đặc điểm sinh thái Điều kiện phát triển tối ƣu nấm 25 - 30°C Một vài loại phát triển tốt 35°C Một số phát triển tốt 40°C [9] Tuy nhiên, theo Prasun K Mukherjee Kanthadai Ragh (1997) đa số lồi Trichoderma phát triển mạnh 25 - 30°C, phát triển chậm 35°C - 37°C Hình thái khác nhiệt độ khác Ở 35°C chúng tạo khuẩn lạc rắn dị thƣờng với hình thành bào tử nhỏ mép bất thƣờng, 37°C không tạo bào tử sau ngày nuôi cấy 1.1.5 Cơ chế tác động nấm Trichoderma lên nấm gây bệnh trồng Nấm Trichoderma đƣợc sử dụng để bảo vệ trồng chống bệnh nấm hại (Pythium, Phytophthora, Rhizoctonia, Sclerotinium, Botrytin, Fuaorium) gây bệnh loại trồng nhƣ: Bông, nho, bắp, đậu nành, mận Nấm Trichoderma ảnh hƣởng trực tiếp lên mầm bệnh mà ảnh hƣởng gián tiếp lên hệ rễ giả khả loại bỏ mầm bệnh hay hỗ trợ cung cấp chất dinh dƣỡng cho (Theo Gary J.Samuels 2004)[10] Harman E Gary (2000) : Mô tả tƣợng Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh tƣợng “Giao thoa sợi nấm” Hiện tƣợng giao thoa gồm giai đoạn: (1) Sợi nấm Trichoderma bao vây lấy sợi nấm gây bệnh (2) Sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy sợi nấm gây bệnh (3) Sợi nấm Trichoderma đâm xuyên làm thủng sợi nấm gây bệnh làm cho chất nguyên sinh sợi nấm gây bệnh bị phân huỷ dẫn đến sợi nấm gây bệnh chết Theo Gary J.Samuels 2000: Khi cộng sinh rễ, nấm Trichoderma ăn mòn ký sinh mặt khác dành chất dinh dƣỡng từ loài nấm khác Chúng phát triển mạnh cho hai chế ký sinh vào loại nấm khác tăng phát triển rễ Nó bao gồm chế sau: - Nấm kí sinh - Sự kháng sinh - Sự cạnh tranh dinh dƣỡng - Chịu đựng căng thẳng, tăng cƣờng phát triển rễ - Hồ tan, đọng dinh dƣỡng vô - Gây đối kháng - Enzyme làm hoạt tính mầm bệnh 1.1.6 Cơ chế đối kháng Trichoderma 1.1.6.1 Kháng sinh Gliotoxin Gliovirin: Đƣợc sản xuất T.virens chúng kìm hãm phát triển lồi Rhizoctonia Pythium Alkynpyroses (Hƣơng dừa) đƣợc sản xuất bởi: T.atroviride, T.konigii, T.hamatum Hoạt động Phytotoxin ngăn cản nảy mầm noãn bào tử nấm gây bệnh Phytophthrora cinnamomea bào tử Botrytiscinnerea Isonitriles đƣợc sản xuất T.hamatum, T.harzianum, T.viride, T.konigii,T.Polysprum hạn chế phát triển nấm bệnh Peptalbols: đƣợc sản xuất từ T.polysporum, T harzianum, T.konigii, hoạt động màng để ngăn cản tổng hợp enzyme Membrance associated hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá huỷ thành tế bào ngăn chăn phát triển mầm bệnh Viridin đƣợc sản xuất T.virens hạn chế nảy mầm bào tử, có khả nhƣ độc tố thực vật có hiệu lực nhƣ loại thuốc diệt cỏ 1.1.6.2 Ký sinh Tính hƣớng hố chất: Trichoderma nhận vật chủ Nấm ký sinh phân nhánh hƣớng nấm đƣợc định trƣớc Mặc dù tính hƣớng hố chất đƣợc cho thuận lợi cho đối kháng nhƣng khơng đƣợc cho biện pháp kỹ thuật thiết yếu nấm ký sinh Sự thừa nhận mặt sinh học phân tử: Đó xếp Lectin bề mặt tế bào mầm bệnh vật đối chứng Tấn công trực tiếp: Trichoderma gắn vào cuộn quanh sợi nấm vật chủ thơng qua hình thành dạng móc hay dạng giác bám tiết enzyme chinase, glucanase, protease Những enzyme có khả bào mịn thành tế bào vật bị bám giữ hay tiết loại kháng sinh gây thủng sợi nấm bệnh 1.1.6.3 Cạnh tranh Sự khai thác cạnh tranh: Nấm Trichoderma làm suy kiệt sau hút hết dƣỡngchất nấm gây bệnh cách thụ động dai dẳng bào tử chống chịu (Chlamydospores) Sự cạnh tranh mô chết hoại: Nấm gây bệnh Botrysis Sclerotina xâm nhập vào mô già hay chết nhƣ tảng để từ xâm nhập vào mô khoẻ Nấm Trichoderma sử dụng mô già mơ chết chủ , cách chúng cạnh tranh làm xâm nhiễm nấm Botrysis Sclerotina bề mặt 1.1.7 Ứng dụng nấm Trichoderma lĩnh vực 1.1.7.1 Lương thực nguyên liệu sợi Nấm Trichoderma có hiệu lực cao sản xuất nhiều loại enzyme ngoại bào Chúng đƣợc sử dụng cho sản xuất cellulose enzyme khác để làm giảm tính phức tạp polysaccharide Polysaccharide chất đƣợc Guilia V.V cộng (1982) Trichoderma lignorum đối kháng đƣợc với nhiều loại nấm gây bệnh nhƣ Fusarium, Alternaria tenus, Phomabetae, Sclerotium, Botrytis cinerea, Verticillum, Helminthosporium sativum chế phẩm đƣợc bón vào đất xử lý hạt Emxep V T (1989) nấm Trichoderma không tiêu diệt nhiều loài nấm gây bệnh trồng đất mà cịn có tác dụng cải thiện cấu trúc thành phần hoá học đất, đẩy mạnh phát triển vi khuẩn nốt sần cố định đạm có ích đất kích thích sinh trƣởng, phát triển trồng Well cộng (1972): Ở điều kiện đồng nấm Trichoderma harzianum ngăn chặn đƣợc bệnh thân rễ nấm Sclerotium rolfsii, bón vào đất với số lƣợng 1:10 theo thể tích Backman, Rddriquer (1975): Cho biết sử dụng phân từ nấm Trichoderma harzianum dạng hạt (140 kg/ha) ngăn chặn nấm Sclerotium rolfsii đồng Với bệnh Pythium spp, Rhizoctonia solani nấm Trichoderma harzianum có tác dụng ức chế, bảo vệ hạt họ đậu củ cải tránh bệnh chết ẻo Nhật Bản: Trichoderma lignorum trừ bệnh thối thân thuốc Corticium rolfsii đăng ký chế phẩm thƣơng mại (1995) Genecor (2000) khai thác thơng tin trình tự DNA để nhận biết gen quan trọng tổ chức sinh vật Sự tổng hợp điều hoà lƣợng enzyme tiết nấm Trichoderma reesei, nghiên cứu ƣu việc tạo vật liệu sinh học loại thuốc có nguồn gốc sinh học Genecor đề cập đến việc thúc đẩy q trình hồn thành việc đọc trình tự genome nấm Trichoderma, thơng tin thu thập từ việc đọc trình tự DNA nấm Trichoderma reesei cho kết quan trọng việc tổng hợp điều tiết để tạo nên enzyme quan trọng Từ làm tăng khả hình thành sản phẩm sinh học hƣớng nghiên cứu chuyên sâu, ứng dụng tạo nên enzyme quan trọng Từ làm tăng khả hình thành sản phẩm sinh học hƣớng nghiên cứu chuyên sâu, ứng dụng 1.3 Tình hình nghiên cứu nƣớc Ở Việt Nam việc nghiên cứu nấm Trichoderma đƣợc tiến hành từ năm 1987- 1990 Bộ môn bệnh Viện bảo vệ Thực vật tiến hành phân lập chủng nấm Trichoderma từ nguồn gốc khác xác định khả ức chế nấm Trichoderma số nấm gây bệnh Tìm phƣơng pháp ni cấy, tạo chế phẩm tiến dần đƣa sản xuất với qui mô lớn Các chủng Trichoderma thu thập đƣợc có hiệu ức chế cao từ 67.7- 85.5% loại nấm gây bệnh: Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Fisarium , Aspergilus ( Nguyễn Văn Lầm, 1995) Nguyễn Xuân Thành (2003) [3] nấm Trichoderma dùng để phân giải rác sinh hoạt phế thải nông nghiệp nhờ khả tiết hệ thống enzyme celluloase, enzyme bền nhiệt vi khuẩn Nhóm nghiên cứu Cao Cƣờng, Nguyễn Đức Lƣợng (Trƣờng Đại học Bách Khoa TPHCM 2003) [4] khảo sát trình cảm ứng enzyme chitinase, celluloase T harzianum có tác động phân hủy vách khuẩn ty nấm Sclerotium rolfsii làm khuẩn ty nấm gây bệnh nhăn nheo đứt vụn biến dạng Gần Viện Nghiên cứu mía đƣờng miền Nam tiến hành thử nghiệm nhân nấm Trichoderma môi trƣờng bã mía, bón lót hom mía để hạn chế số bệnh xảy gốc mía gây Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii Cơng trình nghiên cứu đem lại kết tốt việc dùng nấm Trichoderma chống bệnh cho bông, khoai tây số trồng khác Kết cho thấy có cạnh tranh với tác nhân gây bệnh: Thối rễ hoà thảo, thối đen rễ bắp cải, dƣa leo, cà chua, bầu bí, bệnh chết ẻo họ đậu, bệnh chết rạp thuốc lá, bệnh héo bông, dƣa hấu, ăn trái hàng loạt bệnh nấm gây (Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cữu Hƣơng Giang 1997) [5] Đỗ Tấn Dũng cộng tác viên (2001) khảo sát đặc tính sinh học khả chống chịu số nấm hại rễ trồng cạn nấm đối kháng 10 T.virides Kết thu đƣợc cho thấy chế phẩm từ nấm T.virides sử dụng nhƣ biện pháp sinh học phịng chống nhóm bệnh nấm gây hại vùng rễ trồng bệnh lở cổ rễ, héo rũ trắng gốc cà chua, dƣa chuột, đậu tƣơng giai đoạn hạt Trong điều kiện nhƣ cho thấy nấm T.virides có mặt trƣớc hiệu cạnh tranh, ức chế tiêu diệt sâu bệnh mật độ cao so với chúng có mặt hay sau nấm gây bệnh Nhóm Phan Thị Thanh Hoài cộng tác viên (Đại học Tây Nguyên 2004) nấm Trichoderma phối hợp với vỏ cà phê, vôi, phân urê, phân chuồng xạ khuẩn thành phân hữu vi sinh giúp tăng xuất đậu phụng, cải lên đến 30%, giảm sâu bệnh, giảm chi phí phân bón , giảm vấn đề nhiễm mơi trƣờng vỏ cà phê gây nên 11 CHƢƠNG MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 MỤC TIÊU Phân lập đƣợc số chủng Trichodrema từ đất trồng rừng Nghiên cứu khả đối kháng nấm Trichodrema với phát triển số loại nấm gây bệnh thực vật 2.2 Đối tượng nghiên cứu Đối tƣợng: Các chủng nấm Trichodrema từ đất trồng rừng Địa điểm nghiên cứu: Đề tài đƣợc thực phịng cơng nghệ vi sinh hóa sinh- Viện công nghệ sinh học 2.3 Nội dung nghiên cứu Phân lập nuôi cấy nhân sinh khối Trichodrema Khao sát khả đối kháng Trichodrema với số loại nấm bệnh thực vật 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp thu mẫu Các mẫu đất để phân lập nấm Trichoderma đƣợc thu thập độ sâu 20cm (300 g/mẫu) xung quanh gốc trồng khỏe đất trồng hàng năm lâu năm năm tỉnh Thanh Hóa Các mẫu đất đƣợc đựng túi nilon, dán nhãn, mang phịng thí nghiệm bảo quản 4°C sử dụng 2.4.2 Phương pháp phân lập nấm Trichodrema Nấm Trichoderma spp đƣợc phân lập theo phƣơng pháp Kumar et al (2012) Theo đó, mẫu đất đƣợc pha loãng lần nƣớc cất vơ trùng Tiếp theo, 0,5 ml dung dịch pha lỗng đƣợc nhỏ lên đĩa môi trƣờng TSM (Trichoderma Specific Medium) Các đĩa đƣợc ủ 28 ± 2°C 96 Tản nấm khác hình thái đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng Potato Glucose Agar (PGA) Nấm Trichoderma đƣợc giám định sơ dựa vào hình thái Sau cùng, nấm Trichoderma đƣợc phân lập kỹ thuật cấy đơn bào tử sử 12 dụng kim thủy tinh với hỗ trợ kính hiển vi quang học Các mẫu nấm đƣợc bảo quản 4°C đƣợc sử dụng trình nghiên cứu 2.4.2.1 Chuẩn bị môi trường phân lập bảo quản Khử trùng: Khử trùng thiết bị, dụng cụ thí nghiệm mơi trƣờng dinh dƣỡng Mục đích: Tiêu diệt tồn vi sinh vật ngoại lai diện môi trƣờng, tạo điều kiện vô trùng cho môi trƣờng để kết phân lập, ni cấy xác Ngun tắc khử trùng: Khơng làm biến tính mơi trƣờng, khơng làm biến tính số chất mơi trƣờng, sau khử trùng, môi trƣờng không sản sinh chất độc gây chết vi sinh vật nuôi cấy, phải đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối sau khử trùng, bảo đảm an toàn ngƣời sử dụng Phƣơng pháp: Đối với dụng cụ (Nút bông, ống nghiệm, que chang, hộp petri ,) đƣợc bọc giấy báo sau rửa làm khô, tiến hành khử trùng nồi hấp áp suất khoảng 1atm khoảng 30 - 45 phút chuyển sang tủ sấy (170°C, giờ) Đối với buồng cấy đƣợc khử trùng tia UV, số dụng cụ khác khử trùng cồn Chuẩn bị mơi trƣờng PGA: - Khoai tây: 200g - Glucose: 20g - Agar: 15g - Nƣớc cất 1l Sau vô trùng dụng cụ xong, tiến hành cân môi trƣờng (PDA) để làm môi trƣờng phân lập Môi trƣờng đƣợc hấp trùng 121°C khoảng 20 phút, sau phân phối khoảng 25ml môi trƣờng hộp lồng vơ trùng, để có mơi trƣờng thạch nghiêng ta rót khoảng - 4ml mơi trƣờng (Chƣa thành trùng) vào ống nghiệm đậy nút bông, đem hấp 13 trùng 121 C khoảng 20 phút sau đặt nghiêng ống nghiệm chứa mơi trƣờng cịn nóng 2.4.2.2 Tiến hành phân lập nấm Trichodrema Pha loãng mẫu: Chuẩn bị dụng cụ thiết bị: - đĩa petri; - bình tam giác loại 250ml 1000ml; - Micropipette, micropipette tips, que chà thủy tinh; - Cân phân tích, nồi hấp trùng; - ống nghiệm, cốc, muỗng; - Giá để ống nghiệm, đèn cồn; - Giấy gói đĩa petri, băng keo, bút; - Chuẩn bị mẫu: Mẫu đất lấy từ vƣờn; Tiến hành thí nghiệm: - Pha lỗng mẫu công đoạn nhƣng quan trọng trình phân tích vi sinh vật Việc pha lỗng mẫu nồng độ thích hợp giúp ích nhiều q trình định lƣợng nhƣ phân tích vi sinh vật - Đối với mẫu chất lỏng: Dùng pipet hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha lỗng, ta đƣợc nồng độ pha loãng Tiếp tục từ ống nghiệm hút tiếp 1ml cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng độ pha loãng Tiếp tục nhƣ đến nồng độ cần thiết - Đối với mẫu rắn: Cân xác 10g mẫu, sau cho vào 9ml dung dịch pha loãng nồng độ pha loãng Tiếp tục pha loãng tƣơng tự nhƣ mẫu chất lỏng 14 Phân lập: - Dùng pipet hút lấy dung dịch mẫu đó, nhỏ giọt vào hộp lồng đầu tiên, lấy que chang chang đều, dùng que chang ta chang tiếp vào khoảng - hộp lồng mà không cần nhỏ thêm dung dịch mẫu vào Làm lần lƣợt nhƣ mẫu Sau chang mẫu vào hộp lồng xong đánh giấu gói cẩn thận lại đem nuôi tủ ấm khoảng 30°C - Thƣờng xuyên kiểm tra hộp lồng ngày Nếu thấy có khuẩn lạc mọc lên cấy chủng sang mơi trƣờng thạch nghiêng đánh dấu cho vào tủ ấm để nuôi, theo dõi sau – ngày Chủng khơng lên loại bỏ, chủng lên giữ lại, bảo quản tủ lạnh – 40°C để giữ giống dùng cho việc nghiên cứu tiếp theo, cấy truyền định kỳ liên tục - Cứ theo dõi hộp lồng liên tục nhƣ khoảng - ngày mà không thấy có thêm khuẩn lạc xuất đem hấp bẩn vô trùng hộp lồng để tiến hành làm thí nghiệm với mẫu khác - Phƣơng pháp cấy truyền bảo quản giống môi trƣờng thạch nghiêng - Dán nhãn ghi: Tên giống vi sinh vật ngày cấy Một tay cầm ống nghiệm; ống giống ống môi trƣờng Tay lại cầm que cấy đốt đỏ dây cấy lửa đèn cồn để khử trùng Dùng ngón út ngón áp út rút nút bơng ống giống Hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm Đợi que cấy nguội, đƣa que cấy vào ống nghiệm lấy khuẩn lạc ống giống Rút que cấy tiến hành cấy truyền ống môi trƣờng Khử trùng lại phần khơng khí nơi miệng ống nghiệm đậy nút Khử trùng lại que cấy sau sử dụng xong 2.4.3 Quan sát số đặc điểm sinh học nấm Trichodrema Quan sát mẫu nấm Trichoderma môi trƣờng PGA cho thấy lúc đầu tản nấm có màu trắng, xốp hình thành cành bào tử phân sinh Sau ngày nuôi cấy, tản nấm chuyển dần sang màu xanh, hình thành 15 nhiều bào cành tử phân sinh Bào tử phân sinh nấm có dạng hình cầu hình trứng, bề mặt nhẵn Thể bình có dạng hình trụ Đa số mẫu thu thập đƣợc hình thành nhiều bào tử phân sinh, sau ngày nuôi cấy đến ngày thứ thứ nấm mọc kín đĩa chuyển mầu xanh hoàn toàn 2.4.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính đối kháng nấm Trichodrema chủng nấm bệnh Aspergillus flavus Aspergillus niger - Sau phân lập đƣợc số chủng Trichodrema đem xác định khả đối kháng Trichodrema với loại nấm bệnh Aspergillus flavus Aspergillus niger - Các chủng nấm bệnh Aspergillus flavus Aspergillus niger đƣợc cung cấp mơn Cơng nghệ vi sinh hóa sinh đƣợc ni cấy môi trƣờng PGA 16 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.1 Phân lập tuyển chọn số chủng Trichodrema từ đất trồng rừng - Từ số mẫu đất trồng rừng phân lập đƣợc chủng nấm Trichodrema từ đất ký hiệu T1, T2, T3, T4 Hình 3.1 Các chủng nấm phân lập đƣợc 17 Các mẫu đất sau đƣợc phơi khô, nghiền mịn, sử dụng để phân lập Trchodrema nhƣ mô tả (Chƣơng phần 2.4.2) Sau cùng, để làm nấm Trichoderma kỹ thuật cấy đơn bào tử sử dụng kim thủy tinh dƣới hỗ trợ kính hiển vi quang học kỹ thuật cấy ria đƣợc sử dụng Kết bƣớc đầu cho thấy mẫu đất thu thập đƣợc có nấm Trichoderma dựa vào đặc điểm hình thái mơi trƣờng PGA Đặc điểm tản nấm Sau ngày nuôi cấy, tản nấm chuyển dần sang màu xanh, hình thành nhiều bào cành tử phân sinh Bào tử phân sinh nấm có dạng hình cầu hình trứng, bề mặt nhẵn Thể bình có dạng hình trụ mọc thành chùm Kết cho thấy sau - ngày sợi nấm màu trắng phát triển bề mặt giá thể, sau chúng chuyển dần sang màu xanh nhạt (hình thành bào tử phân sinh) màu xanh đậm (lƣợng bào tử phân sinh đƣợc hình thành lớn nhất) 3.2 Kết xác định hoạt tính đối kháng nấm Trichodrema với nấm mốc Aspergillus flavus Aspergillus niger Sau xác đinh đƣợc chủng nấm Trichodrema xác định khả đối kháng với loại nấm mốc Aspergillus flavus Aspergillus niger cho kết đạt đƣợc Trchodrema T1 có khả đối kháng mạnh cịn T2, T3, T4 khơng có khả hoạt tính đối kháng với loại nấm bệnh 25 20 15 Trichodrema Aspergillus flavus 10 CT1 CT2 CT3 CT4 Hình 3.2: Trichodrema Aspergillus flavus trƣớc 24h nuôi cấy Sau 24h nuôi cấy Trichodrema Aspergilus flavus môi trƣờng nuôi cấy PGA phát triển nhanh chƣa có dấu hiệu đối kháng nấm Trichodrema với nấm bệnh 18 30 25 20 Trichodrema 15 Aspergillus flavus 10 CT1 CT2 CT3 CT4 Hình 3.3: Trichodrema Aspergillus flavus sau 24h nuôi cấy - Kết quả: Sau ngày nuôi cấy kết nghiên cứu ảnh hƣởng nấm Trichodrema đến phát triển nấm Aspergillus flavus công thức CT2, CT3, CT4 (Lần lƣợt nấm đối kháng Trichodrema T2, T3, T4) Trichodrema Aspergillus flavus phát triển nhanh không nhận thấy đối kháng nấm Trichodrema với Aspergillus flavus cịn ngƣợc lại cơng thức CT1 (Là nấm đối kháng Trichodrema T1) Trichodrema phát nhanh chóng đối kháng đƣợc nấm bệnh Aspergillus flavus 3.2.2 Khả đối kháng nấm Trichodrema với nấm mốc Aspergillus flavus Hình 3.4: Trichodrema với A.flavus đƣợc ni cấy mơi trƣờng PGA A A.flavus cấy trƣớc Trchodrema 24h B Trichoderma cấy trƣớc A.flavus 24h 19 Hình A Nấm hại A.flavus nuôi cấy trƣớc trƣớc Trichodrema 24h nấm hại phát triển bình thƣờng Đến ngày thứ nấm Trichodrema đƣợc cấy ,đến ngày thứ thấy đƣợc ức chế nấm, nấm A.flavus phát triển chậm lại Hình B Trichodrema đƣợc cấy trƣớc nấm A.flavus 24h thấy đĩa petri nấm Trichodrema bao phủ toàn bề mặt đĩa không thấy phát triển nấm A.flavus 3.2.3 Khả đối kháng nấm Trichodrema với A.niger 25 20 15 Trichodrema Aspergillus niger 10 CT1 CT2 CT3 CT4 HÌnh 3.5: Trichodrema A.niger trước nuôi cấy Trƣớc 24h nuôi cấy Trichodrema A.niger phát triển bình thƣờng chƣa thấy khả đối kháng Trichodrema Sau 24h nuôi cấy công thức thứ Trichodrema phát tiển nhanh bao phủ tồn đĩa petri khơng thấy phát triển nấm hại A.niger.Các cơng thức cịn lại chƣa thấy khả đối kháng nấm bệnh mà Trichodrema A.niger phát triển bình thƣờng 20 Hình 3.6 Hiệu nấm đối kháng Hiệu nấm đối kháng Trichodrema với A.niger A A.niger cấy trước Trichodrema 24h B Trchodrema cấy A.niger trước 24h Hình A Nấm A A.niger đƣợc nuôi cấy trƣớc Trichodema 24h nấm A.niger phát triển bình thƣờng sau cấy nấm Trichoderma nấm A.niger phát triển chậm lại Hình B Trichodrema cấy trƣớc A.niger 24h đĩa petri nấm Trichodrema bao phủ kín đĩa petri không thấy phát triển nấm hai A.niger 21 CHƢƠNG KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ Kết luận - Từ mẫu đất thu thập phân lập đƣợc chủng Trichodrema - Xác định khả đối kháng Trichodrema với chủng bệnh Kiến nghị - Do thời gian nghiên cứu tiến hành khóa luận cịn hạn chế nên tơi chƣa thực đƣợc số nội dung nghiên cứu chuyên sâu chủng nấm nhƣ định danh đến tên loài chủng nấm đƣợc tuyển chon - Tiếp tục tìm kiếm dịng Trichodrema hoang dại tự nhiên - Nghiên cứu khả đối kháng cao điều kiện phát triển tối ƣu - Chƣa xác định trình tự DNA biểu tính độc nấm Trichodrema với sâu bệnh hại 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Xuân Đồng, 1982 Nhóm nấm Hyphomytes Việt Nam Tập I Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội) Nguyễn Văn Tuất – Lê Văn Thuyết 2001 Sản xuất chế biến sử dụngthuốc bảo vệ thực vật thảo mộc sinh học Nhà xuất Nông Nghiệp 3.Nguyễn Xuân Thành 2003 Giáo trình cơng nghệ vi sinh vật sản xuất nông nghiệp xử lý ô nhiễm môi trƣờng Nhà xuất nông nghiệp Hà Nội Việt Nam 4.Nguyễ Đức Lƣợng, Cao Cƣờng, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hƣơng Công nghệ lên men Nhà xuất đại học quốc gia TP.HCM, 2004 Nguyễn Ngọc Tú - Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997 Bảo vệ trồng chế phẩm từ vi nấm Nhà xuất Nông nghiệp, TPHCM Sinh học phân tử (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng- chuyên ngành Sinh học phân tử – Khoa Sinh - Đại học Khoa học Tự Nhiên thuộc Đại học Quốc gia TPHCM) Nhà xuất giáo dục Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen (Khuất Bửu Thanh,2003) Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Giáo trình Sinh học phân tử 2002 ( Bùi Trang Việt – Khoa Sinh - Đại học Khoa học Tự Nhiên thuộc Đại học Quốc gia TPHCM) Tiếng nƣớc Gary J Samuels Trichoderma aguide to identification and biology RM United States Department of Agriculture Agricultural Research Service Systematic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350 USA 10 Gary J Samuels Trichoderma aguide to identification and biology RM United States Department of Agriculture Agricultural Research Service Systematic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350 USA 11 Gary J Samuels, 9-2005 Trichoderma: Systematic, the Sexual State, and Ecology United States Department of Agriculture Agricultural Research Service Systematic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705 Acepted for publication 23 ... 3.1.1 Phân lập tuyển chọn số chủng Trichodrema từ đất trồng rừng - Từ số mẫu đất trồng rừng phân lập đƣợc chủng nấm Trichodrema từ đất ký hiệu T1, T2, T3, T4 Hình 3.1 Các chủng nấm phân lập đƣợc... TIÊU Phân lập đƣợc số chủng Trichodrema từ đất trồng rừng Nghiên cứu khả đối kháng nấm Trichodrema với phát triển số loại nấm gây bệnh thực vật 2.2 Đối tượng nghiên cứu Đối tƣợng: Các chủng nấm. .. bền vững.Vì việc phân lập tuyển chọn chủng Trichodrema thích hợp với loại đất trồng nông nghiệp vô cần thiết Khóa luận tốt nghiệp nhằm mục đích phân lập số chủng Trichodrema từ đất với độ xác cao,