Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng song mật thu thập từ các tỉnh phía bắc sử dụng kỹ thuật RAPD

ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới nên tài nguyên thực vật dồi dào, với diện tích rừng Việt Nam thấy đa dạng loài hệ sinh thái thực vật vô phong phú Với mục tiêu trồng rừng phát triển kinh tế, tạo nguồn nguyên liệu cho ngành công nghiệp làng nghề sản phNm từ rừng phải ngày nâng cao chất lượng sản lượng Song mật (Calamus platyacanthus Warb Ex Becc) lồi lâm sản ngồi gỗ có giá trị kinh tế cao Song mật có đường kính lớn, dài, bền, dẻo, dễ uốn chịu lực tốt nên nguyên liệu sử dụng làng nghề mây tre đan nước Với quan tâm đầu tư nhà nước cho sở sản xuất tiểu thủ cơng nghiệp số lượng sản phNm từ làng nghề mây tre đan ngày tăng tỷ lệ nghịch với gia tăng giảm sút nghiêm trọng nguyên liệu đầu vào Theo thống kê, khoảng 35 – 42% sở mây tre đan phải sản xuất cầm chừng có nguy đóng cửa thiếu khơng chủ động nguyên liệu Việc thiết lập vùng nguyên liệu chuyên canh tập trung Song mật nhu cầu bách nước ta Trên nước có nhiều tỉnh triển khai việc nhân giống Song mật công tác nhân giống mang tính gây trồng hình thức gieo ươm hạt tạo đưa vào trồng rừng sản xuất với song mây giai đoạn phát triển chúng phải trải qua giai đoạn cỏ Đây giai đoạn mà tạo nhiều chồi, thời gian để chồi phát triển lâu, điều kéo theo chậm phát triển trồng Để khắc phục giai đoạn cỏ phương pháp nuôi cấy invitro Giải vấn đề thiếu nguồn nguyên liệu suy giảm nhanh chóng nguồn tài nguyên thực vật ngày 12 tháng năm 2008 Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn định số 1462/QĐ/BNN-KHCN việc: “Nghiên cứu tạo Song mật kỹ thuật nuôi cấy invitro” phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen nhân giống Song mật đưa nhanh vào trồng rừng sản xuất Nhận thức tầm quan trọng nguồn nguyên liệu đưa vào nhân giống sản xuất Để có nguồn ngun liệu tốt cho cơng tác nhân giống việc đánh giá, kiểm tra chất lượng nguồn giống vô quan trọng Một phương pháp đem lại hiệu quả, độ xác cao, rút ngắn thời gian công sức dùng thị phân tử để nghiên cứu đa dạng di truyền cho biết thành phần gen cá thể loài loài khác Đến nghiên cứu tính đa tính đa dạng di truyền Song mật để phục vụ công tác chọn giống Việt Nam bỏ ngỏ Vì vậy, tơi thực đề tài: “Nghiên cứu tính đa dạng di truyền số dòng Song mật thu thập từ tỉnh phía Bắc sử dụng kỹ thuật RAPD.” Đề tài đặt mục tiêu đánh giá mối quan hệ di truyền mẫu nghiên cứu từ làm sở cho việc xác định xuất xứ, giúp nhà chọn giống có kết luận xác tính di truyền tính trạng mang phNm chất tốt đối tượng Phục vụ cho công tác tuyển chọn nhân giống dòng Song mật có thời gian ni trồng ngắn, phNm chất tốt, sản lượng cao đáp ứng nhu cầu sản xuất chất lượng sản phNm đầu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Vấn đề chung sinh học phân tử phân tích đa dạng di truyền Sự đời phát triển sinh học đại cung cấp cơng cụ thích hợp cho phân tích, nghiên cứu di truyền cách nhanh chóng hiệu Đánh dấu đời kỹ thuật sinh học phân tử, nhờ mà biến đổi di truyền nghiên cứu trực tiếp cấp độ ADN phát lượng lớn tính đa hình tạo đột biến Vì vậy, làm cho kết việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phong phú, xác so với thị hình thái Một số kỹ thuật ADN sử dụng phổ biến đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism – RFLP) kỹ thuật dựa vào chuỗi phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) như: đa hình đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphism ADN – RAPD); Microsatellite hay cịn gọi đa hình đoạn lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeat – SSR); Đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism – AFLP); Tuy nhiên, khơng có kỹ thuật sinh học phân tử lý tưởng đáp ứng tất tiêu, loại có mạnh hạn chế riêng 1.1.1 Đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism – RFLP) Kỹ thuật RFLP (Bot Stein, et al., 1980), dùng cADN ADN ngẫu nhiên hệ gen mẫu dò, mẫu dị đánh dấu phóng xạ enzyme tiếp hợp để phát đoạn ADN có độ dài khác tạo sử dụng enzyme hạn chế để cắt ADN hệ gen phân tách phương pháp điện di gel [26] Nếu trình tự nhận biết có mặt vị trí hệ gen cá thể khơng có mặt cá thể khác, enzyme tạo đoạn hạn chế có kích thước khác vị trí Kết làm phát sinh hàng ngàn đoạn ADN có kích thước khác RFLP thị đồng hợp trội, đoạn ADN từ tất nhiễm sắc thể (NST) đồng dạng phát Vì vậy, RFLP thị đáng tin cậy phân tích liên kết chọn giống RFLP xác định đặc điểm liên kết trạng thái đồng hợp tử hay dị hợp tử cá thể, điều đặc biệt lý tưởng tính trạng lặn RFLP ứng dụng có hiệu nghiên cứu biến dị di truyền, phân tích liên kết, chọn giống, lập đồ phân tử Mặc dù có nhiều ưu điểm ứng dụng thị RFLP lại tốn kinh tế thời gian Phương pháp cần sử dụng lượng lớn ADN nên đòi hỏi thành thạo kỹ thuật điều kiện phịng thí ngiệm đặc biệt 1.1.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử dựa sở phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) Phản ứng PCR Mullis cộng đưa năm 1986 Đây phản ứng tổng hợp ADN invitro nhờ ADN polymerase vi khuNn với mồi đặc trưng điểm xuất phát cho nhân lên ADN khn Q trình tổng hợp diễn máy điều chỉnh nhiệt, quy trình chạy PCR gồm 25 – 40 chu kỳ Sản phNm ADN đặc trưng nhân lên theo cấp số nhân với cơng thức tính: N = (2n – 2n) x Trong đó: n: số chu kỳ chạy phản ứng 2n: số phân tử có chiều dài không xác định x: số phân tử khuôn ban đầu N: số sợi tổng hợp phản ứng 2n: số phân tử có chiều dài khoảng cách mồi [3] Kỹ thuật sinh học phân tử dựa sở đoạn nucleotide với kỹ thuật PCR để phát locus đơn gen đa gen hệ gen sinh vật, địi hỏi khơng địi hỏi khơng trình tự, khác mức độ tin cậy, mức độ khó khăn chi phí, chất đa hình mà chúng phát Kỹ thuật sinh học phân tử cho phép nghiên cứu biến đổi vật liệu di truyền thể sống mức ADN Biến đổi di truyền nghiên cứu trực tiếp mức độ ADN phát lượng lớn đa hình tạo đột biến, làm cho chúng phong phú so với thị hình thái Để phân biệt xuất xứ khác nhau, dùng nhiều phương pháp Một phương pháp đem lại hiệu cao, xác, rút ngắn thời gian cơng sức dùng thị phân tử để nghiên cứu đa dạng di truyền cho phép hiểu biết thành phần gen cá thể loài loài khác làm sở cho việc xác định xuất xứ [1, 4] Sự đời PCR làm thay đổi lớn sinh học phân tử, đánh dấu đời hàng loạt thị phân tử: RAPD, AFLP, SSR 1.1.2.1 Đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism – AFLP) AFLP phát triển Zabeau Vos (1993) [30] mô tả chi tiết Vos cộng (1995) [28] AFLP kỹ thuật di truyền dựa sở PCR, AFLP phối hợp tin cậy RFLP thuận lợi kỹ thuật PCR Kỹ thuật gồm ba bước: (1) : Cắt ADN hệ gen enzym giới hạn gắn đoạn oligonucleotide tiếp hợp (adapter) (2) : Nhân cách chọn lọc đoạn giới hạn (3) : Phân tích gel đoạn ADN nhân lên Đây kỹ thuật có nhiều ưu điểm nghiên cứu đa dạng di truyền nhiều đối tượng khác nhau: đậu tương [24], lập đồ hệ gen định vị gen, phát triển thị chuNn khoai tây [8], lúa mỳ, xác định gen kháng virus đậu tương [28], khoai tây [11], lạc [13] AFLP kỹ thuật có độ nhạy cao để phát đa hình tồn hệ gen AFLP cho phép phân tích nhanh, ổn định, đáng tin cậy, có khả ứng dụng lập đồ hệ gen chọn giống có trợ giúp thị [10, 21] Tuy nhiên, phân tích AFLP trước có giá thành cao, địi hỏi có kỹ thuật phịng thí nghiệm thành thạo AFLP thường dùng đồng vị phóng xạ để phát đoạn ADN nhân lên phản ứng PCR, song điều khắc phục sử dụng kỹ thuật nhuộm huỳnh quang nhuộm bạc thay cho việc sử dụng đồng vị phóng xạ Sự thay giúp cho giá thành sử dụng kỹ thuật giảm nhiều, khơng địi hỏi thiết bị q đắt, thao tác kỹ thuật đơn giản mà đảm bảo độ nhạy tính xác kết Với việc thay nhuộm huỳnh quang nhuộm bạc AFLP trở thành kỹ thuật sử dụng phổ biến nghiên cứu di truyền lập đồ liên kết phân tử 1.1.2.2 Trình tự vị trí đánh dấu (STS - Sequence Tagged Sites) STS tạo Olson cộng (1989) dựa vào loại locus biết (gen, cADN, gen tách dòng) nhân lên mồi PCR thiết kế dựa vào trình tự đầu cuối locus đặc trưng Dựa sở PCR phát điểm có trình tự xác định, khơng địi hỏi phân lập địi hỏi trình tự Mồi có 18 – 20bp thiết kế để nhân đoạn ADN ngắn, ADN biết trình tự (có thể trình tự sản phNm PCR với thị RAPD RFLP) đa hình nói chung xác định khác kích thước sản phNm PCR gel agarose EST (Expressed Sequence Tag) thị dựa sở PCR với mồi dài 18 – 20 nucleotide thiết kế từ phần trình tự biết hệ gen đoạn cADN, khơng địi hỏi phân lập địi hỏi trình tự phát vùng biểu hệ gen nên thích hợp lập đồ Sự đa hình nói chung phát khác kích thước sản phNm PCR Tuy nhiên việc thiết kế chuNn hố mồi đòi hỏi đầu tư đáng kể Một thị khác STS dựa kỹ thuật RAPD SCARs (Sequence Characterised Amplified Regions) Các thị dựa việc tách dịng đọc trình tự đoạn RAPD quan tâm (có thể chúng liên kết với gen quan tâm), từ trình tự biết thiết kế mồi dài mồi thường dùng RAPD (24 nucleotide) bổ sung xác với trình tự đầu cuối đoạn RAPD ban đầu Khi mồi dùng PCR, locus đơn xác định tương ứng với đoạn ADN ban đầu locus SCARs tiến RAPD kết có khả lặp lại (dùng mồi dài hơn) thị đồng trội Chỉ thị CAPS hay "Cleaved Amplified Polymorphic Sequences" [15] ví dụ STS, tạo cách cắt sản phNm PCR với enzym hạn chế Chỉ thị ADN mang ưu điểm PCR cần lượng nhỏ nanogram (ng) ADN phát dễ dàng nhờ kết huỳnh quang Các mồi PCR dài (15 – 25 nucleotide) dùng cho CAPS có xu hướng tạo sản phNm ổn định RAPD kỹ thuật mồi ngẫu nhiên khác Tuy nhiên, CAPS có mặt hạn chế cá thể có liên hệ gần gũi thường chứa alen giống Điều gây trở ngại nghiêm trọng việc tạo cặp lai dạng khác 1.1.2.3 Chỉ thị đoạn lặp đơn giản (Simple sequence reapeats – SSR) SSR gọi Microsatillite Litt Luty (1989) [20] phát triển thành kỹ thuật thị phân tử Microsatellite đơn vị lặp lại ngắn – 5bp, chúng xuất phân bố gần tâm động đầu mút NST, có vai trị giữ tính ổn định NST trình phân bào hệ gen tất sinh vật nhân thực [5, 26] Kỹ thuật SSR dựa nguyên lý PCR dùng cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn trình tự SSR Sự khác cấu trúc đơn vị lặp lại dẫn đến thay đổi độ dài đoạn lặp lại nhân lên xác định chạy điện di gel agarose gel polyacrylamide Đa hình độ dài đoạn microsatellite phát lai với ADN gel nhân PCR để tách dịng, đọc trình tự với mồi đoạn oligonucleotide phụ cận Các vị trí microsatellite thị đồng trội chứa đựng thông tin cao Microsatellite thị lập đồ xác định thị chuNn Ở động vật microsatelllite với trình tự CA/GT lặp lại phổ biến nhất, trình tự thấy nhiều thực vật thực vật trình tự lặp lại AT/TA phổ biến nhiều, tiếp trình tự GA/CT Trong hệ gen lúa (GA)n lặp lại 225kb lần (GT)n lặp lại 480kb lần Sự phân tích trình tự lặp lại quan trọng phân tích hệ gen thực vật trình tự lặp lại đặc trưng cho ADN hệ gen cá thể Perry Creengam sử dụng kỹ thuật SSR để phát khác thứ đỗ mà không phân biệt kỹ thuật RADP Hầu hết locus SSR thực vật có đa hình cao thị khác Trong phân tích SSR khơng dùng phóng xạ, sử dụng lượng ADN tốn thời gian kỹ thuật SSR có nhiều ứng dụng việc lập đồ phân tử Kochert sử dụng thị SSR để lập đồ liên kết di truyền lúa [29] Đánh dấu gen quan trọng, sử dụng nghiên cứu vài thực vật bao gồm: Lúa [29] đậu tương [7], kỹ thuật in dấu ADN dùng cho xác định dịng lai từ lồi hoang dại cải biến giống trồng Hạn chế thị SSR tốn tiền công sức việc xây dựng cặp mồi đặc hiệu cho locus đa hình Để xây dựng cặp mồi đặc hiệu cần tách dịng đọc trình tự lượng lớn đoạn ADN hệ gen chứa SSR [16] Tuy nhiên dựa vào ngân hàng gen có thiết kế tổ hợp mồi cho SSR nhiều loài khắc phục phần hạn chế 1.1.2.4 Đa hình đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphism ADN – RAPD) 1.1.2.4.1 Nguyên lý kỹ thuật RAPD Đây kỹ thuật phân tử dựa sở phản ứng PCR Welsh Mc ClellADN, 1990; Williams cộng sự, 1990 đề xuất Kỹ thuật RAPD sử dụng mồi đơn có trình tự nucleotide ngẫu nhiên dài từ – 12 nucleotide mồi thường có 60%(G +C) để đạt liên kết với mẫu đủ mạnh Các mồi ngẫu nhiên ngắn nên khả tìm điểm gắn theo nguyên tắc bổ sung ADN khơng q khó khăn Điện di kết nhân gen thu điện di đồ gồm băng, vạch ADN vị trí giống gel Khi gen mẫu kiểm tra có khác (có đa dạng sinh học) cho kết khác điện di đồ Kết phản ứng RAPD tạo nhiều đoạn ADN khác độ dài trình tự Một mồi ngẫu nhiên cho kết có băng nhân với ADN từ nguồn lại không xuất băng nhân với ADN từ nguồn khác [5, 12] Sản phNm PCR gồm nhiều đoạn ADN có kích thước từ 200bp đến 3kb Sự khác đoạn ADN phát điện di sản phNm PCR gel agarose Sự khác đoạn nói chung đột biến vị trí gắn mồi ngăn trở việc bắt cặp mồi Các đoạn ghi nhận yếu tố di truyền Mendel trội thể lưỡng bội 1.1.2.4.2 Ưu điểm hạn chế kỹ thuật RAPD RAPD phương pháp nhanh để phát đa hình kỹ thuật khơng địi hỏi việc phân lập đọc trình tự, phát nhiều locus lúc Đây kỹ thuật có giá thành thấp, đơn giản, sử dụng lượng nhỏ ADN khn, khơng dùng kỹ thuật lai mẫu dị phóng xạ nên khơng địi hỏi kỹ thuật phức tạp Vì vậy, năm gần phân tích RAPD trở thành phương pháp phổ biến để đánh giá đa dạng di truyền phân loại thực vật, xác định đặc điểm quan trọng nguồn gốc Mỗi mồi cung cấp số liệu từ nhiều vị trí hệ gen đa hình mẫu có quan hệ gần gũi phát nhanh với phân tích locus đơn Tuy vậy, RAPD thị trội nên không phân biệt cá thể đồng hợp dị hợp nên RAPD không sử dụng rộng rãi xây dựng đồ mồi ngắn (10 nucleotide) nên chạy phản ứng PCR chịu nhiều ảnh hưởng yếu tố [6] Mồi ngắn dễ dàng bị ảnh hưởng điều kiện gắn mồi nên kết có hệ số an tồn khơng cao, nhạy cảm cao với điều kiện phản ứng như: chất lượng, nồng độ ADN khuôn; nồng độ dung dịch đệm (đặc biệt Mg2+); nồng độ ADN polymerase; nồng độ nucleotide (dNTP: A, U, G, C) hạn chế kỹ thuật Do thiếu ổn định, kỹ thuật RAPD bị hạn chế sử dụng lập đồ QTL quần thể lai dùng trường hợp lập đồ so sánh Bên cạnh phát sinh đa hình giả ảnh hưởng đến thể đoạn RAPD không chắn đoạn kích thước từ hai mẫu ADN khác có thực tạo từ vị trí hệ gen hay không Tuy nhiên, kỹ thuật với mồi ngẫu nhiên có nhiều ứng dụng thí nghiệm đòi hỏi số lượng lớn để kiểm tra độ tin cậy nên kỹ thuật RAPD lựa chọn thích hợp cho cơng tác đánh giá đa dạng di truyền 1.1.2.4.3 Ứng dụng kỹ thuật RAPD RAPD thường dùng nghiên cứu phát sinh loài dùng phân tích phân ly dịng gần đồng gen (near isogenic lines - NIL) [22], RAPD dùng nhiều xác định trạng thái khác nhau, xác định quan hệ di truyền nghiên cứu đa dạng di truyền nhiều loài lúa, đậu tương, lúa mạch đen, kiều mạch, đậu Hà Lan, hoa hồng [23, 18, 24, 25] Cùng với RFLP SSR, RAPD dùng để xây dựng đồ liên 10 ngang, mẫu có băng vạch đánh số mẫu khơng có băng vạch đánh số Tiến hành làm vạch cuối gel Mồi PC09 có tổng cộng phân đoạn ADN xuất với kích thước khác nhau, có xuất phân đoạn đơn hình vị trí marker 0,6 kb; cịn lại phân đoạn đa hình chiếm 85,7% tổng số phân đoạn ADN Sử dụng đoạn mồi PC09 phân tích với 15 mẫu Song mật cho tổng số băng ADN xuất 61 với 46 băng đa hình cịn lại 15 băng đơn hình Vậy số băng đa hình chiếm 75,4% tổng số băng xuất Với phân tích ta có: Bảng 3.2 Bảng số liệu mã hóa băng vạch ADN mồi PC 09 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 Phân tích tương tự sản phNm PCR – RAPD mồi PC14, PC16, PC20 (hình 3.3; 3.4; 3.5) 16 mồi cịn lại Trong 20 đoạn mồi phân tích, kết đoạn mồi: PC04, PC07, PC15 không xuất băng ADN Điều cho thấy mồi PC04, PC07, PC15 khơng phù hợp để phân tích Song mật 30 2,0 kb 1,6 kb 1,0 kb 0,5 kb Hình 3.3 Sản ph m PCR – RAPD với mồi PC 14; M: Marker 1Kb; S1 – S15: mẫu Song mật (theo Bảng 2.1) 2,0 kb 1,6 kb 1,0 kb 0,5 kb Hình 3.4 Sản ph m PCR – RAPD với mồi PC 16; M: Marker 1Kb; S1 – S15: mẫu Song mật (theo Bảng 2.1) 31 2,0 kb 1,6 kb 1,0 kb 0,5 kb Hình 3.5 Sản ph m PCR – RAPD với mồi PC 20; M: Marker 1Kb; S1 – S15: mẫu Song mật (theo Bảng 2.1) Phân tích kết mồi PC14; PC16; PC20 cho thấy kích thước băng ADN tập trung khoảng 0,5 – 1,6kb; mồi PC14 PC20 dễ gây nhầm lẫn cho công đoạn mã hóa số liệu băng ADN sau điện di có vị trí gần Ở PC14, PC16 mẫu S2, S3, S4, S5 có xuất xứ Hịa Bình cho tính tương đồng di truyền cao băng vạch xuất tương đối đồng đều, riêng có S1 mồi PC16 cho số băng vạch Với xuất xứ khác tính tương đồng di truyền cao, đặc biệt mồi PC16 PC20 S13, S14, S15 tương ứng với xuất xứ Hà Giang 3; Bắc Giang 1; Bắc Giang 2, băng vạch xuất với tỷ lệ tương đồng lên đến 95% Số phân đoạn đa hình PC14 11 tổng số 12 phân đoạn ADN xuất chiếm tỷ lệ đa hình mồi lên đến 91,6%, với tổng số băng 76 số băng đa hình 61 chiếm 80,3% Với PC16 tỷ lệ đa hình chiếm 90% với tổng số phân đoạn ADN xuất 10, mồi PC16 có số băng ADN đa hình 99 băng Độ tương đồng mẫu S2; S3; S4; S5; S13; S14; S15 tương ứng với xuất xứ Hịa Bình (2; 2’; 3; 4), Bắc Giang (1; 2), Hà 32 Giang mồi PC16 lên đến 100% Từ phân tích đưa kết luận sớm mẫu vừa nêu có tính đa dạng di truyền thấp Ngồi ra, mồi PC03; PC12 có cho xuất băng vạch không mang lại kết đa mong đợi Từ kết thu sau điện di sản phNm PCR – RAPD, số liệu tổng hợp trình bày bảng 3.3; 3.4 dùng làm sở để phân tích tính đa dạng di truyền 15 mẫu Song mật thu thập từ tỉnh phía Bắc Bảng 3.3 Số phân đoạn ADN xuất số phân đoạn ADN đa hình với mồi Số phân đoạn Tỷ lệ %phân đoạn ADN đa hình ADN đa hình Mồi Tổng số phân đoạn ADN PC01 60,00 PC02 33,33 PC03 0,00 PC05 10 60,00 PC06 71,43 PC08 50,00 PC09 85,71 PC10 4 100,00 PC11 80,00 PC12 0,00 PC13 50,00 PC14 12 11 91,67 PC16 10 90,00 PC17 80,00 PC18 71,43 PC19 60,00 PC20 9 100,00 Tổng 98 73 Trung bình 5,7 4,3 33 63,74 S2 5 1 10 5 72 5 1 4 3 66 PC01 PC02 PC03 PC05 PC06 PC08 PC09 PC10 PC11 PC12 PC13 PC14 PC16 PC17 PC18 PC19 PC20 Tổng số Mồi S1 Mẫu 71 3 10 1 4 S3 57 10 2 3 S4 72 4 10 5 S5 67 5 4 2 10 S6 43 2 1 2 4 S7 70 5 4 S8 34 63 4 2 S9 65 5 1 3 S10 57 1 2 S11 46 1 1 2 S12 Bảng 3.4 Tổng số băng ADN nhân phân tích với 17 đoạn mồi ngẫu nhiên 71 10 1 S13 66 10 1 4 S14 58 2 10 1 4 S15 944 64 59 53 53 114 76 20 15 40 34 61 45 81 97 30 43 59 Tổng số Với 17 đoạn mồi sau chạy phản ứng PCR – RAPD xuất tổng số 944 băng ADN nhân ngẫu nhiên 15 mẫu Song mật gồm hai loại: loại đơn gồm băng có mặt tất mẫu loại đa hình có mẫu mà khơng có mẫu khác Trong đó, số băng đơn hình 375 chiếm 39,7% cịn số băng đa hình 569 chiếm 60,3% Số băng ADN đoạn mồi dao động từ (PC12) đến 10 (PC16) Trong tổng số 98 phân đoạn xuất với 17 đoạn mồi (bảng 3.3) có 73 phân đoạn đa hình chiếm 74,49% tính trung bình phần trăm băng đa hình chiếm 63,74% Dù số chứng tỏ 15 mẫu Song mật nghiên cứu có khác biệt hệ gen Trong 17 đoạn mồi sử dụng cho kết PCR – RAPD có đoạn mồi cho tỷ lệ đa hình 100% (PC10; PC20) mồi cho tỷ lệ đa hình ≥ 80% (PC09; PC11; PC14; PC16; PC17) mồi cho tỷ lệ đa hình ≥ 50% (PC01; PC05; PC06; PC08; PC13; PC18; PC19) mồi cho tỷ lệ đa hình ≥ 30% (PC02) mồi khơng cho đa hình (PC03; PC12) Đặc biệt mồi PC09; PC20; PC14; PC16 cho thấy tính đa hình dịng nghiên cứu rõ rệt (hình 3.2; 3.3; 3.4; 3.5) Trong số 15 dòng Song mật nghiên cứu dựa vào hình ảnh thu sau chụp gel sản phNm PCR – RAPD nhận thấy phân đoạn ADN xuất nhiều kích thước khác so với thang ADN chuNn Kích thước đoạn ADN nhân lên tập trung khoảng 0,5 – 1,5kb Từ kết phân tích cho phép nhận xét dòng Song mật nghiên cứu có đa dạng mặt di truyền 35 Bảng 3.5 Số băng đa hình mẫu, xuất xứ Song mật TT Tên mẫu Tổng số băng ADN Tổng số băng ADN đa hình Tỷ lệ % băng ADN đa hình S1 66 38 57.58 S2 72 44 61,11 S3 71 43 60,56 S4 57 29 50,88 S5 72 44 61,11 S6 67 39 58,21 S7 43 15 34,88 Tổng HB 448 252 TBHB 64 36 54,9 S8 70 42 60,00 S9 63 35 55,56 10 S10 65 37 56,92 Tổng TQ 198 114 TBTQ 66 38 57,49 11 S11 57 29 50,88 12 S12 46 18 39,13 13 S13 71 43 60,56 Tổng HG 174 90 TBHG 58 30 50,19 14 S14 66 38 57,58 15 S15 58 30 51,72 Tổng BG 124 68 TBBG 62 34 36 54,65 Bảng 3.5 cho biết số vị trí mồi RAPD gắn ADN hệ gen mẫu Song mật Mẫu có nhiều số băng đa hình mẫu có khác biệt thành phần kiểu gen hệ gen so với hệ gen mẫu khác Các mẫu Song mật có tỷ lệ băng đa hình trung bình 54,31% xuất xứ có tỷ lệ băng đa hình dao động từ 50,19 – 57,49%, chứng tỏ xuất xứ có tương đồng di truyền Tỷ lệ phần trăm băng ADN đa hình xuất xứ dao động khoảng giá trị nhỏ nên chúng có tính ổn định cao, đặc biệt xuất xứ Tuyên Quang, Hòa Bình (trừ mẫu S7 – Hịa Bình 6) Sự ổn định mặt di truyền xuất xứ giúp cho công tác chọn giống chọn giống Song mật có chất lượng ổn định, phục vụ cho trồng rừng sản xuất nhân tố định giá trị kinh tế lâm sản Sự đa dạng thành phần kiểu gen mẫu Song mật có quan hệ với hay khơng, mẫu có xuất xứ hay khơng cần phân tích mối quan hệ di truyền mẫu phần mềm NTSYSpc version 2.02h (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) để có kết luận xác 3.3 Kết phân tích mối quan hệ di truyền 15 mẫu Song mật Các phân đoạn ADN mã hóa trước đưa vào xử lý phần mềm, chúng phân tích mối quan hệ di truyền dựa hệ số tương đồng di truyền Jaccard thông qua phần mềm NTSYSpc version 2.02h Hệ số tương đồng di truyền Jaccard cho ta biết mối tương quan mặt di truyền mẫu phân tích Trị số Jaccard tiến số mức độ di truyền mẫu thấp ngược lại, tiến số mức độ tương đồng di truyền cao, tính đa dạng di truyền thấp Số liệu xử lý cho kết hệ số tương đồng di truyền (bảng 3.6) mối quan hệ di truyền mẫu thể biểu đồ di truyền (hình 3.6) 37 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 38 S15 0,6327 0,7347 0,7245 0,7245 0,6939 0,5816 0,7857 0,6327 0,7245 0,7041 0,7857 0,7755 0,7857 0,8571 1,0000 S14 0,6939 0,7755 0,7857 0,6633 0,7347 0,6224 0,7041 0,6939 0,6837 0,7245 0,7449 0,6939 0,8878 1,0000 S13 0,6429 0,7245 0,7347 0,6735 0,7653 0,6735 0,6327 0,6633 0,6939 0,7347 0,7347 0,6837 1,0000 S12 0,6122 0,6531 0,6429 0,7449 0,6531 0,6429 0,8265 0,5918 0,7245 0,7041 0,8673 1,0000 S11 0,6837 0,7245 0,7143 0,6735 0,6837 0,6327 0,7347 0,7041 0,7755 0,7959 1,0000 S10 0,7245 0,7245 0,7551 0,6531 0,7041 0,7755 0,6735 0,8061 0,8367 1,0000 S9 0,7245 0,7449 0,7347 0,6735 0,7653 0,7755 0,7347 0,8265 1,0000 S8 0,7755 0,6939 0,7041 0,6020 0,7347 0,7245 0,6429 1,0000 S7 0,6429 0,6633 0,6735 0,7143 0,6837 0,6735 1,0000 S6 0,7041 0,6429 0,6327 0,6735 0,7857 1,0000 S5 0,7347 0,7959 0,8061 0,7653 1,0000 S4 0,6837 0,7245 0,7143 1,0000 S3 0,8265 0,9694 1,0000 S2 0,8163 1,0000 S1 1,0000 S1 Bảng 3.6 Bảng hệ số tương đồng di truyền 15 mẫu Song mật 39 Hình 3.6 Biểu đồ hình biểu diễn mối quan hệ di truyền 15 mẫu Song mật Qua số liệu (bảng 3.6) mẫu nghiên cứu có hệ số đồng dạng di truyền Jaccard nằm khoảng 0,5816 – 0,9694 Giá trị 0,5816 hệ số tương đồng di truyền hai mẫu S6 S15 (Hịa Bình – Bắc Giang 2); hệ số tương đồng di truyền hai mẫu S2 – S3 0,9694 Theo tài liệu điều tra, thu thập mẫu cán điều tra cung cấp hai mẫu lấy vị trí Với kết phân tích hệ số tương đồng di truyền khẳng định S2 S3 có khoảng cách di truyền gần Kết phân tích số liệu cho thấy 15 mẫu Song mật nghiên cứu với xuất xứ tại: Hịa Bình, Hà Giang, Tuyên Quang, Bắc Giang có đa dạng di truyền Có nhiều ngun nhân tạo tính đa dạng di truyền này, qua ta đưa kết luận xác mối quan hệ di truyền dịng nghiên cứu Biểu đồ (hình 3.6) mức độ sai khác mẫu Song mật mặt di tryền Mức độ sai khác biểu hệ số sai khác mẫu, mẫu có hệ số tương đồng di truyền cao xếp vào nhóm Giữa nhóm lại có liên hệ với hệ số tương đồng di truyền Phân tích sai khác hệ số di truyền 15 mẫu Song mật biểu đồ hình di truyền; di truyền tạo thành từ hai nhánh chính: Nhánh gồm: S1, S2, S3, S5, S6, S8, S9, S10 phân thành hai phân nhánh: - Phân nhánh có S1, S2, S3 xuất xứ Hịa Bình Trong S2, S3 tạo thành nhánh với hệ số tương đồng di truyền 0,9694 Hệ số tương đồng di truyền [S1, S2] 0,8163 [S1, S3] 0,8265 - Phân nhánh phân thành phân nhánh phụ: + Phân nhánh phụ có S5, S6 với hệ số tương đồng di truyền 0,7857 40 + Phân nhóm phụ gồm: S8, S9, S10 với xuất xứ Tuyên Quang Trong đó, S9 – S10 lập thành nhánh nhỏ với hệ số tương đồng di truyền lên tới 0,8367 (≈ 83,7%) hệ số di truyền [S8, S9]; [S8, S10] là: 0,8265; 0,8061 Nhánh hai có: S4, S7, S11, S12, S13, S14, S15 có xuất xứ Hịa Bình, Hà Giang, Bắc Giang nhánh hai chia làm phân nhánh Trong đó: - Phân nhánh có S4 với xuất xứ Hịa Bình có hệ số tương đồng di truyền với phân nhánh xung quanh giá trị 0,7 - Phân nhánh tạo phân nhánh phụ + Phân nhánh phụ 1: S7 tương quan với nhánh [S11, S12] với hệ số tương đồng di truyền: [S7, S11] 0,7347; [S7, S12] 0,8265 [S11, S12] 0,8673 + Phân nhánh phụ 2: S13, S14 khác xuất xứ tạo thành nhánh nhỏ với hệ số tương đồng di truyền 0,8878 Hệ số tương đồng di truyền [S13, S15] 0,7857 S14, S15 có xuất xứ Bắc Giang với hệ số tương đồng di truyền 0,8571 cho thấy ổn định mặt di truyền Song mật có xuất xứ Bắc Giang cao Qua việc phân tích di truyền xây dựng sở giá trị tương ứng bảng hệ số tương đồng di truyền Mẫu Song mật xuất xứ Hịa Bình (1, 2, 2’); Hịa Bình (4, 5); Tun Quang (1, 2, 3); Hà Giang (1, 2) tạo thành nhánh nhỏ với hệ số tương đồng di truyền đặc trưng riêng xuất xứ, mẫu nghiên cứu Điều khẳng định mẫu xuất xứ vừa nêu khơng có đa dạng thành phần kiểu gen Với Hịa Bình (3, 6); Hà Giang 3; Bắc Giang (1, 2) nằm rải rác phân nhánh hai, phân tích cho thấy tính đa dạng di truyền xuất xứ chúng hay đa dạng thành phần kiểu gen mẫu xuất xứ 41 Xuất xứ Hịa Bình có mặt phân nhánh phân nhánh phụ di truyền nên mẫu Song mật xuất xứ từ Hịa Bình có tính đa dạng di truyền cao Tương tự với tính đa dạng xuất xứ Hà Giang Bắc Giang Nghiên cứu tính đa dạng di truyền 15 mẫu Song mật trội thu thập từ tỉnh phía Bắc cho thấy đa dạng di truyền mẫu xuất xứ có Hịa Bình, Hà Giang, Bắc Giang xuất xứ Tuyên Quang cho tương đồng di truyền cao Kết nghiên cứu tính đa hình ADN Song mật từ 15 mẫu thu thập tỉnh phía Bắc cho thấy chúng có sai khác cấp độ phân tử 42 KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHN Kết luận Từ kết nghiên cứu, đề tài tới số kết luận sau: Đã tách ADN tổng số 15 mẫu Song mật thu thập từ tỉnh phía Bắc với chất lượng cao phục vụ đề tài nghiên cứu bảo quản phòng thí nghiệm điều kiện -20oC để sử dụng cho nghiên cứu Các mồi chạy phản ứng PCR – RAPD cho số băng đa hình cao PC10; PC20; PC09; PC11; PC14; PC16; PC17; cho tỷ lệ đa hình ≥ 80% Đây đoạn mồi RAPD có ý nghĩa cao phân tích, nghiên cứu đa dạng di truyền cho loài Song mật Trong số 20 đoạn mồi chạy phản ứng RAPD có mồi PC04; PC07; PC15 đoạn mồi không cho kết Ngoài ra, đoạn mồi PC02; PC12 cho kết băng vạch đơn hình Qua phân tích hệ gen 15 mẫu Song mật với 17 đoạn mồi ngẫu nhiên, nhận 98 phân đoạn ADN có 73 phân đoạn đa hình chiếm 74,49% Điều cho thấy 15 mẫu Song mật nghiên cứu có khác mặt di truyền, mức sai khác từ 3,04% (1 – 0,9694) đến 41,84% (1 – 0,5816) Tồn Do thời gian thực tập tốt nghiệp ngắn phạm vi nghiên cứu một khóa luận tốt nghiệp nên tồn số vấn đề: Số mẫu nghiên cứu có hạn kết phân tích chưa làm rõ tính đa dạng di truyền xuất xứ với cá thể có xuất xứ Khóa luận chưa sử dụng nhiều phương pháp thị phân tử để phân tích đa dạng di truyền 43 Kiến nghị Nghiên cứu, phân tích mẫu lấy kết phân tích tính đa dạng di truyền cho xuất xứ, đối tượng thu thập Đánh giá mối tương quan mẫu xuất xứ hay hai xuất xứ với để có kết luận xác tính đa dạng di truyền Song mật địa phương hay nhiều địa phương với Để đảm bảo tính khách quan, tăng thêm giá trị, độ xác tính khoa học cho đề tài tơi xin đề xuất việc sử dụng thêm loại thị phân tử để phân tích đa dạng di truyền Song mật, từ có kết luận tốt cho mối quan hệ dòng nghiên cứu giúp cho trình chọn giống trở nên dễ dàng hiệu 44 ... đa tính đa dạng di truyền Song mật để phục vụ công tác chọn giống Việt Nam cịn bỏ ngỏ Vì vậy, tơi thực đề tài: ? ?Nghiên cứu tính đa dạng di truyền số dòng Song mật thu thập từ tỉnh phía Bắc sử dụng. .. có tính đa dạng di truyền cao Tương tự với tính đa dạng xuất xứ Hà Giang Bắc Giang Nghiên cứu tính đa dạng di truyền 15 mẫu Song mật trội thu thập từ tỉnh phía Bắc cho thấy đa dạng di truyền mẫu... phân tích tính đa dạng di truyền 15 mẫu Song mật thu thập từ tỉnh phía Bắc Bảng 3.3 Số phân đoạn ADN xuất số phân đoạn ADN đa hình với mồi Số phân đoạn Tỷ lệ %phân đoạn ADN đa hình ADN đa hình