ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NÔI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM DỖN LÂN NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BỊ NI TẠI TỈNH HÀ GIANG VÀ BÒ HOANG DÃ Ở VIỆT NAM BẰNG CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN PHÂN TỬ Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS LÊ ĐÌNH LƯƠNG TS Jean-Charles MAILLARD HÀ NỘI - 2010 i MỤC LỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐA DẠNG DI TRUYỀN 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Tầm quan trọng đa dạng di truyền 1.1.3 Bảo tồn đa dạng di truyền 1.2 PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN 1.3 KỸ THUẬT MICROSATELLITE 10 1.3.1 Giới thiệu 10 1.3.2 Sự phân bố microsatellite thể sinh vật 11 1.3.3 Phân loại microsatellite dạng trình tự microsatellite .12 1.3.4 Vai trò microsatellite 13 1.3.5 Phƣơng pháp xác định microsatellite 14 1.4 KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ADN HỆ GEN TY THỂ (mtDNA) 16 1.5 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BÕ NUÔI 18 1.5.1 Sự phân loại bị ni 18 1.5.2 Nguồn gốc hố bị ni 21 1.5.3 Sự đa dạng phân bố bị ni ngày 22 1.6 ĐẶC ĐIỂM QUẦN THỂ BÕ NUÔI Ở TỈNH HÀ GIANG 23 1.6.1 Điều kiện địa lý, xã hội tỉnh Hà Giang 23 1.6.2 Đặc điểm quần thể bị ni tỉnh Hà Giang 24 1.7 NHỮNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BÕ NUÔI TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 25 1.7.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền bị ni giới 25 1.7.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền vật ni nói chung bị nói riêng Việt Nam 28 1.8 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BÕ TÓT (BOS GAURUS) VÀ BÕ RỪNG (BOS JAVANICUS) 29 1.8.2 Đặc điểm phân bố bị tót (Bos gaurus) 30 1.8.3 Hiện trạng phân bố bị tót Việt Nam 32 1.8.4 Đặc điểm phân bố bò rừng (Bos javanucus) 35 1.8.5 Hiện trạng phân bố bò rừng Việt Nam 36 1.9 NHỮNG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN Ở BÕ TÓT VÀ BÕ RỪNG .39 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 41 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu quần thể bị ni Hà Giang 41 2.2.1.1 Thu thập mẫu 41 2.2.1.2 Tách chiết ADN 41 2.2.1.3 Phƣơng pháp phân tích đa dạng di truyền hệ gen nhân .42 iv 2.2.1.4 Phƣơng pháp phân tích đa dạng di truyền hệ gen ty thể 45 2.2.1.5 Phƣơng pháp phân tích thống kê 46 2.2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu quần thể bò hoang dã 50 2.2.2.1 Thu thập mẫu 50 2.2.2.2 Tách chiết ADN từ mẫu phân 51 2.2.2.3 Xác định ảnh hƣởng số yếu tố bảo quản mẫu phân đến kết tách chiết ADN 52 2.2.2.4 Xác định loài giới tính 53 2.2.2.5 Phân tích đa dạng di truyền 54 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56 ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ BÕ NUÔI TẠI HÀ GIANG 56 3.1.1 Tính đa dạng kiểu hình 56 3.1.1.1 Đa dạng màu sắc lông 56 3.1.1.2 Đa dạng hình dáng sừng 56 3.1.2 Tính đa dạng di truyền 57 3.1.2.1 Kết phân tích kích thƣớc alen locút microsatellites 57 3.1.2.2 Tính đa hình locút microsatellites 61 3.1.2.3 Tính đa dạng di truyền cân Hardy-Weinberg 61 3.1.2.4 Tính đa dạng sai khác di truyền quần thể bò phân bố huyện 66 3.1.2.5 Mối tƣơng quan khoảng cách di truyền khoảng cách địa lý 70 3.1.2.6 Đặc điểm cấu trúc di truyền quần thể bị ni Hà Giang 71 3.1.2.7 Tính đa dạng di truyền hệ gen ty thể 75 3.1.2.8 Mối quan hệ di truyền bò Hà Giang với số quần thể bò khác 77 3.2 ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ BÕ TÓT VÀ BÕ RỪNG 81 3.2.1 Kết tách chiết ADN 81 3.2.2 Ảnh hƣởng mốt sô yếu tố bảo quản mẫu đến kết tách ADN 85 3.2.2.1 Ảnh hƣởng thời gian bảo quản mẫu phân 85 3.2.2.2 Ảnh hƣởng dung dịch bảo quản đến kết tách chiết ADN 86 3.2.2.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ bảo quản mẫu phân 87 3.2.3 Kết xác định loài 87 3.2.4 Kết xác định giới tính 92 3.2.5 Đa dạng di truyền quần thể bị tót 93 3.2.6 Đa dạng di truyền quần thể bò rừng 100 KẾT LUẬN 1045 ĐỀ NGHỊ 106 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 107 TÀI LIỆU THAM KHẢO 108 v MỞ ĐẦU Đánh giá tính đa dạng đặc điểm di truyền quần thể, giống vật nuôi động vật hoang dã mức độ phân tử coi công việc mở đầu cần thiết chương trình bảo tồn [88] Chính vậy, từ năm 1990 tổ chức Nông lương giới (FAO) xây dựng chương trình tổng thể sử dụng kỹ thuật di truyền phân tử để đánh giá đa dạng di truyền thân quần thể quần thể vật nuôi nhằm định hướng cho việc quản lý, bảo tồn sử dụng nguồn gen động vật nuôi toàn cầu Trong năm gần đây, phương pháp sinh học phân tử đóng vai trị quan trọng nghiên cứu di truyền quần thể đa dạng di truyền Nhiều kỹ thuật di truyền phân tử sử dụng nghiên cứu đa dạng di truyền như: RFLP, RAPD, minisatellites, microsatellites phân tích đa hình hệ gen ty thể Trong đó, kỹ thuật microsatellite phân tích trình tự hệ gen ty thể nhanh chóng trở thành kỹ thuật hữu hiệu sử dụng rộng rãi nghiên cứu di truyền quần thể nhiều loài vật nuôi hoang dã khác Việt Nam quốc gia có đa dạng tài nguyên thiên nhiên sinh vật cao Tuy nhiên, tính đa dạng hệ động vật Việt Nam, đặc biệt số quần thể vật nuôi địa khu vực miền núi quần thể động vật hoang dã có giá trị sinh học di sản bị đe doạ kinh tế thị trường phát triển khai thác, sử dụng mức người Bị ni Hà Giang giống vật ni địa hố, chọn lọc, ni dưỡng từ lâu đời người H’mơng chúng đáp ứng tốt với điều kiện khí hậu khơ rét vùng cao có giá trị văn hố đồng thời mang tính đặc hữu tỉnh Hà Giang Tuy nhiên, hệ thống chăn nuôi thâm canh, nhập giống ngoại có suất cao đầu tư lớn dẫn đến nguy giống bò Bên cạnh đó, hai lồi bị hoang dã bị tót (Bos gaurus) bị rừng (Bos javanicus), ngồi giá trị sinh học nội giá trị di sản quốc gia nguồn gen quý cần bảo tồn Nhưng nạn săn bắt trái phép, phá huỷ môi trường sống dịch bệnh dẫn đến tình trạng suy giảm nhanh lồi bị hoang dã Số lượng bị tót nước giảm xuống mức thấp, cịn khoảng 300 cá thể Trong đó, số lượng bò rừng khoảng 100 cá thể Hiện nay, hai lồi bị hoang đứng bên bờ tuyệt chủng chúng chịu chung số phận với lồi bị xám (Bos sauveli), ngày bị coi tuyệt chủng Việt Nam Hiện tại, bị H’mơng ni Hà Giang hai lồi bị tót bị rừng hoang dã đối tượng bảo tồn đặc biệt chương trình dự án bảo tồn cấp Quốc gia Vì vậy, thông tin trạng di truyền quần thể bò cần thiết quan trọng để hoạch định chiến lược bảo tồn bền vững Xuất phát từ ý nghĩa thực tế trên, chúng tơi tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu tính đa dạng di truyền bị ni tỉnh Hà Giang bò hoang dã Việt Nam kỹ thuật di truyền phân tử” Mục đích đề tài Xác định tính đa dạng di truyền cấu trúc di truyền bị ni tỉnh Hà Giang mức độ phân tử làm sở cho việc hoạch định kế hoạch chọn lọc, lai tạo, phát triển bảo tồn lâu dài Sử dụng công cụ phân tử để xác định tính đa dạng di truyền quần thể bị tót bị rừng hoang dã tồn số khu vực Việt Nam từ mẫu phân sinh học nhằm phục vụ cho việc xây dựng hoạt động bảo tồn phù hợp Nội dung nghiên cứu đề tài Sử dụng kỹ thuật microsatellite phân tích tính đa dạng di truyền cấu trúc di truyền quần thể bị ni tỉnh Hà Giang Phân tích tính đa dạng di truyền hệ gen ty thể bị ni Hà Giang sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự ADN vùng D-loop Chuẩn hoá phương pháp tách chiết ADN từ mẫu phân sinh học mẫu bị hoang dã Xác định lồi giới tính từ mẫu phân Xác định tính đa dạng di truyền hệ gen ty thể quần thể bị tót bị rừng sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự ADN vùng D-loop Ý nghĩa khoa học đề tài Đây nghiên cứu sử dụng kỹ thuật di truyền phân tử để đánh giá tính đa dạng cấu trúc di truyền bị ni bị hoang dã phục vụ cho mục đích bảo tồn thực Việt Nam Lần ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để tiến hành nghiên cứu di truyền quần thể bị tót bò rừng từ mẫu sinh học thu thập cách gián tiếp không gây ảnh hưởng tới vật mẫu phân, lông Ý nghĩa thực tiễn đề tài Kết nghiên cứu đề tài cung cấp thông tin cần thiết đặc điểm di truyền mức độ phân tử, góp phần làm sở khoa học cho việc xây dựng kế hoạch bảo tồn quần thể bị ni Hà Giang hai lồi bị hoang dã bị tót bị rừng Việt Nam TĨM TẮT Luận án cơng trình nghiên cứu Việt Nam sử dụng kỹ thuật di truyền phân tử đánh giá tính đa dạng di truyền cấu trúc di truyền bị ni Hà Giang hai quần thể bị hoang dã (tót bị rừng) có Việt Nam Kết phân tích tính đa dạng di truyền bị ni Hà Giang cho thấy tính đa dạng di truyền cao hệ gen nhân hệ gen ty thể Đã xác định 205 alen 23 locút microsatellite, trung bình số alen locút 8,9, tần số dị hợp tử quan sát lý thuyết tương ứng 0,67 0,73 Giá trị thơng tin đa hình (PIC) locút microsatellite nằm khoảng từ 0,50 đến 0,84 Sự sai khác di truyền bị ni huyện nhỏ với giá trị FST = 0,013 Quần thể bị ni Hà Giang khơng trạng thái cân di truyền HardyWeinberg cấu trúc di truyền tồn nhóm bị (quần thể phụ) khác di truyền phân bố vùng núi đá (Đồng Văn, Mèo Vạc) vùng núi đất (Hồng Su Phì, Sín Mần) Ngồi ra, qua kết phân tích đa dạng di truyền hệ gen ty thể cho thấy quần thể bị ni Hà Giang có nguồn gốc từ lai tạp hai loài phụ Bos indicus Bos taurus Lần Việt Nam thành công việc tách chiết ADN bò hoang dã từ mẫu phân, sử dụng cặp mồi xác định giới tính cặp mồi nhân vùng D-loop ty thể bị ni để xác định giới tính, xác định lồi xác định tính đa dạng di truyền bị tót bị rừng Đã xác định kiểu haplotype hệ gen ty thể quần thể bị tót khu vực Đông Dương bao gồm Việt Nam (2), Campuchia (2) Lào (1) Trong quần thể bị tót Việt Nam xác định kiểu haplotype có khoảng cách di truyền xa Qua cho thấy quần thể bị tót Việt Nam tồn nhóm khác di truyền Đã xác định kiểu haplotype quần thể bò rừng Việt Nam kiểu haplotype quần thể bị rừng Campuchia Khơng có sai khác di truyền đáng kể kiểu haplotype bò rừng Việt Nam bò rừng Campuchia Từ kết có kiểu haplotype hệ gen ty thể xác định cho thấy quần thể bị tót bị rừng Việt Nam có tính đa dạng di truyền thấp 12 Khả ứng dụng thực tiễn: Các kết nghiên cứu luận án góp phần làm sở khoa học cho việc xây dựng kế hoạch chọn lọc, phát triển đồng thời bảo tồn tính đa dạng di truyền bị ni tỉnh Hà Giang Trong cần đặc biệt ý bảo tồn hai nhóm bị khác di truyền phân bố vùng núi đá (Đồng Văn, Mèo Vạc) vùng núi đất (Hồng Su Phì, Sín Mần) Góp phần xây dựng kế hoạch chiến lược bảo tồn quần thể bị tót, bị rừng Việt Nam nước khu vực 13 Những hướng nghiên cứu tiếp theo: Cần tiến hành nghiên cứu so sánh sai khác di truyền bị ni Hà Giang với nhóm bị vàng khác có Việt Nam Cần tiếp tục nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền toàn quần thể bị tót bị rừng ghi nhận tồn tất khu vực Việt Nam 14 Các cơng trình cơng bố có liên quan đến luận án: Phạm Dỗn Lân, Nguyễn Trọng Bình, Trần Xn Hồn, Vũ Chí Cương, Lê Đình Lương J.C Maillard (2008), “Phân tích đa dạng trình tự nucleotide ADN ty thể mối quan hệ di truyền bị H’mơng với số quần thể bị khác”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Chăn ni Số 13, trang 51-57 Taiana Rivière-Dobigny, Lan Pham Doan, Nam Le Quang, Jean- Charles Maillard and Johan Michaux (2008), “Species Identification, Molecular Sexing and Genotyping Using Non-invasive Approaches in Two Wild Bovids Species: Bos gaurus and Bos javanicus” Journal of Zoo Biology 28 (2), pp 127-136 Phạm Doãn Lân, Nguyễn Trọng Bình, Vũ Chí Cương, Jean-Charles Maillard (2008), “Sử dụng kỹ thuật microsatellite để đánh giá tính đa dạng di truyền cấu trúc di truyền quần thể bị ni tỉnh Hà Giang” Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ Số (24), trang 310317 Ngày tháng 12 năm 2009 Nghiên cứu sinh Phạm Doãn Lân ... tiến hành thực đề tài ? ?Nghiên cứu tính đa dạng di truyền bị ni tỉnh Hà Giang bò hoang dã Việt Nam kỹ thuật di truyền phân tử? ?? Mục đích đề tài Xác định tính đa dạng di truyền cấu trúc di truyền. .. 1.7 NHỮNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BÕ NUÔI TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 25 1.7.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền bò nuôi giới 25 1.7.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền. .. cứu Việt Nam sử dụng kỹ thuật di truyền phân tử đánh giá tính đa dạng di truyền cấu trúc di truyền bị ni Hà Giang hai quần thể bị hoang dã (tót bị rừng) có Việt Nam Kết phân tích tính đa dạng di