Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh cây trẩu ba hạt (vernicia montana lour ) qua phôi soma

LỜI CẢM ƠN Khóa luận hồn thành Trung tâm Giống & Công nghệ sinh học – Trường Đại học Lâm nghiệp, khn khổ chương trình đào tạo kỹ sư chun ngành Cơng nghệ sinh học, khố học 2005 – 2009 Trường Đại học Lâm nghiệp Có kết này, trước hết tơi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo toàn thể cán - viên chức trường Đại học Lâm nghiệp khoa Lâm học tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt nhiệm vụ học tập Xin chân thành cảm ơn thầy - cô giáo trực tiếp giảng dạy tơi tồn khố học Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới cô giáo ThS Nguyễn Thị Hồng Gấm tận tâm hướng dẫn, bảo truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình thực khóa luận Nhân dịp này, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình, tận tụy Ban Giám đốc toàn thể cán - viên chức Trung tâm Giống & Công nghệ sinh học, đặc biệt ThS Hồ Văn Giảng, tạo điều kiện đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho khóa luận tơi hồn thiện Cuối xin cảm ơn bạn bè người thân gia đình động viên tạo điều kiện thuận lợi để học tập, nghiên cứu khoa học hồn thiện khóa luận Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2009 Sinh viên Vũ Ngọc Anh ĐẶT VẤN ĐỀ Rừng tài sản quốc gia vô quý giá, rừng không mang lại cho nguồn giá trị lớn mặt kinh tế mà cịn góp phần quan trọng việc ổn định hệ sinh thái, bảo vệ môi trường sống cho người Tuy nhiên, nguồn tài nguyên rừng ngày trở nên cạn kiệt suy thoái nghiêm trọng tình trạng sử dụng cách bừa bãi khơng có ý thức, khơng có hiểu biết người Vấn đề cấp bách đặt cần phải khôi phục lại nguồn tài nguyên rừng biện pháp bảo vệ trồng Nhiệm vụ quan trọng hàng đầu phục vụ cho công tác trồng rừng tạo giống rừng vừa đem lại giá trị kinh tế cao, vừa thích ứng với điều kiện lập địa nơi gây trồng Khi khoa học kỹ thuật chưa phát triển, người biết sử dụng biện pháp chọn tạo nhân giống truyền thống như: lai hữu tính, đột biến thực nghiệm, sản xuất từ hạt, giâm hom, ghép cây, chiết cành Bước vào kỷ 21, với ứng dụng rộng rãi siêu việt, công nghệ sinh học coi “Cuộc cách mạng xanh lần thứ 2”, nhờ suất trồng tăng cao với việc giảm thiểu tác hại tới môi trường sinh thái Công nghệ sinh học thực vật áp dụng rộng rãi hiệu chọn tạo nhân giống trồng Tuy nhiên, Việt Nam có số rừng nhân giống kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào, như: Bạch đàn, Keo, Hơng, Dó trầm, Cùng với dự án trồng triệu rừng phạm vi nước, nhu cầu số lượng có chất lượng di truyền cao phục vụ cho trồng rừng lớn Bởi nói cơng tác nghiên cứu nhằm chọn tạo nhân rộng giống loài trồng rừng phổ biến Nhà nước, Ngành quan tâm Trẩu ba hạt (Vernicia montana Lour.) lồi có tên danh mục loài chủ yếu cho trồng rừng sản xuất theo vùng sinh thái Lâm nghiệp (Theo định số 16/2005/QĐ – BNN ban hành ngày 15/03/2005) Đây lồi địa có nhiều giá trị sử dụng, trồng Việt Nam từ lâu đời Ở nước ta, Trẩu phân bố rộng từ tỉnh miền Trung đến tỉnh biên giới phía Bắc Việc gây trồng Trẩu ba hạt Việt Nam tiến hành từ năm đầu thập niên 80 kỷ trước, song mục tiêu chủ yếu để thu hạt dùng làm nguyên liệu lấy dầu Vì thế, nghiên cứu cải thiện giống kỹ thuật gây trồng tập trung vào việc nâng cao sản lượng - hạt Tuy nhiên, Trẩu quan tâm gây trồng với mục tiêu lấy gỗ Trẩu loài địa mọc nhanh, thích nghi với nhiều điều kiện sinh thái khác Gỗ Trẩu màu trắng, mềm, khơng phân biệt giác lõi, có tỷ lệ cellulose cao, dễ chế biến, mối mọt, sử dụng nhiều lĩnh vực đời sống người Chính mà vấn đề áp dụng kỹ thuật Công nghệ sinh học để chọn tạo nhân giống Trẩu bắt đầu nhà chuyên môn ý Một kỹ thuật thiếu cho hàng loạt nghiên cứu chọn tạo nhân giống trồng theo phương pháp tiên tiến xây dựng hệ thống tái sinh Nó sở cho phương pháp gây tạo giống kỹ thuật chuyển gen, lai sinh dưỡng, chọn biến dị dòng soma, cho phương pháp nhân giống thực qua giai đoạn mô sẹo hay tế bào trần Vì thế, khâu nghiên cứu phương pháp chọn tạo nhân giống phải nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh Với lý trên, khuôn khổ thời gian thực tập tốt nghiệp, thực đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh Trẩu ba hạt (Vernicia montana Lour.) qua phôi soma” nhằm góp phần nhỏ vào việc xây dựng quy trình chọn tạo nhân giống Trẩu ba hạt theo phương pháp tiên tiến CHƢƠNG TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Trẩu ba hạt 1.1.1 Vị trí phân loại, nguồn gốc Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Phân lớp: Rosidae Bộ: Euphorbiales Họ: Euphorbiaceae Phân họ: Crotonoideae Tơng: Aleuritideae Chi: Vernicia Lồi: montana Tên khoa học loài Trẩu ba hạt Vernicia montana Lour Tên tiếng Anh loài : Mu oil tree hay Chinese wood oil [20] Ở Trung Quốc, quốc gia mà loài Trẩu trồng nhiều Trẩu ba hạt cịn biết đến với tên gọi: Mu-yu (Webster, 1967), Shan t’ung [20] Tại Việt Nam, Trẩu ba hạt cịn có tên Trẩu nhăn, Trẩu Bắc bộ, Trẩu xẻ Trẩu ta [2,3,7,10] 1.1.2 Đặc điểm sinh học Cây Trẩu gỗ nhỡ có chiều cao khoảng 10 - 15 m, đường kính 25 – 40 cm, thân đơn trục thẳng Vỏ nhẵn màu nâu nhạt, lớp vỏ màu hồng, nhựa dạng nước [2] Lá đơn mọc cách, có kèm sớm rụng Lá Trẩu tương đối đa dạng, có hình trứng đầu nhọn dần, thường hình tim; tái sinh cành chồi thường xẻ - thùy; trưởng thành nhỏ hơn, phiến nguyên xẻ thùy, nách thùy có tuyến Lá non màu nâu đỏ, phủ lông màu trắng mịn mặt Gân hình chân vịt Cuống dài - 12 cm, gốc phiến lá, đầu cuống có hai đốm tía rõ [2, 3] Hoa đơn tính khác gốc gốc, đơi tạp tính Thơng thường chùm hoa đực mọc riêng rẽ, hoa đực hoa mọc chùm, có hoa thường nằm Chùm hoa thường xuất nhánh, sau rụng cuối nhánh, nhánh mọc dự trữ mầm hoa cho năm sau Hoa tự đực hình xim - ngù đầu cành Cánh đài màu xanh, rời, màu trắng phớt hồng Nhị - 20, xếp thành vòng thường hợp gốc Hoa tự thường hình chùm bơng, thưa hoa; bầu ô lúc non phủ lông màu gỉ sắt; vịi nhụy [2, 3] Quả Trẩu hình trứng, nhọn đằng đi, trịn đằng cuống Quả lớn khoảng x cm Vỏ nhăn nheo, bề mặt có lơng tơ, có nhiều rãnh ngang dọc Mỗi chia múi, chín ngả từ màu xanh, xanh vàng sang màu vàng sẫm đỏ nâu Mỗi thường chứa hạt Hạt Trẩu có vỏ màu nâu đen, sần sùi, cứng, kích thước 1,5 x cm [2, 22] Hình 1.1: Hoa Trẩu ba hạt Theo Ngô Quang Đê Lê Mộng Chân, Trẩu lồi có hệ rễ hỗn hợp Cây tuổi có hệ rễ cọc phát triển mạnh, lớn hệ rễ cọc đạt độ sâu 1,5 m Từ tuổi trở lên, rễ bên phát triển mạnh, phân nhánh nhiều rộng, phân bố chủ yếu lớp đất mặt từ – 50 cm thường dài gấp - lần rễ cọc Cây Trẩu có rễ phát triển mạnh thuận lợi cho hút chất dinh dưỡng nơi đất có tầng dầy, nhiên khả xuyên thấu rễ nơi đất có nhiều đá lẫn; nơi đất tầng mỏng rễ khơng thể phát triển bình thường [3] 1.1.3 Đặc điểm sinh thái học 1.1.3.1 Phân bố Trên giới: Trẩu ba hạt phân bố tự nhiên phía Nam Trung Quốc, nước Đơng Nam Á, như: Thái Lan, Lào, Indonesia, Ở Việt Nam, lồi Trẩu ba hạt có phân bố rộng từ miền Trung đến tỉnh biên giới phía Bắc nhân dân gây trồng từ lâu đời [2, 7] 1.1.3.2 Đặc điểm sinh thái học Phạm vi thích ứng với khí hậu Trẩu rộng Trẩu thích hợp với vùng tương đối ấm áp, nhiệt độ thích hợp để Trẩu sinh trưởng, Trẩu hạt đạt sản lượng cao nơi có nhiệt độ bình qn hàng năm 20ºC, ẩm độ khơng khí từ 85 - 90%, lượng mưa từ 1000 - 2000 mm có độ cao 300 – 400 m so với mặt nước biển Trong mùa sinh trưởng từ tháng - loài cần lượng mưa tương đối nhiều, mưa sản lượng thấp [3] Trẩu ba hạt có yêu cầu khắt khe đất Đất thích hợp với sinh trưởng phát triển Trẩu đất tầng dày, tơi xốp, nhiều mùn, thoát nước, đủ ẩm, chua (độ pH - 6,5) Những nơi đất chua, kiềm, đất bị chặt, nhiều đá lẫn sỏi sạn Trẩu sinh trưởng khơng tốt Từ việc nghiên cứu đặc trưng phẫu diện kết hợp với tình hình hoa kết cây, tác giả Đỗ Thanh Hoa kết luận đất feralit vàng nhạt phiến thạch mica, đất feralit vàng đỏ phiến thạch sét, đất poocfiarit vàng nâu thích hợp để trồng Trẩu [3] Trẩu ba hạt ưa sáng mạnh, nên nơi có địa hình đồi gị, trồng thưa, tán xịe rộng Trẩu kết nhiều Nơi khe núi, chân núi thiếu ánh sáng nên Trẩu hoa kết mọc tốt Tuy nhiên Trẩu khơng chịu gió nên khơng trồng nơi nhiều bão [3] Hoa Trẩu bắt đầu nở từ tháng – hàng năm Mùa bắt đầu sau đó, từ tháng – 10 năm 1.1.4 Các nghiên cứu phƣơng thức trồng nhân giống Trẩu ba hạt 1.1.4.1 Trên giới Về lịch sử nghiên cứu Trẩu ba hạt, phải kể đến tài liệu để lại từ thời Pháp thuộc đặc biệt tài liệu từ Trung Quốc, nước quan tâm gây trồng loài từ lâu đời Trong lĩnh vực chọn giống, tác giả Wang JF; Fang JX; Liu XW (1988), nghiên cứu chọn dịng Trẩu có suất cao mở rộng gây trồng kết luận phương pháp thích hợp cho trồng Trẩu Trung Quốc sử dụng nhân giống vơ tính từ dịng tốt thay cho việc trồng từ hạt, số 13 dòng sàng lọc, tuyển chọn, gây trồng diện rộng 3000 thu 1168 dầu [3] Viện Lâm nghiệp Quảng Tây (Trung Quốc) nghiên cứu bệnh Trẩu đưa kết luận bệnh chổi than bệnh khô héo thường làm suất giảm 40 – 80% Tuy nhiên ghép Trẩu V.fordii lên gốc ghép Trẩu V.montana lại có khả kháng bệnh [10] El Borel (1942) đề cập đến phương pháp gây giống chọn lọc cho nhân giống hạt dẫn đến khơng có có Ngay trồng hạt lấy từ sai quả, trồng bị phân ly mạnh số khơng có có chiếm nhiều Do chọn mẹ tốt khai thác mắt ghép từ này, áp dụng cách ghép trồng ghép đạt hiệu cao [3] 1.1.4.2 Tại Việt Nam Ở nước ta có số cơng trình nghiên cứu vào lĩnh vực phân loại, kỹ thuật ghép tạo dòng vơ tính Cao Ngọc “Kỹ thuật gây trồng chế biến hạt Trẩu” (1984) đề cập đến cần thiết phải chọn giống để lấy vật liệu ghép với tiêu chuẩn: Trẩu phải độ tuổi từ 12 - 15 năm, suất hạt khô đạt 10 kg/năm, có dạng tán trịn, phát đều, phân cành thấp, sinh trưởng tốt không bị sâu bệnh Cây trồng phải tiến hành nhân giống phương pháp ghép mắt Gốc ghép gieo từ hạt lấy từ mẹ có suất cao sau thành lập vườn sản xuất mắt ghép để cung cấp cho sản xuất đại trà [3] Đinh Văn Tẫn, Nguyễn Kim Thi (1986) khẳng định nhân giống phương pháp ghép tạo dịng vơ tính giúp cho việc nâng cao suất Theo tác giả này, lồi Trẩu (V montana) trồng từ hạt có phân ly tính đực cao, có tác dụng trồng bóng mát làm rừng đầu nguồn tỉ lệ có tính đực chiếm 82% Nếu trồng lấy nên tiến hành trồng ghép [3, 10] Nguyễn Minh Thảo (1990) nghiên cứu Trẩu Phủ Quỳ, Nghệ Tĩnh cho Trẩu trồng thực sinh nhiều địa phương có tỷ lệ hoa đực cao, năm có quả, tỷ lệ cho từ 10 – 30%, suất - hạt thấp Do để Trẩu cho sớm, suất cao phải có giống tốt tuyển chọn nhiều năm Những rừng trồng từ ghép dòng tốt sau năm cho hạt khơ/ha tác giả đề nghị dịng nên nhân nhanh để phục vụ sản xuất [3] Hiện nay, đa số rừng Trẩu trồng tỉnh Lai Châu, Hịa Bình, Quảng Nam thành phố Đà Nẵng Thường trồng cách gieo hạt thẳng để lấy gỗ, số nơi trồng ghép để thu hái hạt [3] Có thể nói rằng, giới Việt Nam số cơng trình nghiên cứu tài liệu nghiên cứu Trẩu ba hạt khơng nhiều Chỉ có Trung Quốc nước trồng nghiên cứu Trẩu rầm rộ Tuy nhiên chưa có cơng trình cơng bố lĩnh vực nhân giống lồi kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.5 Giá trị sử dụng Trẩu lồi có nhiều giá trị sử dụng: - Hạt Trẩu có hàm lượng dầu tương đối cao, chiếm khoảng 25 – 30% theo tỷ lệ hạt Dầu Trẩu mặt hàng xuất có giá trị có nhiều cơng dụng Dầu Trẩu mau khơ, tỷ trọng nhẹ, khơng dẫn điện, có tính chống ẩm chống mục tốt,… nên sử dụng rộng rãi như: chế tạo loại sơn cao cấp dùng ngành điện tử, sơn vỏ tàu, thuyền, dùng làm sơn lót vỏ đồ hộp có khả chống kiềm mặn cao, chống gỉ Ngồi dầu Trẩu cịn dùng việc chế tạo vật liệu cách nhiệt, cách điện vật liệu tạo màng bóng,… Trên giới người ta thống kê khoảng 850 mặt hàng có sử dụng dầu Trẩu, từ loại chất dẻo, nylon, da nhân tạo đến loại thuốc y dược [2, 3, 7, 10, 22] - Trong khô dầu Trẩu có: 77,58% chất hữu cơ, 3,5% chất đạm, 0,97% lân, 0,5% kali, nên dùng làm phân bón tốt Khô dầu Trẩu chứa 50% protein, khử độc tố làm thức ăn cho gia súc Vỏ cịn dùng để chế than hoạt tính [3, 7] - Trước đây, Trẩu trồng chủ yếu để lấy hạt Tuy nhiên, gỗ Trẩu ý để khai thác gỗ Trẩu có màu trắng, mềm, khơng phân biệt giác lõi, có tỷ lệ cellulose cao, dễ chế biến, mối mọt, sử dụng làm nhà, làm bao bì, làm ngun liệu giấy đóng đồ mộc thông thường [2, 3, 7] - Trong lĩnh vực y dược, vỏ Trẩu dùng y học cổ truyền làm thuốc chữa đau, nhức Hạt có dầu dùng làm thuốc giải độc, chống độc, thuốc chữa mụn nhọt [3, 22] - Ngoài giá trị trên, Trẩu sử dụng trồng phịng hộ Do lồi gỗ nhỡ, mọc nhanh, dễ trồng, có tán dày, xanh mùa hè nóng, nên Trẩu sử dụng làm che bón cho vườn Chè, Dứa, Cà phê Một số nơi trồng Trẩu phủ xanh bảo vệ đất, kết hợp cung cấp gỗ củi sản phẩm khác [2, 3] 1.2 Tổng quan nhân giống vô tính in vitro qua giai đoạn tạo phơi soma 1.2.1 Cơ sở khoa học nhân giống vơ tính in vitro 1.2.1.1 Tính tồn tế bào Cuối kỷ XIX đầu kỷ XX, nhà sinh lý thực vật học người Đức Gottlieb Haberlandt đặt móng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật ơng đưa giả thuyết tính tồn tế bào: “Tế bào thể sinh vật mang tồn thơng tin di truyền cần thiết đủ sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp, tế bào phát triển thành cá thể hồn chỉnh” Tính tồn tế bào mà Haberlandt nêu sở lý luận phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật Cho đến nhà khoa học chứng minh khả tái sinh thể thực vật hoàn chỉnh từ tế bào riêng rẽ [16, 1, 14] 1.2.1.2 Sự biệt hóa phản biệt hóa tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành chỉnh thể thống bao gồm nhiều quan chức khác nhau, hình thành từ nhiều loại tế bào khác Tuy nhiên, tất loại tế bào bắt nguồn từ tế bào (hợp tử) Ở giai đoạn đầu, hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phơi sinh chưa mang chức riêng biệt (chuyên hóa) Sau từ tế bào phôi sinh chúng tiếp tục biến đổi thành tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho mơ, quan có chức khác Sự biệt hóa tế bào chuyển tế bào phơi sinh thành tế bào chuyên hóa, đảm nhận chức khác Tuy nhiên, tế bào biệt phân hóa thành tế bào có chức chuyên biệt, chúng khơng hồn tồn khả biến đổi Trong trường hợp cần thiết, điều kiện thích hợp, chúng lại trở dạng tế bào phơi sinh phân chia mạnh mẽ Q trình gọi phản biệt hóa tế bào Về chất biệt hố phản biệt hố kết q trình điều hồ hoạt hố gen Tại thời điểm q trình phát triển cá thể có số gen hoạt hoá (mà vốn trước bị ức chế) vào Tuy nhiên, có số mẫu mơ sẹo hình thành tồn mẫu, mẫu cịn lại mơ sẹo hình thành sùi to đầu vết cắt Khối mơ sẹo tạo từ mảnh rễ mầm có màu trắng trắng – vàng, có dạng cứng Với việc sử dụng mơi trường ni cấy có tác dụng kích thích thân mầm phát sinh mô sẹo tốt nhất, loại vật liệu ni cấy thân mầm xác định loại vật liệu có khả phát sinh mô sẹo tốt so với mầm rễ mầm 3.5 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tạo phôi soma từ mô sẹo Phơi soma cịn gọi phơi vơ tính, hình thành phát triển từ tế bào dinh dưỡng, tế bào biệt hóa thành cấu trúc lưỡng cực, cực hình thành rễ, cực phát triển thành chồi Sau đưa trở lại với điều kiện nuôi sáng thời gian, mô sẹo hình thành từ thân mầm cấy chuyển sang môi trường tạo phôi soma Như đề cập trên, lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào, Trẩu đối tượng nghiên cứu Bởi vậy, nghiên cứu nội dung ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả tạo phôi soma từ mô sẹo, tham khảo kế thừa từ kết nghiên cứu tạo phôi soma với đối tượng Xoan ta (Melia azedarach) tài liệu “An alternative pathway for plant in vitro regeneration of chinaberry – tree Melia azedarach L deriver from the induction of somatic embryogenesis” tác giả Sandra Sharry cộng (2006) [20] Trong tài liệu này, môi trường tạo phơi soma Xoan sử dụng có cơng thức: - MS + 0,2 mg/l BAP + 0,01 mg/l GA3 + 161,1 mg/l Putresine + 3% sucrose - MS + 1,0 mg/l BAP + 200 mg/l HC + 161,1 mg/l Putresine + 40 mg/l Adenine + 2% sucrose [20] Do vậy, nội dung nghiên cứu tiến hành nghiên cứu khả tạo phôi soma từ mô sẹo mơi trường gồm có: Mơi trường 40 dinh dưỡng MS + 161,1 mg/l Putresine + 40 mg/l Adenine + g/l agar bổ sung chất điều hòa sinh trưởng với hàm lượng khác nhau, hàm đường sucrose với hàm lượng khác (đã trình bày bảng 2.4) Bảng 3.5: Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả tạo phôi soma từ mô sẹo Số mẫu mô Số mẫu mô sẹo tạo Tỷ lệ mẫu tạo sẹo/1 lần phôi soma TB/1 phôi soma lặp lần lặp (%) SM1 10 2,33 23,33 20,5 SM2 10 2,33 23,33 21,3 SM3 10 3,33 33,33 26,8 SM4 10 3,67 36,67 29,8 SM5 10 30 26,7 SM6 10 3,67 36,67 26,3 SM7 10 4,33 43,33 33,7 SM8 10 6,67 66,67 38,3 SM9 10 5,67 56,67 33,1 SM10 10 50 34,7 CTTN Số phôi soma TB/ mẫu Các môi trường nuôi cấy chia thành nhóm: - Nhóm gồm mơi trường: SM1, SM2, SM3, SM4, SM5 SM6 Ở nhóm này, môi trường nuôi cấy bổ sung chất ĐHST (BAP, NAA Kinetin) với hàm lượng khác 30 g/l đường sucrose - Nhóm gồm môi trường: SM7, SM8, SM9 SM10 Các môi trường bổ sung chất ĐHST với hàm lượng tương tự môi trường SM3, SM4, SM5 SM6 Các mơi trường ni cấy nhóm khác nhóm bổ sung 60 g/l đường sucrose Sau tuần nuôi cấy, kết thí nghiệm tổng hợp phụ biểu 13 Sau xử lý, kết nghiên cứu trình bày bảng 3.5 41 * Ở nhóm mơi trường thứ nhất, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng chất ĐHST đến khả tạo phôi soma mẫu ni cấy Kết phân tích phương sai ảnh hưởng chất ĐHST đến khả tạo phôi soma cho Ftính (22,69) lớn F0,05 (3,10) Như vậy, mơi trường ni cấy có bổ sung chất ĐHST khác với hàm lượng khác có ảnh hưởng rõ rệt đến hình thành phơi soma từ mơ sẹo Sau khoảng tuần ni cấy, nhìn chung mơi trường nghiên cứu quan sát thấy hình thành phơi soma Trong mơi trường SM1, SM2, SM3 SM4, chất ĐHST bổ sung BAP Kinetin Tỷ lệ mô sẹo tạo phôi soma môi trường SM1 SM2 thấp (đều 23,33%) Ở môi trường SM3 SM4, hàm lượng BAP tăng tỷ lệ mơ sẹo tạo phôi soma tăng (lần lượt 33,33% 36,67%) Ngồi ra, số phơi soma trung bình tạo thành mẫu mô sẹo tăng dần (lần lượt 26,8 phôi 29,8 phôi) Ở môi trường SM5 SM6, chất ĐHST bổ sung gồm BAP, Kinetin NAA, hàm lượng NAA giảm, tỷ lệ mô sẹo tạo phôi tăng (lần lượt 30% 36,67%) Tuy nhiên số lượng phơi soma tạo thành trung bình mẫu mô sẹo lại tương đương (lần lượt 26,7 phôi 26,3 phôi) Từ kết bảng 3.5 cho thấy: môi trường SM4 SM6, tỷ lệ mô sẹo tạo phôi soma đạt cao (36,67%), số lượng phôi soma tạo thành trung bình mẫu mơ sẹo lại có chênh lệch rõ rệt: số phôi tạo thành trung bình mơi trường SM4 29,8 phơi, cịn số phơi tạo thành trung bình mơi trường SM6 26,3 phơi Do kết luận mơi trường SM4 (MS + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l Kinetin + 161,1 mg/l Putresine + 40 mg/l Adenine + 30 g/l đường sucrose + g/l agar) có số lượng phôi soma từ mô sẹo nhiều môi trường nghiên cứu (từ môi trường SM1 đến mơi trường SM6) * Trong nhóm mơi trường thứ hai, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng đường sucrose đến khả tạo phôi soma mô sẹo 42 Mẫu mô sẹo cấy chuyển từ môi trường cảm ứng tạo mô sẹo sang môi trường có tác dụng kích thích mơ sẹo tạo phơi soma thuộc nhóm (SM3, SM4, SM5 SM6), bổ sung 60 g/l đường sucrose Kết phân tích phương sai cho thấy ảnh hưởng hàm lượng đường sucrose đến khả mô sẹo tạo phôi soma rõ rệt, thể ở: Ftính (15,03) lớn F0,05 (2,86) Có thể thấy rằng, sau thời gian nuôi cấy (3 tuần), môi trường bổ sung sucrose có tỷ lệ mơ sẹo tạo phơi soma tăng lên rõ rệt Khi bổ sung thêm đường sucrose, nguồn dinh dưỡng môi trường (nguồn Cacbon) tăng thêm, tạo điều kiện thuận lợi cho hình thành tế bào tiền phơi sau phơi soma hồn chỉnh Nhờ vậy, tỷ lệ mơ sẹo tạo phôi soma số lượng phôi tạo thành môi trường giàu Cacbon cao rõ rệt Trong môi trường SM7 SM8, hàm lượng Kinetin tăng tỷ lệ mơ sẹo tạo phơi soma tăng đáng kể (lần lượt 43,33% 66,67%), đồng thời số phơi soma trung bình mẫu mơ sẹo tăng, không đáng kể (33,7 phôi 38,3 phôi) Trong môi trường SM9 SM10, bổ sung NAA với hàm lượng tăng dần, tỷ lệ mô sẹo tạo phôi soma giảm dần (56,67% 50%) số lượng phơi soma trung bình mẫu mô sẹo lại tăng (33,1 phôi 34,7 phôi) Như thấy ảnh hưởng rõ rệt đường sucrose khả tạo phôi soma từ mô sẹo Trẩu hạt Từ bảng kết nghiên cứu trình bày bảng 3.5 kết luận: môi trường SM8 (MS + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l Kinetin + 161,1 mg/l Putresine + 40 mg/l Adenine + 30 g/l đường sucrose + g/l agar) có tỷ lệ mơ sẹo tạo phơi soma cao nhất, đồng thời cho số lượng phôi soma tạo thành nhiều 43 Về đặc điểm hình thái phơi: Sau ba tuần cấy chuyển mô sẹo sang môi trường tạo phôi soma quan sát thấy khối mô sẹo bắt đầu xuất phơi hình cầu màu xanh - vàng nhạt Sau tuần, phơi có màu xanh đậm chuyển dần sang hình tim, số phơi phát triển đến giai đoạn hình cá đuối (hình 3.9 3.10) Phơi soma Trẩu hình cá đuối Phơi soma Trẩu hình tim Hình 3.9: Hình ảnh phơi soma Trẩu kính hiển vi Phơi soma Hình 3.10: Phơi soma tạo từ thân mầm Trẩu Ngồi ra, thời gian nuôi mẫu môi trường cảm ứng tạo phơi soma từ mơ sẹo, có số phơi kết thúc thời kỳ phơi hóa bắt đầu tái sinh 44 chồi Số chồi tái sinh giai đoạn khơng nhiều có kích thước nhỏ (0,1 – 0,3 cm) Từ kết nghiên cứu trình bày bảng 3.5 cho thấy: môi trường SM8 (MS + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l Kinetin + 161,1 mg/l Putresine + 40 mg/l Adenine + 30 g/l đường sucrose + g/l agar) môi trường tối ưu ảnh hưởng đến khả tạo phôi soma từ mô sẹo 3.6 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tái sinh chồi từ phôi soma Sau mô sẹo chuyển sang môi trường cảm ứng tạo phơi soma thời gian phơi bắt đầu hình thành Cũng mơi trường này, sau thời gian nuôi định, số phôi soma phát triển tạo chồi tái sinh Tuy nhiên, số lượng chồi tái sinh chưa nhiều kích thước chồi chưa phát triển Do cần cấy chuyển mẫu sang môi trường giàu dinh dưỡng để phôi phát triển tiếp tục tái sinh chồi, chồi tái sinh tăng trưởng kích thước Sau quan sát kính hiển vi thấy số lượng phơi soma hình thành nhiều, đa số phơi có hình tim, hình thủy lơi, hình cá đuối số phơi có tượng bật chồi (5 – tuần sau chuyển mô sẹo sang mơi trường cảm ứng tạo phơi soma) cấy chuyển mẫu sang môi trường nuôi cấy Các cơng thức thí nghiệm cho nội dung trình bày bảng 2.5 Sau tuần theo dõi (tương ứng với lần cấy chuyển), kết nghiên cứu tổng hợp bảng 3.6: Từ kết phân tích phương sai tỷ lệ phơi soma tái sinh chồi cho Ftính (15,51) lớn F0,05 (4,06) Vậy thấy mơi trường ni cấy khác có ảnh hưởng rõ rệt đến khả tái sinh chồi từ phôi soma Kết bảng 3.6 cho thấy: sau cấy chuyển sang môi trường giàu dinh dưỡng hơn, số lượng phôi soma phát sinh chồi tăng lên rõ rệt Ở 45 môi trường TSC1, tỷ lệ phôi tái sinh chồi thấp (18,35%) Tiếp theo môi trường TSC2 (có tỷ lệ phơi tái sinh chồi cao 35 %) Bảng 3.6: Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả tái sinh chồi từ phôi soma Tỷ lệ phôi Số phôi soma Số phôi soma TB ban đầu/1 lần tái sinh chồi/1 lần lặp lặp TSC1 20 3,67 18,35 TSC2 20 7,00 35,00 TSC3 20 15,67 78,35 TSC4 20 12,67 63,35 CTTN soma tái sinh chồi (%) Hai mơi trường có kí hiệu TSC3 TSC4 cho tỷ lệ phôi soma tái sinh chồi cao hẳn so với tỷ lệ môi trường TSC1 TSC2 (lần lượt 78,35% 63,35%) Do mơi trường này, ngồi chất dinh dưỡng MS, mơi trường cịn bổ sung đường sucrose chất ĐHST Có thể chất có tác dụng kích thích phơi soma hình thành, đồng thời Hình 3.11: Chồi Trẩu tái sinh từ phôi soma (sau tuần tuần môi trường ni cấy TSC) 46 thúc đẩy nhanh q trình tái sinh chồi từ phôi soma So sánh kết thu mơi trường TSC3 TSC4 thấy: bổ sung NAA (0,5 mg/l) tỷ lệ phôi tái sinh chồi giảm Như vậy, NAA liên quan đến khả tái sinh chồi từ phôi soma Về tốc độ sinh trưởng chồi: ni cấy mơi trường có kí hiệu TSC3 TSC4, chiều dài chồi tăng tương đương tăng nhanh so với nuôi cấy môi trường TSC1 TSC2 Khoảng tuần sau chuyển sang mơi trường ni cấy mới, chồi có chiều dài 0,1 – 0,2 cm (hình 3.11) Sau tuần ni cấy, chồi có chiều dài 0,6 – 1,2 cm (hình 3.11), Hình 3.12: Chồi Trẩu tái sinh từ phơi soma (sau tuần nuôi cấy môi trường TSC) 47 sau – tuần nuôi cấy (tương đương lần cấy chuyển) chồi Trẩu tái sinh đạt chiều dài 1,8 – 2,5 cm có từ – thật (hình 3.11) Như vậy, từ kết nghiên cứu tập hợp bảng 3.6 kết luận: mơi trường TSC3 (MS + 2,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l Kinetin + 161,1 mg/l Putresine + 40 mg/l Adenine + 60 g/l đường sucrose + g/l agar) có ảnh hưởng tốt đến khả tái sinh chồi từ phôi soma 48 Chƣơng KẾT LUẬN - TỒN TẠI – KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Phương pháp khử trùng để tạo mẫu từ phôi hạt Trẩu hiệu sử dụng Cồn 70% phút HgCl2 0,1% phút Với phương pháp mẫu tạo đạt tỷ lệ 97,78 % - Môi trường nuôi cấy tốt để kích thích phơi hạt Trẩu nảy mầm mơi trường dinh dưỡng MS có bổ sung 30g/l đường sucrose - Môi trường nuôi cấy tốt để kích thích hình thành mơ sẹo từ thân mầm mơi trường có thành phần MS + 1,0 mg/l BAP + 2,0 mg/l NAA + 0,5 mg/l Kinetin + 30 g/l đƣờng sucrose + g/l agar Ở mơi trường có tỷ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo đạt 95% - Ở môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích tốt thân mầm phát sinh mơ sẹo thân mầm xác định loại vật liệu có khả tạo mơ sẹo cao so với mầm rễ mầm - Môi trường ni cấy tốt để kích thích mơ sẹo tạo phơi soma mơi trường có thành phần MS + 2,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l Kinetin + 161,1 mg/l Putresine + 40 mg/l Adenine + 60 g/l đƣờng sucrose +7 g/l agar Ở mơi trường có tỷ lệ mô sẹo tạo phôi soma đạt 66,67%, số phôi soma trung bình/khối mơ sẹo đạt 38,3 phơi - Mơi trường ni cấy tốt để kích thích tái sinh chồi từ phơi soma mơi trường có thành phần MS + 2,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l Kinetin + 161,1 mg/l Putresine + 40 mg/l Adenine + 60 g/l đƣờng sucrose +7 g/l agar Ở mơi trường có tỷ lệ phôi soma tái sinh chồi đạt 78,35% 4.2 Tồn Do thời gian thực có hạn nên khóa luận cịn tồn sau: - Chỉ nghiên cứu ảnh hưởng loại môt trường hóa học khác đến hình thành mơ sẹo từ loại vật liệu nuôi cấy thân mầm, mà chưa nghiên cứu ảnh hưởng loại môi trường hóa học đến hình 49 thành mơ sẹo loại vật liệu nuôi cấy khác mầm rễ mầm tạo từ phôi hạt in vitrro - Chưa nghiên cứu khả nhân nhanh mô sẹo nhân nhanh chồi tái sinh từ mô sẹo - Chưa nghiên cứu khả tạo rễ in vitro lồi Trẩu ba hạt - Vì ngun nhân khách quan mà số lượng mẫu nghiên cứu cơng thức thí nghiệm chưa đảm bảo cho xử lý thống kê Bởi kết luận thu từ kết xử lý thống kê mang ý nghĩa tham khảo 4.3 Kiến nghị Cần tiếp tục nghiên cứu tiếp để hoàn thiện nội dung chưa thực được, nhằm hoàn thiện kỹ thuật tái sinh Trẩu ba hạt in vitro thông qua phôi soma hoàn chỉnh  Nghiên cứu ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy đến khả tạo mô sẹo mầm thân mầm  Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả nhân nhanh mô sẹo nhân nhanh chồi tái sinh mô sẹo  Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả tạo rễ Trẩu tái sinh in vitro  Nghiên cứu kỹ thuật huấn luyện, trồng chăm sóc ngồi tự nhiên 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Lê Trần Bình; Hồ Hữu Nhị - Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học cải thiện giống trồng NXB Nông nghiệp, Hà Nội [2] Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên (2003), Thực vật rừng NXB Nông nghiệp, Hà Nội [3] Ngô Quang Đê, Lê Mộng Chân (1988), Cây Trẩu NXB Nông nghiệp – Hà Nội [4] Nguyễn Thị Thanh Hiền, Dương Tấn Nhựt, Đỗ Năng Vịnh CS (2003), Bước đầu nghiên cứu việc tạo hạt nhân tạo, ứng dụng nhân giống vơ tính bảo quản, Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2003, Hà Nội, trang 935 – 938 [5] Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2004), Nghiên cứu ứng dụng công nghệ phôi soma công tác giống Trầm hương (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte), Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, NXB KH&KT, trang 642 – 644 [6] Chu Bá Phúc, Đỗ Năng Vịnh cộng (2003), Nghiên cứu nhân nhanh số lồi thân gỗ thơng qua hệ thống tái sinh mơ sẹo phơi hóa nhân chồi in vitro (Tếch, Trầm, Hông, Bạch đàn), Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội, trang 939 – 942 [7] Kỹ thuật trồng số thân gỗ đa tác dụng, (2000), NXB Văn hóa Dân tộc , trang 20 – 25 (Theo trang web thông tin chi tiết khoa học Tuyên Quang) [8] Nguyễn Quốc Thiện (2005), Ứng dụng hệ thống Bioreactor sản xuất số lượng lớn dược liệu hoa cảnh Trung tâm CNSH – TP Hồ Chí Minh [9] Bùi Văn Thắng, Đinh Thị Phịng, Chu Hoàng Hà (2004), Nghiên cứu hệ thống tái sinh Lạc (Arachis hypogaea L.) phục vụ cho chuyển gen, Viện Cơng nghệ sinh học Tạp chí Cơng nghệ sinh học 2(3): 371 - 379 51 [10] Nguyễn Kim Thi (1986), Nhân giống loài Trẩu Vernicia motana phương pháp ghép NXB Nông nghiệp [11] Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh (2004), Nghiên cứu ứng dụng công nghệ phôi soma công tác giống Lát hoa (Chukrasia tabularis A Juss), Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam, NXB KH&KT, trang 768 – 770 [12] Trương Thu Thủy, Nguyễn Hữu Cường, Đinh Thị Phịng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2003), Nghiên cứu quy trình tái sinh bơng (Gossypium hirsutum L) từ phôi soma , Viện Công nghệ sinh học, Trung tâm KHTN & CNQG Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội , trang 831 – 836 [13] Đoàn Duy Thanh, Nguyễn Huy Thuần, Nguyễn Thanh Toàn, Đỗ Năng Vịnh (2003), Một số kết nghiên cứu tạo phơi vơ tính hồng mơn (Anthurium andreanum), Viện Di truyền Nông nghiệp, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội, trang 967 – 970 [14] Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật nghiên cứu ứng dụng NXB Nông nghiệp, Hà Nội [15] Nguyễn Quang Thạch; Nguyễn Thị Lý Anh; Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo trình cơng nghệ sinh học nơng nghiệp NXB Nông nghiệp, Hà Nội [16] Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2007), Công nghệ sinh học tập – Công nghệ sinh học tế bào NXB Giáo dục, Hà Nội [17] Vũ Văn Vụ (2005), Sinh lý học thực vật, NXB Giáo dục, Hà Nội [18] Nguyễn Văn Uyển (1998), Những kiến thức Công nghệ sinh học, NXB Giáo dục, Tp Hồ Chí Minh [19] Nguyễn Văn Uyển (1998), Ni cấy mơ thực vật phục vụ công tác giống trồng, NXB Nơng nghiệp, Tp Hồ Chí Minh 52 Tiếng Anh [20] Sandra Sharry (2006), An alternative pathway for plant in vitro regeneration of chinaberry – tree Melia azedarach L deriver from the induction of somatic embryogenesis, Electronic Journal of Biotechnology, Vol.9 No.3, Special Issue, p 187 – 194 [21] Silvia Vila, Ana Gonzalez, Hebe Rey, Luis Mroginski (2002), Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature zygotic embryos of Melia azedarach (Meliaceae), 2003 Society for In Vitro Biology, p 283 – 287 [22] Các trang web: http://www.agbiotech.com.vn http://www.vn.creatures.com.vn http://www.dof.marc.gor.vn http://www.wikipedia.com http://www.thaythuoccuaban.com.vn http://www.sinhhocvietnam.com.vn 53 PHẦN PHỤ BIỂU 54 ... kiện ni cấy tốt để tái sinh Trẩu ba hạt qua phôi soma 2.2 Đối tƣợng vật liệu nghiên cứu - Đối tượng: Trẩu ba hạt (Vernicia montana Lour. ) - Vật liệu dùng để nghiên cứu: Hạt Trẩu chín thu hoạch... nghiên cứu phương pháp chọn tạo nhân giống phải nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh Với lý trên, khuôn khổ thời gian thực tập tốt nghiệp, thực đề tài: ? ?Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh Trẩu ba hạt (Vernicia. .. phát sinh tế bào soma cách trực tiếp, sau nhân sinh khối dịch huyền phù phôi soma môi trường agar môi trường lỏng bước cuối tái sinh phôi soma [11] * Nghiên cứu ứng dụng công nghệ phôi soma công