Giáo trình vi hóa sinh môi trường

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỎ - ĐỊA CHẤT Đỗ Văn Bình (chủ biên) Trần Thị Thu Hương GIÁO TRÌNH VI HĨA SINH MÔI TRƯỜNG HƯỚNG TỚI KỶ NIỆM 50 NĂM THÀNH LẬP TRƯỜNG ĐẠI MỎ - ĐỊA CHẤT GIÁO TRÌNH VI HĨA SINH MƠI TRƯỜNG HƯỚNG TỚI KỶ NIỆM 50 NĂM THÀNH LẬP TRƯỜNG ĐẠI MỎ - ĐỊA CHẤT LỜI NÓI ĐẦU Giáo trình “Vi Hóa sinh mơi trường” giới thiệu nội dung Hóa sinh mơi trường Vi sinh mơi trường số thí nghiệm thực hành công nghệ môi trường Đây giáo trình cung cấp kiến thức sở nhất, tiền đề giúp sinh viên tiếp thu kiến thức từ môn học chuyên sâu thiết kế, tính tốn, xử lý nhiễm phương pháp sinh học Trong phần Hóa sinh mơi trường, giáo trình đề cập đến kiến thức tự nhiên Hóa sinh vai trò chúng protein, enzyme, hợp chất hữu khơng chứa nitơ, phản ứng oxy hóa khử vai trị chu trình xitrat (Krebs) lượng hóa sinh học Trong phần Vi sinh mơi trường, giáo trình đề cập đến đặc điểm vi sinh vật trình trao đổi chất, sinh trưởng vi sinh vật môi trường; nhóm vi sinh vật mơi trường, vai trị vi sinh vật q trình chuyển hóa nhờ vi sinh vật việc phân giải hợp chất hữu chứa nitơ không chứa nitơ Phần thí nghiệm thực hành, giáo trình giới thiệu số thí nghiệm Hóa sinh Vi sinh; hóa chất, mơi trường ni cấy vi sinh vật ứng dụng cho phép phân tích có liên quan nhằm kiểm tra tiêu lĩnh vực phân tích mơi trường Đối tượng phục vụ sinh viên, học viên cao học ngành Sinh học, Mơi trường cán có liên quan đến sinh học, mơi trường Ngồi ra, giáo trình cung cấp số kiến thức mà xã hội quan tâm lĩnh vực Hóa sinh Vi sinh Giáo trình biên soạn hai tác giả, PGS.TS Đỗ Văn Bình chịu trách nhiệm chung, kiểm duyệt lại chương; ThS Trần Thị Thu Hương chịu trách nhiệm soạn thảo chế Giáo trình chắn cịn nhiều thiếu sót, mong bạn đọc góp ý để tập thể tác giả hồn chỉnh Tập thể tác giả PHẦN HĨA SINH MƠI TRƢỜNG MỞ ĐẦU Nội dung mục đích: giới thiệu kiến thức chung hóa sinh học, lịch sử thành tựu chuyên ngành Hóa sinh học ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP VÀ LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU CỦA HĨA SINH HỌC 1.1 Định nghĩa hố sinh học [1, 3, 5, 6] Năm 1903 khái niệm hoá sinh học đƣợc đƣa nhà bác học ngƣời Đức Carl Newber: “là môn khoa học mô tả cấu trúc chức tổ chức sống ngơn ngữ hố học” Bên cạnh cịn có định nghĩa tắc hơn: “Hố sinh học môn khoa học nghiên cứu thành phần, cấu tạo các: q trình chuyển hố, thành phần cấu tạo sở hố học q trình sống” “Hố sinh học cịn tƣợng hố sinh đƣợc phân tích góc độ hố học” Hiện nay, ngƣời ta thƣờng phân biệt hố sinh học mơ tả với hoá sinh học đại: + Hoá sinh học mơ tả liên quan đến đặc tính thành phần tế bào; + Hoá sinh học đại liên quan đến chất chế phản ứng, nghiên cứu thành phần tế bào 1.2 Đối tƣợng, phƣơng pháp lĩnh vực nghiên cứu Theo đối tƣợng sinh vật nghiên cứu, chia thành số lĩnh vực nhƣ: + Hoá sinh động vật, thực vật; + Hoá sinh vi sinh vật; Theo lĩnh vực nghiên cứu, chia thành số lĩnh vực nhƣ: + Hoá sinh dinh dƣỡng, dƣợc học…; + Hoá sinh mơi trƣờng; Theo phƣơng pháp, chia thành số lĩnh vực nhƣ: + Phƣơng pháp hoá học; + Phƣơng pháp hoá lý; + Phƣơng pháp vật lý đại; LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN VÀ MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU CỦA HĨA SINH HỌC 2.1 Lịch sử phát triển [1, 2, 4] Lịch sử phát triển ngành hóa sinh học trải qua nhiều giai đoạn, có số mốc quan trọng nhƣ sau: + Năm 1828 tổng hợp đƣợc ure, điều chứng tỏ tổng hợp đƣợc chất hữu thể sống + Năm 1897 Eduard Buchner (1860 - 1917) tổng hợp đƣợc ure thành công việc lên men vô bào từ rỉ đƣờng, điều chứng tỏ chuyển hố đƣợc chất hữu bên tế bào sống Cũng thời gian này, ông lần chứng minh đƣợc vai trò enzyme q trình lên men rƣợu, sau nghiên cứu thành công thành phần tế bào (động, thực vật) tách đƣợc số enzyme + Cuối kỷ XIX nhà khoa học nghiên cứu đƣợc cấu trúc axit amin, chất liên kết peptide giải thích đƣợc số trình chuyển hố + Đến đầu kỷ XX nhà khoa học xác định đƣợc chất enzyme protein phản ứng oxy hoá sinh học + Đến cuối kỷ XX, hoá sinh học trở thành lĩnh vực phát triển mạnh ngành sinh học, nghiên cứu có số ứng dụng quan trọng sống nhƣ sản xuất đƣợc insulin, sản xuất số hợp chất có hoạt tính sinh học… + Ngày nay, nhờ thành tựu nghiên cứu hóa sinh học ngƣời sản xuất đƣợc nhiều chế phẩm sinh học phục vụ cho đời sống hoạt động phát triển kinh tế Ví dụ nhƣ sản xuất đƣợc insulin, vacxin 2.2 Mục đích nghiên cứu Hóa sinh học có nhiều mục đích, có ba mục đích quan trọng nhất, là: + Nghiên cứu hóa sinh học nhằm điều khiển hoạt động trình sống cho có lợi nhất; + Tạo chế phẩm sinh học ứng dụng đƣợc sống; + Bảo vệ mơi trƣờng ngƣời Ví dụ: nghiên cứu xử lý vấn đề ô nhiễm môi trƣờng nhƣ chất thải sinh hoạt, thức ăn thừa…; xử lý rơm rạ, cây, phân gia súc… phát sinh từ hoạt động sản xuất nông nghiệp loại vỏ hoa quả, rau… thải trình chế biến thực phẩm Một số nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ hóa sinh xử lý mơi trƣờng kể tới nhƣ sau: + Nghiên cứu xử lý bã thải dứa làm chất cho trình sản xuất axit; + Nghiên cứu sản xuất chế phẩm enzyme để xử lý bã sắn làm thức ăn chăn nuôi; + Sử dụng enzyme tận thu phế liệu nguyên liệu thuỷ sản có giá trị thấp; + Sử dụng enzyme trình xử lý rác thành phân bón vi sinh; + Sản xuất chế phẩm sinh học để xử lý ô nhiễm dầu CÂU HỎI ÔN TẬP PHẦN MỞ ĐẦU Câu Thế Hóa sinh học? Đối tƣợng, phƣơng pháp mục đích nghiên cứu Hóa sinh học gì? Câu Nêu thành tựu bật chuyên ngành Hóa sinh học? TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN MỞ ĐẦU Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng, Hoá sinh học - Nhà xuất Giáo dục, 2007 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học - Nhà xuất Giáo dục, 1998 Lê Ngọc Tú, Hố sinh cơng nghiệp - Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, 2002 http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/vinam01b.htm Robert, H.H.Principes of Biochemistry, 2nd, 1999 Réne, S Biotechnology I, II, III, 1993 Chương PROTEIN VÀ CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ CHỨA NITƠ Nội dung chƣơng: Chƣơng gồm có 04 phần giới thiệu kiến thức - Protein axit amin: giới thiệu axit amin - đơn phân cấu tạo nên phân tử protein, bậc cấu trúc tính chất phân tử protein; - Axit nucleic: giới thiệu cấu trúc phân tử axit nucleic (gồm AND, ARN) vai trò axit lĩnh vực di truyền sống hàng ngày; - Sinh tổng hợp protein: giới thiệu trình tổng hợp phân tử protein mối liên quan protein, ADN hình thái kiểu gen, kiểu hình, tính trạng sinh vật; - Chuyển hóa hợp chất protein, axit nucleic cơng nghệ mơi trƣờng Mục đích: cung cấp kiến thức thành phần cấu tạo nên phân tử protein, axit nucleic; vai trò hợp chất sống hàng ngày, công nghệ di truyền mơi trƣờng Bên cạnh đó, chƣơng giới thiệu axit amin - đơn phân cấu tạo nên phân tử protein Các kiến thức đƣợc ứng dụng chƣơng 1.1 PROTEIN VÀ AXIT AMIN [1, 2, 4] 1.1.1 Cấu trúc, tính chất phân loại protein a) Cấu trúc phân tử protein Thành phần nguyên tố protein Tất protein chứa nguyên tố C, H, O N Một số phân tử protein chứa lƣợng nhỏ S Tỷ lệ phần trăm nguyên tố phân tử protein đƣợc trình bày bảng 1.1 nhƣ sau: Bảng 1.1 Thành phần tỷ lệ nguyên tố phân tử protein Nguyên tố Tỷ lệ (%) C 50 - 55 H 6,5 - 7,3 O 21 - 24 N 15 - 18 S - 0,24 Ngoài nguyên tố trên, số protein chứa lƣợng nhỏ nguyên tố khác nhƣ: P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca… Đơn vị cấu tạo sở protein Axit amin cấu tử protein hợp chất hữu mạch thẳng mạch vòng mà phân tử có chứa nhóm amin (-NH2) nhóm cacboxyl (-COOH) Cơng thức cấu tạo tổng quát axit amin nhƣ sau: R ─ CH ─ COOH R ─ CH ─ COO│ │ NH2 NH3+ (1.1) Dạng khơng ion hóa Dạng ion lƣỡng cực R: đƣợc gọi mạch bên hay nhóm bên, phân tử axit amin khác gốc R Đa số phân tử protein đƣợc cấu tạo từ 20 L - α - axit amin amit tƣơng ứng Dựa vào đặc tính mạch bên ngƣời ta phân chia axit amin thƣờng gặp thành số nhóm nhƣ: + Axit monoamin monocacbolxyl: nhƣ glixin, L (+) alanin, L (-) lơxin, L (+) valin…; + Axit monoamin dicacbolxyl: L (-) aspartic, L (+) glutamic; + Axit diamin monocacbolxyl: L (+) lizin, L (+) arginin…; + Axit amin có chứa lƣu huỳnh: L (-) Xistein, L (-) Xistin, L (-) metionin…; + Amit protein gồm: asparagin, glutamin Bên cạnh axit amin phổ biến nêu phân tử protein cịn có số axit amin gặp, axit amin thƣờng dạng hiệu chỉnh axit amin thƣờng gặp nêu trình hiệu chỉnh thƣờng xảy sau chuỗi polypeptide đƣợc tổng hợp Có số axit amin khơng có phân tử protein nhƣng đƣợc tìm thấy thể sống nhƣ: ornitin xitrulin sản phẩm quan trọng trình trao đổi chất Ngồi ra, cịn có axit amin cần thiết hay axit amin không thay thế, tức axit amin mà thể ngƣời động vật tự tổng hợp đƣợc mà phải đƣa từ bên vào qua thức ăn Khi thiếu chí axit amin làm cho protein đƣợc tổng hợp protein bị phân giải dẫn đến cân protein âm Thƣờng có tám axit amin không thay là: valin, lơxin, izolơxin, metionin, treonin, phenylalanin, triptophan lyzin; với trẻ em thêm axit amin arginin histidin Hàm lƣợng axit amin không thay tỷ lệ chúng phân tử protein tiêu chuẩn quan trọng để đánh giá chất lƣợng protein Các mức cấu trúc phân tử protein Phân tử protein chứa nhiều chuỗi polypeptide khác hình thành cấu trúc nhiều bậc, có bốn loại cấu trúc chính:  Bậc một: quy định thành phần trình tự xếp gốc axit amin mạch polypeptide Cấu trúc đƣợc giữ vững nhờ liên kết peptide (liên kết đồng hóa trị) Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc bậc phân tử protein  Bậc hai: xếp thích hợp khơng gian chuỗi polypeptide tạo xoắn  gấp nếp  Hình 1.2 Hình ảnh cấu trúc bậc - xoắn  phân tử protein Hình 1.3 Hình ảnh cấu trúc bậc - gấp nếp  phân tử protein  Bậc ba: dạng cuộn chuỗi polypeptide khơng gian Hình 1.4 Hình ảnh cấu trúc bậc phân tử protein  Bậc bốn: nhiều chuỗi polypeptide cuộn lại không gian thành hình định Hình 1.5 Hình ảnh cấu trúc bậc phân tử protein Ngoài liên kết peptide chuỗi polypeptide cịn có liên kết hố học khác nhƣ liên kết hydro, liên kết disulfua (-S-S-) axit amin vị trí khác phân tử nhờ chuỗi polypeptide cuộn lại khơng gian thành hình dạng định b) Tính chất phân tử protein Protein thành phần thiếu tất thể sống Protein tảng cấu trúc chức thể sinh vật Tính chất protein phụ thuộc vào thành phần trình tự xếp gốc axit amin phân tử Sau số tính chất điển hình protein: Khối lượng hình dạng phân tử protein Protein có khối lƣợng phân tử (Mr) tƣơng đối lớn, từ 10.000 đến hàng trăm nghìn Da (Dalton, 1Da  1g/mol ) Các phân tử có dạng hình cầu (dạng hạt bầu dục) dạng sợi Các protein hình cầu tan nƣớc dung dịch muối lỗng, hoạt động mặt hóa học Thuộc nhóm có hầu hết Protein có hoạt tính xúc tác nhƣ: albumin, globulin Các protein hình sợi thƣờng trơ mặt hóa học, chủ yếu có chức học, thành phần colagen cấu tạo da, xƣơng, sụn, gân, răng… keratin tóc, lơng… Tính chất lưỡng tính protein Protein có tính chất lƣỡng tính nghĩa vừa có tính chất axit vừa có tính chất bazơ, phân tử protein có nhiều nhóm phân cực mạch bên (gốc R) axit amin Trạng thái tích điện nhóm tùy thuộc vào pH mơi trƣờng Vì phân tử axit amin vừa có nhóm amin vừa có nhóm cacboxyl nên dung dịch pH trung tính axit amin tồn chủ yếu dạng ion lƣỡng cực (chỉ 1% dạng trung hịa) Ở dạng ion lƣỡng cực, nhóm cacboxyl bị phân ly cịn nhóm amin bị proton hóa Tính chất kỵ nước protein Dựa vào độ kỵ nƣớc trung bình protein biết trƣớc đƣợc mức độ lắng dung dịch thủy phân từ protein biết trƣớc đƣợc vị trí protein màng hay bên ngồi màng phospholipit Có thể tính độ kỵ nƣớc trung bình protein từ thành phần axit amin Tính chất dung dịch keo protein, kết tủa protein Khi hòa tan protein tạo thành dung dịch keo Các phân tử keo có kích thƣớc khơng lớn, khơng qua màng bán thấm Tính chất đƣợc sử dụng để tinh protein phƣơng pháp thẩm tích Rưntgen Độ bền dung dịch keo protein phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ: tích điện phân tử protein, mức độ hydrat hóa, nhiệt độ… Khi thay đổi yếu tố này, ví dụ nhƣ làm trung hịa điện phân tử protein, loại bỏ lớp vỏ hydrat phân tử lớn protein kết tụ lại với tạo thành khối lớn, tách khỏi dung dịch đƣợc gọi kết tủa protein Sau protein bị kết tủa loại bỏ yếu tố gây kết tủa, protein lại tạo thành dung dịch keo bền nhƣ trƣớc khả Trƣờng hợp thứ gọi kết tủa thuận nghịch, trƣờng hợp thứ hai gọi kết tủa không thuận nghịch Sự biến tính protein Sự biến tính protein tƣơng protein bị biến đổi cấu hình bậc 2, 4, khơng bị phá hủy cấu trúc bậc kèm theo tính chất tự nhiên ban đầu bị dƣới tác dụng tác nhân vật lý (tia cực tím, sóng siêu âm…) hóa học (axit, kiềm mạnh, muối kim loại nặng ) Protein bị biến tính thƣờng thu đƣợc tính chất sau: + Độ hòa tan giảm làm lộ nhóm kỵ nƣớc; + Khả giữ nƣớc bị giảm; + Mất hoạt tính sinh học (mất tính chất enzyme hay tính chất miễn dịch); + Tăng độ nhạy công enzyme proteaza làm xuất hiện; liên kết peptide ứng với vùng tác dụng đặc hiệu enzyme; + Tăng độ nhớt nội tại; + Mất khả kết tinh Biến tính thuận nghịch không, thƣờng cầu nối disulfua bị phá hủy biến tính bất thuận nghịch Nhiệt độ tác nhân gây biến tính protein mạnh Tốc độ nhiều phản ứng hóa học thƣờng tăng gấp nhiệt độ tăng lên 100C, nhiên với khoảng tăng nhiệt độ tốc độ biến tính phân tử protein tăng lên khoảng 600 lần Điều chứng tỏ lƣợng liên kết làm bền cấu trúc bậc 2, protein yếu 6 Các phản ứng thường dùng để định tính, định lượng axit amin protein Dựa vào tính chất axit amin đơn vị cấu tạo sở phân tử protein axit amin liên kết với liên kết peptide để tạo thành chuỗi polypeptide khác nhau, phản ứng định tính, định lƣợng protein đƣợc thành nhóm sau: + Phản ứng liên kết peptide (phản ứng Biure) phản ứng đặc trƣng cho tất polypeptide protein: môi trƣờng kiềm mạnh liên kết peptide phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu tím đỏ, phức chất hấp thụ mạnh bƣớc sóng cực đại 540 nm đƣợc sử dụng rộng rãi để phát định lƣợng protein + Phản ứng đặc trƣng cho hay số gốc axit amin phân tử polypeptide protein - phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteau (phƣơng pháp Lowry): thuốc thử có chứa axit phosphomolipdic phosphovolframic Các chất mặt làm tăng độ nhạy phản ứng Biure, mặt khác phản ứng với gốc Tyr (Tirozin) Trp (Triptophan) phân tử protein tạo thành phức chất màu xanh da trời, hấp thụ bƣớc sóng cực đại 750 nm + Phản ứng nhóm α - amin tự đầu N chuỗi polypeptide gọi phản ứng ninhidrin: tất α - axit amin protein phản ứng với ninhidrin tạo thành hợp chất màu xanh tím, riêng iminoaxit nhƣ prolin tạo thành màu vàng Phản ứng nhạy, phát đến g đƣợc dùng nhiều sắc ký điện di Ngoài ra, dùng phƣơng pháp so màu, đo cƣờng độ màu phản ứng đo thể tích khí CO2; NH3 đƣợc tạo thành phản ứng, phƣơng pháp so màu đƣợc dùng nhiều + Bên cạnh phản ứng nhóm α - amin với foraldehyde thƣờng đƣợc dùng để đánh giá mức độ thủy phân protein c) Phân loại protein Để hình thành protein axit amin nối liền với qua liên kết peptide (liên kết cộng hoá trị) Liên kết (-CO-NH-) đƣợc tạo thành phản ứng kết hợp nhóm  cacboxyl nhóm amin với nhóm  - amin axit amin khác loại phân tử nƣớc Tùy số lƣợng axit amin liên kết với mà ta có dipeptide, tripeptide, tetrapeptotide, pentapeptide Từ phân tử có 15 liên kết peptide trở lên ta gọi polipeptide Polypeptide đƣợc gọi protein Có lúc protein đƣợc tạo thành vài polypeptide liên kết lại với Có 20 loại axit amin tham gia vào cấu trúc protein, số gốc axit amin lớn tạo đƣợc tới 2018 loại protein khác (hiện biết rõ cấu trúc chiều khoảng 100 loại protein) Do cấu trúc phức tạp đa dạng cấu trúc, chức protein nên việc phân loại chúng gặp nhiều khó khăn Để thuận lợi việc phân loại protein thƣờng dựa vào hình dạng, tính tan chức năng, thành phần hóa học protein Thực tế, protein đƣợc xếp loại theo hình dạng, theo cấu trúc theo chức gồm số dạng nhƣ: + Theo hình dạng protein đƣợc chia thành protein hình sợi protein hình cầu + Căn vào chức ta có protein phi hoạt tính (kiến tạo, dự trữ ) protein hoạt tính (xúc tác, vận tải, chuyển động, truyền xung thần kinh, điều hoà, bảo vệ ) + Theo cấu trúc, thành phần hóa học ta chia protein thành protein đơn giản protein phức tạp (protein kết hợp) Dƣới số protein đơn giản phức tạp thƣờng gặp: Protein đơn giản: dựa theo tính tan protein đƣợc phân thành nhóm nhỏ nhƣ sau  Albumin: tan nƣớc, bị kết tủa nồng độ muối (NH4)2SO4 cao (70 - 100% độ bão hịa) Các protein thuộc nhóm phổ biến tế bào động vật thực vật, chúng có khối lƣợng khác nhau, từ 12.000 - 170.000 Da, ví dụ nhƣ albumin lịng trắng trứng, albumin huyết thanh… Nang xác hình thức tồn Azotobacter, khơng phải bào tử Một nang xác bao bọc số tế bào bên Khuẩn lạc Azotobacter lúc non có màu trắng đục Khi già chuyển thành màu vàng lục màu nâu Hình 9.4 Hình ảnh tế bào khuẩn lạc Azotobacter sp Trong đất, đất lúa, thƣờng có phổ biến lồi Azotobacter sau: - Azotobacter chroococum: có khả di động lúc cịn non, già có khả hình thành nang xác Khuẩn lạc lúc già có sắc tố màu nâu màu đen, không khuyếch tán vào mơi trƣờng - Azotobacter beijerinckii: khơng có khả di động, có khả hình thành nang xác Khuẩn lạc lúc già có màu vàng nâu sáng, sắc tố không khuyếch tán vào môi trƣờng - Azotobacter vinelandii: có khả di động hình thành nang xác Khuẩn lạc màu lục huỳnh quang, sắc tố khuyếch tán vào mơi trƣờng - Azotobacter agilis: có khả di động, không tạo thành nang xác, khuẩn lạc màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố khuyếch tán vào môi trƣờng Azotobacter có khả đồng hố nhiều loại đƣờng khác nhau, sản phẩm phân giải xellulose Vì vậy, đất có bón phân xanh, rơm, rạ, rác tốt cho phát triển Azotobacter Sự phát triển khả cố định nitơ Azotobacter phụ thuộc nhiều vào hàm lƣợng photpho dễ tiêu mơi trƣờng Ngồi ra, canxi ngun tố vi lƣợng nhƣ B, Mo, Fe, Mn cần thiết Azotobacter Một vài nguyên tố phóng xạ có tác dụng kích thích sinh trƣởng Azotobacter Azotobacter thích hợp với pH = 7,2 - 8,2 song chúng phát triển đƣợc pH từ 4,5 - 9,0 Chúng thích hợp với nhiệt độ từ 25 đến 300C  Clostridium Clostridium đƣợc phát từ năm 1983, loại vi khuẩn kỵ khí sống tự đất Khác với Azotobacter có khả hình thành bào tử Lồi phổ biến đất Clostridium pasteuriamum có hình que ngắn, tế bào non có khả di động tiên mao Khi già khả di động Clostridium có khả đồng hoá nhiều nguồn cacbon khác nhƣ loại đƣờng, rƣợu, tinh bột Clostridium thuộc loại kỵ khí nên sản phẩm trao đổi chất thƣờng loại axit hữu cơ, butanol, etanol, axeton, sản phẩm chƣa đƣợc oxy hố hồn tồn P K nguyên tố cần thiết cho phát triển cố định nitơ Clostridium Ngoài ra, nguyên tố vi lƣợng nhƣ Mo, Co, Cu, Mn cần thiết Clostridium Clostridium có khả phát triển pH = 4,7 - 8,5 Bào tử chúng chịu đƣợc nhiệt độ cao, sống đƣợc nhiệt độ 800C Một số lồi cịn chịu đƣợc nhiệt độ 1000C 30 phút 190 Hình 9.5 Một số hình ảnh tế bào Clostridium sp Ngồi nhóm vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh với thực vật sống tự đất nhƣ nói trên, có số vi khuẩn có khả cố định nitơ sống bề mặt rễ ăn sâu vào lớp tổ chức bề mặt rễ số hoà thảo nhƣ lúa, ngơ, mía Ví dụ, loại vi khuẩn có dạng xoắn đƣợc phát từ năm 1974 thuộc chi Azospirllum Từ 1974 đến nay, Azospirllum đƣợc nghiên cứu nhiều giới Ở Việt Nam có nghiên cứu bƣớc đầu ứng dụng chế phẩm Azospirllum nhằm mục đích nâng cao sản lƣợng hồ thảo nói Ngồi nhóm vi khuẩn cố định nitơ, cịn có số lồi tảo đơn bào có khả cố định nitơ, ví dụ nhƣ tảo lam sống tự tảo lam sống cộng sinh bèo hoa dâu Các loài đóng góp khơng nhỏ vào q trình cố định nitơ khơng khí CÂU HỎI ƠN TẬP CHƢƠNG Câu Hãy nêu chu trình vịng tuần hồn nitơ vai trò vi sinh vật cố định đạm? Câu Hãy nêu chế chung trình amon hóa protein, ý nghĩa giai đoạn thực tiễn? Câu Hãy nêu chế q trình nitrat hóa, ý nghĩa giai đoạn thực tiễn? Câu Hãy nêu chế q trình phản nitrat hóa, ý nghĩa giai đoạn thực tiễn? TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƢƠNG Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học - Nhà xuất Giáo dục, 1998 Lê Xuân Phƣơng, Vi sinh vật học môi trƣờng - Đại học Bách khoa Đà Nẵng, 2005 Trần Cẩm Vân, Giáo trình Vi sinh vật đất - Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/vinam01b.htm Eugenia, J, G Sanchez, 200 Environmental Biotechnology, 2001 Principles and Application Rittmann, B E Environmental Biotechnology, 2001 Principles and Applications Robert, H.H.Principes of Biochemistry, 2nd, 1999 Tài liệu biên soạn phục vụ giảng dạy mơn Hóa sinh môi trƣờng Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội 191 PHẦN THÍ NGHIỆM THỰC HÀNH Nội dung phần 3: phần tập trung giới thiệu kiến thức thực hành phân tích số tiêu vi sinh môi trƣờng, bao gồm: - Các kỹ thuật gieo cây, định lƣợng vi sinh vật; - Kỹ thuật phân tích xác định E.coli; - Kỹ thuật phân tích xác định Coliform; Mục đích: Phần thực hành cung cấp kiến thức giúp sinh viên tiến hành làm thí nghiệm, phân tích xác định hai tiêu vi sinh phổ biến lĩnh vực môi trƣờng Bài KỸ THUẬT GIEO CẤY - PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƢỢNG VI SINH VẬT KỸ THUẬT GIEO CẤY VI SINH VẬT Mục đích: để quan sát hình thái, nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hố nhƣ định lƣợng phân lập vi sinh vật cần phải nuôi cấy chúng mơi trƣờng thích hợp (nguồn dinh dƣỡng, pH, nhiệt độ, độ ẩm…) 1.1 Định nghĩa Gieo cấy vi sinh vật đƣa sản phẩm có chứa vi sinh vật vào mơi trƣờng thích hợp để phát hiện, định lƣợng, nghiên cứu đặc tính sinh lý giữ giống vi sinh vật 1.2 Kỹ thuật gieo cấy a) Đối với vi sinh vật hiếu khí - Từ ống nghiệm sang ống nghiệm: có bốn cách sau + Trên bề mặt thạch nghiêng cấy đƣờng song song (///); + Cấy theo đƣờng zích zắc: + Cấy theo đƣờng chữ chi xoắn; + Hoặc cấy thành chấm điểm khác (      ) - Cấy vào hộp Petrie tuỳ theo mục đích nghiên cứu Hình 1.1 Hình ảnh minh họa kiểu cấy vi sinh vật đĩa petri b) Đối với sinh vật yếm khí - Cấy đâm sâu vào ống thạch đứng; - Cấy vào hộp Petri nuôi môi trƣờng chân không c) Yêu cầu cấy vi sinh vật: Dụng cụ thí nghiệm ngƣời thực phải tuyệt đối vô trùng, thao tác nhanh 1.3 Nuôi vi sinh vật a) Nhiệt độ: tuỳ theo yêu cầu nhiệt loại vi sinh vật - Vi sinh vật ƣa ấm: 20  370C; 192 - Vi sinh vật ƣa nóng: 50  600C; - Vi sinh vật ƣa lạnh: 10  150C b) Độ ẩm: Độ ẩm tối thiểu nấm mốc 15% vi khuẩn 30% c) Tính chất hơ hấp - Với sinh vật hiếu khí: ni bề mặt môi trƣờng đặc phải cung cấp khí ni chúng mơi trƣờng lỏng - Với sinh vật yếm khí dùng nhiều phƣơng pháp  Phƣơng pháp học: phƣơng pháp đơn giản, dễ làm + Cấy sâu vào môi trƣờng đặc, lỏng; + Cấy vào hộp petri sau đổ mơi trƣờng đặc nhiệt độ thích hợp vơ trùng vào đĩa  Phƣơng pháp lý học: cấy vi sinh vật ni bình chân khơng pipet Pasteur  Phƣơng pháp hoá học: dùng hoá chất để loại O2 khỏi môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật Ví dụ: + Pha dung dịch Pirogarol - kiềm (10%) tỷ lệ 1:1 + Pha dung dịch Pirogarol - bicacbonat tỷ lệ 1;1 (đựng bình hút ẩm để loại O2 khơng khí bình) + Thêm chất khử vào môi trƣờng nuôi cấy: glucoza (1-2%), fomiat - Na (0,30,5%)… 1.4 Quan sát phát triển vi sinh vật môi trƣờng nuôi cấy a) Trên môi trường đặc: vi sinh vật phát triển thành khuẩn lạc Ta phân biệt dạng khuẩn lạc nhƣ sau: - R: khuẩn lạc có bề mặt xù xì; - S: khuẩn lạc có bề mặt nhẵn bóng; - G: khuẩn lạc có bề mặt nhỏ li ti, mép khuẩn lạc nhẵn; - M: khuẩn lạc có bề mặt khơng định hình (nhày) b) Trên mơi trường lỏng: vi sinh vật phát triển làm đục mơi trƣờng, kéo màng bề mặt lắng đáy ống nghiệm Chúng làm cho mơi trƣờng thay đổi màu sắc, mùi vị, độ đục… PHÂN LẬP VI SINH VẬT 2.1 Định nghĩa Phân lập vi sinh vật tách chúng khỏi vật phẩm để nghiên cứu hình thái, tính chất chúng Tuỳ mức độ nghiên cứu phân lập canh trƣờng tập trung canh trƣờng khiết… 2.2 Phân lập canh trƣờng tập trung - Định nghĩa: Canh trƣờng tập trung canh trƣờng có hay vài loài vi sinh vật chiếm đa số Canh trƣờng thƣờng đƣợc dùng sản xuất, xử lý môi trƣờng… - Phƣơng pháp phân lập: Để phân lập canh trƣờng tập trung ngƣời ta sử dụng môi trƣờng chọn lọc, điều kiện ni cấy chọn lọc Ví dụ: Phân lập vi khuẩn hiếu khí ta dùng mơi trƣờng hiếu khí tổng số Phân lập nấm mốc ta dùng môi trƣờng Sabouraud… 2.3 Phân lập canh trƣờng khiết - Định nghĩa: canh trƣờng khiết canh trƣờng vi sinh vật đƣợc sinh từ tế bào ban đầu - Phƣơng pháp phân lập: Có thể dùng canh trƣờng tập trung để phân lập  Phƣơng pháp trực tiếp: dùng dụng cụ vi thao tác để tách tế bào vi sinh vật  Phƣơng pháp gián tiếp: cần pha loãng canh trƣờng có vi sinh vật cần phân lập Lấy lƣợng định cấy lên mơi trƣờng thích hợp 193 * Nuôi vi sinh vật để chúng phát triển thành khuẩn lạc Mỗi khuẩn lạc đƣợc sinh từ tế bào ban đầu Lặp lại ba lần để có canh trƣờng khiết * Có thể nhỏ vài giọt canh trƣờng lên phiến kính Quan sát kính hiển vi, tìm giọt có tế bào, dùng miếng giấy lọc nhỏ vô trùng thấm giọt canh trƣờng đặt vào hộp petri có mơi trƣờng thích hợp Nuôi cho tế bào phát triển thành khuẩn lạc ĐỊNH LƢỢNG VI SINH VẬT 3.1 Định nghĩa Xác định số vi sinh vật có vật phẩm nghiên cứu để kiểm tra chất lƣợng sản phẩm, vệ sinh sản xuất đánh giá mức độ ô nhiễm 3.2 Các bƣớc tiến hành Bước 1/ Lấy mẫu  Lấy mẫu trung bình;  Lấy mẫu theo quy định (số lƣợng, vị trí, thời gian…);  Dụng cụ lấy mẫu phải vơ trùng;  Phân tích sau lấy mẫu (sau 30’) Nếu để lâu phải giữ 050C nhƣng không Bước 2/ Định lượng vi sinh vật  Định lƣợng trực tiếp buồng đếm: đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật cách dàn mỏng chúng lƣới đếm tiêu chuẩn  Định lƣợng gián tiếp: cấy vi sinh vật vào mơi trƣờng thích hợp, ni cho chúng phát triển thành khuẩn lạc Mỗi khuẩn lạc đƣợc hình thành từ tế bào ban đầu PHẦN THỰC HÀNH 4.1 Cấy vi sinh vật - Cấy vi sinh vật mơi trƣờng lỏng (vi sinh vật hiếu khí, dùng ống Dulham) - Cấy vi sinh vật môi trƣờng đặc:  Ống nghiệm thạch đứng: đâm sâu vào trong;  Ống nghiệm thạch nghiêng: cấy thành đƣờng ziczăc;  Hộp petri: dùng que trang gạt mặt thạch 4.2 Phân lập định lƣợng vi sinh vật 1/ Phân lập vi sinh vật đất - Mẫu đất khô đƣợc nghiền nhỏ, cân lấy 1g - Cho 1g đất vào bình tam giác có 99ml H2O vơ trùng - Pha loãng chúng tới 10-12 cách lấy 0,1ml hỗn hợp pha lỗng vào ống nghiệm có 9,9ml nƣớc cất vô trùng Lặp lại nhƣ đến lần thứ - Lấy 0,1ml cấy vào hộp petri (làm nhƣ liên tục với hộp), trang - Ni nhiệt độ thích hợp để vi sinh vật phát triển thành khuẩn lạc, đếm số lƣợng tế bào có hộp tính trung bình Đây cách tính số lƣợng tế bào theo phƣơng pháp định lƣợng gián tiếp 2/ Phân lập vi sinh vật nước - Lấy 1ml nƣớc cần phân tích cho vào bình tam giác có 99ml nƣớc cất vơ trùng - Pha loãng bƣớc ống nghiệm với 9,9ml nƣớc cất vô trùng đến độ pha loãng 10-12 - Lấy 0,1ml cấy vào hộp petri (làm nhƣ liên tục với hộp), trang - Ni nhiệt độ thích hợp để vi sinh vật phát triển thành khuẩn lạc, đếm số lƣợng tế bào sau 48 có hộp tính trung bình 194 Hình 1.2 Cách pha lỗng cấy mẫu Cách tính số lƣợng tế bào vi sinh vật có 1g đất 1ml nƣớc: a X = f (tb/ml tb/g) b Trong đó: a - số khuẩn lạc có hộp () b - lƣợng dung dịch cấy vào hộp petri (0,1ml 0,1g) f - hệ số pha loãng X - số lƣợng tế bào 3/ Phân lập vi sinh vật có khơng khí - Phân lập theo phƣơng pháp gián tiếp Omelanski: theo Omelanski “ số lƣợng vi sinh vật khơng khí lắng vào 100m2 bề mặt mơi trƣờng thời gian phút tƣơng đƣơng với số lƣợng tế bào có 10 lít khơng khí” - Các bƣớc tiến hành:  Mở nắp hộp petri có môi trƣờng tƣơng ứng thời gian phút;  Đậy lại đem ni cấy nhiệt độ thích hợp để chúng phát triển thành khuẩn lạc Đếm số khuẩn lạc có hộp 4.a.105 Cách tính: X= (tb/l)  D Trong đó: X - số lƣợng tế bào/lít khơng khí a - số lƣợng tế bào vi sinh vật có hộp petri D - đƣờng kính hộp petri (cm) Chú ý: thực tế, tùy thuộc vào chất mẫu cần phân tích mà điều chỉnh nồng độ pha lỗng mẫu cho hợp lý BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG VI SINH VẬT 195 Bài ĐỊNH LƢỢNG TRỰC KHUẨN COLI - COLIFORM KHÁI NIỆM CHUNG - Vi khuẩn coli tồn nƣớc, nƣớc thải hay vật phẩm có nguồn gốc khác - Theo nguyên tắc lý thuyết, chúng đƣợc chia làm hai loại: + Fecal - coli: có nguồn gốc từ phân (ngƣời, động vật, cá, chim…); + Nonfecalcoli: có nguồn gốc khác (từ đất, cỏ, nƣớc…) - Fecal - coli lên men đƣờng (glucose, lactose, pepton…) nhiệt độ 43 - 460C sinh gồm khí H2S, NH3, indo… Non fecalcoli không sinh điều kiện - Fecalcoli (Escherichia coli) trực khuẩn đƣờng ruột Chúng khu trú đại tràng, ln có phân ngƣời theo phân ngồi nhiễm vào đất, nƣớc… Sự có mặt chúng chứng tỏ nƣớc bị nhiễm phân Điều phản ánh tình trạng vệ sinh nƣớc Escherichia coli lên men glucose hay lactose 43 - 460C 24 tạo axit sinh phần lớn khí H2S, NH3, indol… - Khi nƣớc có trực khuẩn Coli có vi sinh vật gây bệnh khác sinh sống đƣờng ruột nhƣ: tả (Vibrio choleras), lỵ (Shigella), thƣơng hàn (Samonella)… Bacterium coli tên chung nhóm trực khuẩn ngắn, khơng sinh nha bào, nhuộm màu Gram âm, hầu hết chuyển động, hơ hấp hiếu khí hay tuỳ tiện - E.coli phát triển mơi trƣờng Endo cho khuẩn lạc có màu đỏ ánh kim - Để biểu thị độ nhiễm bẩn nƣớc ta dùng khái niệm: + Chỉ số Coli (Coli Index): số tế bào coli có lít nƣớc; + Chuẩn độ Coli (Colitre): số ml nƣớc có tế bào coli Ví dụ: Chỉ số Coli nƣớc uống chuẩn độ Coli 250 Chuẩn độ Coli nhỏ số Coli lớn, nƣớc uống bị nhiễm bẩn nặng Một thuật ngữ khác đƣợc dùng để đánh giá độ nƣớc, số MPN (Most Proable Number) - số phát tán Coli hay số đếm có xác xuất lớn 100 ml nƣớc Định lƣợng E.coli phƣơng pháp nhiều ống với bảng số MPN 2.1 Nguyên tắc Dựa khả chịu đựng phát triển nhiệt độ 430C 24h, lên men đƣờng lactose sinh khí E.coli với bảng thống kê số MPN 2.2 Cách tiến hành a) Lấy mẫu  Dùng bình 500ml vơ trùng lấy mẫu trung bình nơi cần kiểm tra Khi lấy mẫu mở nút vô trùng, không đƣợc mở trƣớc tránh vi sinh vật mơi trƣịng bên ngồi lọt vào  Trình tự lấy mẫu nước bề mặt, nước thải: ghi ký hiệu lên thành bình nắp nút Mở nút lọ giữ nút tay không để miệng nút chạm vào da tay vật dụng xung quanh Tay cho lọ vào mẫu nƣớc (ao, hồ, sông) định lấy, để nƣớc từ từ tràn đầy lọ Đậy nút, xốy chặt, khơng để giọt nƣớc tay rơi vào lọ (tráng rửa bình/lọ ba lần trƣớc lấy mẫu)  Trình tự lấy mẫu nước máy: ghi ký hiệu lên thành bình nắp kín Mở vòi để nƣớc chảy mạnh vòng phút nhằm loại bỏ vi sinh vật dính bên vịi Sau vặn nhỏ để dịng nƣớc chảy Sau vặn nhỏ để dịng nƣớc chảy chậm, mở lọ đựng mẫu, giữ nút tay Khéo léo hứng nƣớc đầy lọ, đậy nút xoáy chặt  Bảo quản mẫu: Mẫu lấy xong cần phân tích ngay, chƣa phân tích đƣợc cần giữ lạnh sâu tủ lạnh < 40C không 24h Trong trình vận chuyển cần để nơi mát mẻ, tránh làm nóng nƣớc lọ làm cho số lƣợng vi sinh vật mẫu thay đổi 196 b) Pha lỗng: tuỳ theo nhận định tính chất nƣớc: đƣợc xử lý hay chƣa xử lý, nƣớc nhà máy lọc, nƣớc ao hồ sông suối nƣớc thải… mà định độ pha loãng cần thiết cho đảm bảo độ xác phân tích Hình 2.1 Sơ đồ cấy mẫu nƣớc vào loại mơi trƣờng c) Tiến hành phân tích - Chuẩn bị môi trƣờng: môi trƣờng cần đƣợc trùng 1210C/15p chờ cho nguội lấy ống ra, môi trƣờng bao gồm: + Muối sinh lý để pha loãng mẫu; + Ống nghiệm có chứa mơi trƣờng Lactose mơi trƣịng Kesler 4,9 ml 9ml Trong ống nghiệm có chứa ống Dulham úp ngƣợc xuống dƣới đáy ống nghiệm - Sau trùng, lấy ống nghiệm hạ nhiệt độ đến 28 - 300C cấy mẫu vào môi trƣờng với nồng độ khác Một dãy ống với độ pha loãng khác đƣợc lựa chọn tùy thuộc vào tính chất mẫu yêu cầu phân tích Ví dụ: Dãy A - 3(5) ống x 1ml Dãy B - 3(5) ống x 0,1ml Dãy C - 3(5) ống x 0,01ml - Sau cấy xong đƣa vào tủ ẩm nuôi 430C/24h đọc kết d) Cách tính - Những ống lên men sinh ống Dulham đƣợc đánh dấu dƣơng tính (ống có sinh ống lên bề mặt dung dịch ống nghiệm sinh khí) Kkết đƣợc tính từ ống có nồng độ pha lỗng so sánh tra bảng số MPN - Ví dụ: Khi phân tích nƣớc thải lựa chọn làm lặp lại với dãy ống nghiệm, nồng độ pha loãng cao 0,0 Kết thu đƣợc nhƣ sau: + Dãy A (1ml) có ống dƣơng tính; + Dãy B (0,1ml) có ống dƣơng tính; + Dãy C (0,01ml) có ống dƣơng tính Dãy số tra bảng phụ lục 3-2-1, tra dãy số bảng MPN/100ml có kết tƣơng ứng 15 Vậy số Colitre theo MPN tính đƣợc là: 15 x 102 = 1500 (nhân với nồng độ pha loãng cao nhất) - Để khẳng định cách xác E.coli, lấy 0,1ml dịch ni cấy ống dƣơng tính (có sinh hơi) cấy vào môi trƣờng Endo Nuôi 370C/ 18-24h Nếu bề mặt môi trƣờng xuất khuẩn lạc màu đỏ hồng có ánh kim kết luận có E.coli 197 YÊU CẦU ĐỐI VỚI PHẦN THỰC HÀNH Sinh viên phải tham gia đầy đủ buổi thực hành; Làm báo cáo sau buổi TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN Trần Linh Thƣớc, Phƣơng pháp phân tích vi sinh vật, Nhà xuất Giáo dục, 2008 Tài liệu biên soạn phục vụ giảng dạy mơn Hóa sinh mơi trƣờng Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội TCVN 6848 - 2007 TCVN 4882 – 2007 198 PHỤ LỤC: THÀNH PHẦN CÁC MƠI TRƢỜNG CƠ BẢN Mơi trƣờng Endo Bảng Thành phần môi trƣờng Endo Thành phần Số lƣợng (g) Pepton 10 K2HPO4 2.5 Lactose 10 Na2SO3 3.3 Fuchsin bazơ 0.3 Thạch agar 20 Sau cân xong thành phần môi trƣờng, pha tất chất với 01 lít nƣớc cất, điều chỉnh pH = 7.4  0.2 đem khử trùng (hấp trùng) 1210C/15 - 20’, để nhiệt độ giảm khoảng 60 - 700C đổ đĩa petri Cấy mẫu xong, ủ ấm 370/24h, sau đọc kết Mơi trƣờng dùng để phát E.coli coliform Canh thang Lactose Bảng Thành phần môi trƣờng Lactose Thành phần Số lƣợng (g) Pepton 10 Lactose (C12H22O11 H2O) 10 Mật bị khơ Lục sáng 0,0133 (Brilliant green) Nƣớc lít Hịa tan thành phần nƣớc điều chỉnh pH = 7,0 ± 0,2, phân phối vào ống nghiệm ống 9ml, đem hấp trùng 1210/15-20 Môi trƣờng dùng để nuôi cấy phát coliform Cách pha số dung dịch thuốc thử 3.1 Thuốc thử xitocrom oxydase  Tetramethyl - P - Phenilencediamin: 1g  Cồn isoamil: 100 ml 3.2 Thuốc thử Kovac’s  Paradimethylamino benzalđehie: 5g  Cồn isoamil: 75 ml  Axit HCl đậm dặc: 25 ml Hoà 5g paradimethylamino benzalđehie vào 75ml cồn isoamil Sau nhỏ từ từ 25ml HCl đậm đặc vào 3.3 Dung dịch axit sulfanilic  Axit sulfanilic: 0,8ml  Axit axetic 5N: 100ml Trộn đều, lọc dung dịch bảo quản sử dụng không tháng 199 TÀI LIỆU THAM KHẢO Kiều Hữu Ảnh, Vi sinh vật học công nghiệp - Nhà xuất Giáo dục, 1999 Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng, Hoá sinh học - Nhà xuất Giáo dục, 2007 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học - Nhà xuất Giáo dục, 1998 Lƣơng Đức Phẩm, Xử lý chất thải biện pháp sinh học - Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, 2004 Lê Xuân Phƣơng, Vi sinh vật học môi trƣờng - Đại học Bách khoa Đà Nẵng, 2005 Vũ Trung Tạng, Cơ sở sinh thái học - Nhà xuất Giáo dục, 1998 Trần Thị Thanh, Công nghệ vi sinh - Nhà xuất Giáo dục, 2002 Lê Ngọc Tú, Hố sinh cơng nghiệp - Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, 2002 Trần Cẩm Vân, Giáo trình sở vi sinh vật học mơi trƣờng - Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên 10 Trần Cẩm Vân, Giáo trình Vi sinh vật đất - Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên 11 http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/vinam01b.htm 12 Trần Linh Thƣớc, Phƣơng pháp phân tích vi sinh vật, Nhà xuất Giáo dục, 2008 13 Tài liệu biên soạn phục vụ giảng dạy mơn Hóa sinh mơi trƣờng Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội 14 TCVN 6848 - 2007 15 TCVN 4882 - 2007 16 Crites, R 1997 Small and Decentralized Wastewater Management Systems 17 Eugenia, J, G Sanchez, 200 Environmental Biotechnology, 2001 Principles and Application 18 Bitton, G, 2001 Wastewater Microbiology 19 Syed, R Qasim Wastewater Treatment Plans Planning, Design and Opration 1997 20 Rittmann, B E Environmental Biotechnology, 2001 Principles and Applications 21 Robert, H.H.Principes of Biochemistry, 2nd, 1999 22 Réne, S Biotechnology I, II, III, 1993 200 MỤC LỤC PHẦN HÓA SINH MÔI TRƢỜNG MỞ ĐẦU CÂU HỎI ÔN TẬP PHẦN MỞ ĐẦU TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN MỞ ĐẦU Chương PROTEIN VÀ CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ CHỨA NITƠ 1.1 PROTEIN VÀ AXIT AMIN [1, 2, 4] 1.1.1 Cấu trúc, tính chất phân loại protein 1.1.2 Axit amin đặc trƣng axit amin 1.1.3 Sự phân loại hợp chất hữu có liên quan môi trƣờng công nghệ 1.2 AXIT NUCLEIC [2, 4, 5, 6, 7] 10 1.2.1 Thành phần hoá học, cấu trúc tính chất axit nucleic 10 1.3 SINH TỔNG HỢP PROTEIN [2, 4, 5, 6, 7] 14 1.3.1 ADN mã di truyền 14 1.3.2 Sự phiên mã (transcription) 15 1.3.3 Sự dịch mã (translation) 15 1.4 SỰ CHUYỂN HÓA PROTEIN VÀ AXIT NUCLEIC TRONG MÔI TRƢỜNG [3, 4, 5] 16 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 17 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƢƠNG 17 Chương ENZYME 18 2.1 KHÁI NIỆM, NGUỒN GỐC VÀ TÍNH CHẤT CỦA ENZYME [1, 2, 4, 6, 7] 18 2.1.1 Khái niệm enzyme 18 2.1.2 Cấu trúc enzyme 19 2.1.3 Tính chất enzyme 24 2.2 ĐỘNG HỌC ENZYME [1, 2, 4, 6, 7] 29 2.2.1 Hằng số Michaelis - Menten 29 2.2.2 Ý nghĩa 31 2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘNG XÖC TÁC CỦA ENZYME [1, 2, 3, 4, 6, 7] 31 2.3.1 Ảnh hƣởng E0 - nồng độ enzyme ban đầu 31 2.3.2 Ảnh hƣởng nồng độ chất - [S] 32 2.3.4 Ảnh hƣởng pH 34 2.3.5 Ảnh hƣởng chất hoạt hóa 34 2.3.6 Ảnh hƣởng chất kìm hãm (ức chế) tới hoạt động enzyme 35 2.4 CÁCH GỌI TÊN VÀ PHÂN LOẠI ENZYME [1, 2, 4, 5, 6, 7] 40 2.4.1 Cách gọi tên nhận dạng enzyme 40 2.4.2 Phân loại tên theo nhóm chức nhóm 41 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƢƠNG 42 Chương CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ KHÔNG CHỨA NITƠ 44 3.1 GLUXIT VÀ CÁC HỢP CHẤT GLUXIT [3, 4, 5] 44 3.1.1 Gluxit đơn giản 44 3.1.2 Các gluxit phức tạp [4, 5-10] 52 3.2 CÁC CHẤT HOẠT ĐỘNG SINH HỌC KHÁC [1, 2, 4] 62 3.2.1 Chất màu 62 3.2.2 Vitamin 62 3.2.3 Hoocmon 63 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƢƠNG 64 Chương QUÁ TRÌNH OXY HOÁ KHỬ SINH HỌC VÀ 65 VAI TRÕ CỦA CHU TRÌNH KREBS 65 201 4.1 BẢN CHẤT, Ý NGHĨA VÀ CƠ CHẾ CỦA Q TRÌNH OXY HĨA KHỬ SINH HỌC [1 4] 65 4.1.1 Bản chất ý nghĩa trình oxy hóa khử sinh học 65 4.1.2 Cơ chế trình oxy hóa khử sinh học 66 4.2 CÁC DẠNG PHẢN ỨNG OXY HÓA KHỬ SINH HỌC [1 - 4] 68 4.2.1 Oxy hóa hoạt hóa oxy 68 4.2.2 Oxy hóa khử hyđro hóa 68 4.2.3 Oxy hóa nhƣờng nhận điện tử thông thƣờng 68 4.3 ENZYME OXY HÓA KHỬ THƢỜNG GẶP [3] 69 4.3.1 Những đặc trƣng enzyme oxy hóa khử 69 4.3.2 Một số enzyme oxy hóa khử quan trọng công nghệ môi trƣờng 69 4.4 CHU TRÌNH KREBS VÀ Ý NGHĨA CỦA SỰ OXY HĨA TRONG CHU TRÌNH KREBS [1 - 4] 71 4.4.1 Nguyên liệu điều kiện cho q trình oxy hóa 71 4.4.2 Sự oxy hóa sinh học chất hữu (oxy hóa gluxit, lipit, protein) 72 4.4.3 Sự khác biệt q trình oxy hóa khử sinh học q trình oxy hóa khử thơng thƣờng 74 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƢƠNG 75 PHẦN VI SINH MÔI TRƢỜNG 76 Chương TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT 76 5.1 VI SINH VẬT TRONG TỰ NHIÊN VÀ VAI TRÕ CỦA CHƯNG TRONG MƠI TRƢỜNG [1, 2, 3, 5] 76 5.1.1 Khái niệm, lịch sử phát triển vi sinh vật học 76 5.1.2 Đặc điểm chung vi sinh vật 78 5.1.3 Vị trí vi sinh vật sinh giới 79 5.1.4 Vai trò vi sinh vật tự nhiên bảo vệ môi trƣờng 80 5.2 PHÂN BỐ CỦA VI SINH VẬT TRONG MÔI TRƢỜNG [4, 6, 7] 81 5.2.1 Vi sinh vật đất 81 5.2.2 Vi sinh vật nƣớc 85 5.2.3 Vi sinh vật khơng khí 90 5.3 MỘT SỐ BỆNH DO VI SINH VẬT GÂY RA [2, 4, 5, 6, 7] 92 5.3.1 Nguyên nhân vấn đề ô nhiễm 92 5.3.2 Nhiễm trùng khả chống đỡ thể 93 5.4.3 Một số vi sinh vật gây bệnh 96 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 104 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƢƠNG 105 Chương CÁC QUÁ TRÌNH SINH LÝ CƠ BẢN CỦA VI SINH VẬT VÀ ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH 106 6.1 ĐẶC TÍNH SINH LÝ CỦA VI SINH VẬT [1, 3, 4] 106 6.1.1 Cơ chế vận chuyển thức ăn vào tế bào sinh vật 106 6.1.2 Trao đổi chất trao đổi lƣợng (khái niệm chung) 107 6.1.3 Thành phần hoá học tế bào vi sinh vật 108 6.1.4 Quá trình dinh dƣỡng vi sinh vật 111 6.1.5 Q trình hơ hấp vi sinh vật 116 6.2 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH TỚI TRAO ĐỔI CHẤT CỦA VI SINH VẬT [1, 2] 118 6.2.1 Ảnh hƣởng yếu tố vật lý 118 6.2.2 Ảnh hƣởng yếu tố hoá học 120 6.2.3 Ảnh hƣởng yếu tố sinh học 123 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 123 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƢƠNG 123 202 Chương ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA MỘT SỐ NHÓM VI SINH VẬT CHÍNH ỨNG DỤNG TRONG CƠNG NGHỆ MƠI TRƢỜNG 124 7.1 NHÓM VI KHUẨN [1, 3, 7, 9, 12] 124 7.1.1 Đặc điểm chung 124 7.1.2 Hình thái, kích thƣớc cấu tạo 124 7.1.3 Đặc điểm sinh sản vi khuẩn 131 7.1.4 Vai trị vi khuẩn mơi trƣờng 132 7.2 NHÓM VI NẤM [1, 3, 7, 9, 12] 132 7.2.1 Hình dạng, kích thƣớc cấu tạo nhóm vi nấm: Nấm men, nấm mốc 132 7.2.2 Một số tính chất đặc trƣng vi nấm 136 7.2.3 Vai trò vi nấm môi trƣờng 140 7.3 NHÓM VI TẢO [1, 3, 7, - 12] 141 7.3.1 Hình dạng, kích thƣớc cấu tạo vi tảo 141 7.3.2 Tính chất đặc trƣng vi tảo 143 7.3.3 Vai trò giá trị dinh dƣỡng tảo 143 7.3.4 Quang hợp tảo trình tự làm nƣớc mặt 144 7.4 NGUYÊN SINH VẬT [1 - 3, - 12] 145 7.4.1 Hình dạng, cấu tạo nguyên sinh vật 145 7.4.2 Đặc tính vai trị nguyên sinh vật xử lý nƣớc thải 146 7.5 VIRUS [1 - 3, 6, 7, 13] 149 7.5.1 Hình dạng - kích thƣớc cấu tạo virus 150 7.5.2 Quá trình hoạt động virus tế bào 151 7.6 XẠ KHUẨN [1, 3, 7, 9, 12] 155 7.6.1 Đặc điểm chung 155 7.6.2 Hình thái kích thƣớc 155 7.6.3 Cấu tạo tế bào 156 7.6.4 Sinh sản 156 7.6.5 Vai trò xạ khuẩn môi trƣờng 157 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 157 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƢƠNG 157 Chương Q TRÌNH CHYỂN HĨA CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ 159 KHÔNG CHỨA NITƠ NHỜ VI SINH VẬT 159 8.1 QUÁ TRÌNH CHUYỂN HÓA TỔNG QUÁT CÁC HỢP CHẤT GLUXIT [1 - 14] 159 8.1.1 Đặc trƣng chung trình chuyển hóa hợp chất gluxit 159 8.1.2 Các q trình phân giải yếm khí gluxit 160 8.1.3 Các q trình phân giải hiếu khí gluxit chất trung gian từ gluxit 169 8.2 SỰ CHUYỂN HÓA CÁC HỢP CHẤT PECTIN VÀ XELLULOSE [1 - 14] 172 8.2.1 Sự chuyển hóa pectin 172 8.2.2 Sự chuyển hóa hợp chất xellulose 173 8.3 SỰ CHUYỂN HÓA CÁC HYDROCACBUA [1 - 14] 174 8.3.1 Sự oxy hóa hydro 175 8.3.2 Sự oxy hóa hydrocacbua 175 8.4 SỰ CHUYỂN HÓA LIPIT VÀ AXIT BÉO [1 - 14] 176 8.4.1 Sự hóa lipit 176 8.4.2 Sự oxy hóa lipit lƣợng hóa sinh 176 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 177 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƢƠNG 178 Chương SỰ PHÂN GIẢI CÁC CHẤT HỮU CƠ CÓ CHỨA NITƠ 179 NHỜ VI SINH VẬT 179 9.1 Ý NGHĨA CỦA CHU TRÌNH NITƠ TRONG TỰ NHIÊN [1 - 8] 179 9.1.1 Ý nghĩa 179 9.1.2 Vai trò vi sinh vật phân hủy chất đạm 179 9.2 QUÁ TRÌNH AMON HĨA [1 - 8] 180 203 9.2.1 Q trình amon hố ure 180 9.2.2 Sự amơn hố protein 180 9.3 QUÁ TRÌNH NITRAT HÓA [1 - 8] 182 9.3.1 Giai đoạn nitrit hoá 182 9.3.2 Giai đoạn nitrat hoá 183 9.4 QUÁ TRÌNH PHẢN NITRAT HÓA [1 - 8] 183 9.4.1 Phản nitrat hóa trực tiếp 183 9.4.2 Phản nitrat hóa gián tiếp 184 9.4.3 Tác nhân sinh học trình 184 9.5 Q TRÌNH CĨ ĐỊNH NITƠ PHÂN TỬ [1 - 8] 184 CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 191 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƢƠNG 191 PHẦN THÍ NGHIỆM THỰC HÀNH 192 Bài KỸ THUẬT GIEO CẤY - PHÂN LẬP VÀ 192 ĐỊNH LƢỢNG VI SINH VẬT 192 Bài ĐỊNH LƢỢNG TRỰC KHUẨN COLI – COLIFORM 196 YÊU CẦU ĐỐI VỚI PHẦN THỰC HÀNH 198 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN 198 PHỤ LỤC: THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG CƠ BẢN 199 TÀI LIỆU THAM KHẢO 200 204 ... lượng hóa sinh học Trong phần Vi sinh mơi trường, giáo trình đề cập đến đặc điểm vi sinh vật trình trao đổi chất, sinh trưởng vi sinh vật mơi trường; nhóm vi sinh vật mơi trường, vai trị vi sinh. ..GIÁO TRÌNH VI HĨA SINH MƠI TRƯỜNG HƯỚNG TỚI KỶ NIỆM 50 NĂM THÀNH LẬP TRƯỜNG ĐẠI MỎ - ĐỊA CHẤT LỜI NĨI ĐẦU Giáo trình ? ?Vi Hóa sinh mơi trường? ?? giới thiệu nội dung Hóa sinh mơi trường Vi sinh môi. .. vật q trình chuyển hóa nhờ vi sinh vật vi? ??c phân giải hợp chất hữu chứa nitơ khơng chứa nitơ Phần thí nghiệm thực hành, giáo trình giới thiệu số thí nghiệm Hóa sinh Vi sinh; hóa chất, mơi trường