Mục tiêu của nghiên cứu này là phân lập, tuyển chọn nấm men từ các loại trái cây địa phương và thử nghiệm lên men dịch xoài. 16 chủng nấm men đã được phân lập từ các mẫu trái cây lên men tự nhiên, trong đó nghiên cứu tuyển chọn được hai chủng N11 và N23 có khả năng chịu được nồng độ đường 25%w/v, nồng độ cồn 8%v/v và có khả năng kết lắng tốt.
Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 3/2017 THÔNG BÁO KHOA HỌC PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN NẤM MEN TỪ TRÁI CÂY ĐỊA PHƯƠNG VÀ THỬ NGHIỆM LÊN MEN DỊCH XOÀI ISOLATION, SELECTION OF YEASTS ASSOCIATED WITH LOCAL FRUITS AND FERMENTATION OF MANGO JUICE Nguyễn Thị Thanh Hải1, Đỗ Thị Ánh Hòa2 Ngày nhận bài: 19/7/2016; Ngày phản biện thơng qua: 15/8/2017; Ngày duyệt đăng: 25/9/2017 TĨM TẮT Sản phẩm nước trái lên men phát triển mạnh thị trường Việt Nam Việc sử dụng chủng nấm men phù hợp trình lên men nước trái vấn đề cần quan tâm Mục tiêu nghiên cứu phân lập, tuyển chọn nấm men từ loại trái địa phương thử nghiệm lên men dịch xoài 16 chủng nấm men phân lập từ mẫu trái lên men tự nhiên, nghiên cứu tuyển chọn hai chủng N11 N23 có khả chịu nồng độ đường 25%w/v, nồng độ cồn 8%v/v có khả kết lắng tốt Hai chủng tiến hành thử nghiệm lên men dịch xoài cho dịch lên men có nồng độ cồn tương ứng 4,7%v/v 4,57%v/v Kết qủa định danh giải trình tự gen 28S rRNA cho thấy chủng tuyển chọn Saccharomyces cerevisiae với độ tương đồng 99% Chủng nấm men tuyển chọn góp phần nâng cao giá trị ổn định chất lượng sản phẩm, thúc đẩy ngành sản xuất đồ uống trái lên men có độ cồn thấp phát triển Từ khóa: 28S rRNA, dịch xồi lên men, nấm men, Saccharomyces cerevisiae ABSTRACT Fermented fruit juice products are growing strongly in Vietnam market The proper use of yeast strains during fermentation of juice should be considered Isolation, selection of yeasts associated with local fruits and fermentation on mango juice have been investigated There were 16 strains of yeast isolated from natural fermented fruit samples and two selected strains are N11 and N23 They can tolerate with glucose concentration of 25% w/v, alcohol content of 8% v/v and can form aggregates These two strains were used to ferment mango juice, which produced fermented liquids with alcohol contents of 4,7% v/v and 4,57% v/v, respectively The results from the sequencing of the 28S rRNA gene showed that both selected strains were Saccharomyces cerevisiae species with an identity of 99% The selected yeasts contribute to enhance the value of products, to stabilize the quality and to promote the development of the fermented fruit drinks industry with low alcohol content Keywords: 28S rRNA, fermented mango juice, Saccharomyces cerevisiae, yeast I ĐẶT VẤN ĐỀ Hệ vi sinh vật tham gia trình lên men trái tự nhiên phức tạp nên thường cho độ cồn không cao, dễ bị nhiễm tạp, chất lượng rượu đảm bảo Cơng nghiệp lên men đại xây dựng dựa việc sử dụng chủng nấm men tuyển chọn có độ tin cậy an toàn, khả lên men tốt, Viện Công nghệ Sinh học Môi trường, Trường Đại học Nha Trang Trung tâm Thí nghiệm Thực hành, Trường Đại học Nha Trang TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản góp phần ổn định chất lượng sản phẩm tạo [1], [6], [7] Do đó, chủng nấm men sử dụng phổ biến công nghiệp nước lên men giới [9], [13] Các loài chủng nấm men với đặc tính khác tạo thành chất dễ bay có thành phần tỷ lệ khác sản phẩm lên men [14] Nhiều nghiên cứu cho thấy, chủng Saccharomyces cerevisiae có tính chất sinh hóa đặc trưng tuyển chọn dùng để sản xuất rượu vang từ trái có sẵn địa phương với cơng nghệ thích ứng thực đơn giản, rẻ tiền [1], [4], [9] Xoài đối tượng sản xuất rượu vang với chất lượng tương tự rượu vang nho [6], [11] Tuy nhiên, có thơng tin sản xuất rượu vang xoài, đặc biệt sản xuất rượu vang phù hợp giống xoài địa phương với chủng nấm men [12] Ở Việt Nam có nghiên cứu sử dụng chủng nấm men bánh mỳ Saccharomyces cerevisiae (Pháp) q trình lên men rượu vang xồi [2] II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thu thập mẫu trái Mẫu trái (dâu, nho, xoài, vải, nhãn) khơng có chất kích thích chất phịng trừ sâu bệnh thu nhận nhà vườn thuộc tỉnh Ninh Thuận, Khánh Hòa Lâm Đồng Các mẫu trái sau thu nhận làm dập túi nilon vô trùng, ủ lên men tự nhiên giữ làm nguồn phân lập nấm men Trái có vỏ cứng loại bỏ vỏ vô trùng, tránh tạp nhiễm sau đem làm dập Mẫu sau tuần lên men bảo quản 40C để tiến hành phân lập Phân lập làm chủng nấm men Chủng nấm men phân lập môi trường YPG (YPG: yeast extract peptone glucose medium) YPG có bổ sung g/L tartaric acid, 30 mg/mL chloramphenicol Các mơi trường sử dụng thí nghiệm mơi trường Merck (Đức) 10 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Số 3/2017 Lấy 1g mẫu trái lên men pha lỗng, cấy trang mơi trường YPG, ủ 300C 24 - 48 Sau ủ, chọn khuẩn lạc điển hình cấy ria sang mơi trường YPG có bổ sung chloramphenicol 30 mg/l mơi trường ủ điều kiện Khi khuẩn lạc phát triển tốt, cấy chuyển ống thạch nghiêng YPG bảo quản 40C chuẩn bị cho nghiên cứu [8], [9] Tuyển chọn chủng nấm men 3.1 Thí nghiệm kiểm tra khả chịu nồng độ đường chủng phân lập Chủng phân lập thử nghiệm cách ni cấy mật độ bình ni cấy chứa canh YPG bổ sung glucose với nồng độ 15%, 20%, 25%, 30% (w/v) 300C 48 giờ, đo mật độ quang OD540nm so sánh khả chịu nồng độ đường thử nghiệm chủng phân lập Việc tăng mật độ quang học bình ni cấy ghi nhận chứng phát triển Nồng độ đường mà tăng trưởng nấm men bị ức chế đánh giá khả chịu đựng đường nấm men [13] 3.2 Thí nghiệm kiểm tra khả chịu nồng độ cồn Chủng phân lập thử nghiệm cách ni cấy mật độ bình nuôi cấy chứa canh YPG bổ sung ethanol tinh khiết với nồng độ tương ứng 0%, 4%, 6%, 8%, 10% (v/v) 300C 48 tương tự xác định OD540nm Nồng độ rượu sinh trưởng nấm men bị ức chế đánh giá khả chịu đựng ethanol nấm men [5], [13] 3.3 Thí nghiệm kiểm tra khả kết lắng chủng lên men Nấm men nuôi cấy ống nghiệm chứa 10ml canh YPG ủ 300C 48 - 72 Sau ủ, lấy ống nghiệm lắc đều, đo chiều cao đoạn lắng ống nghiệm Nếu nấm men có khả lắng tốt ngày sau lên men, chiều cao đoạn dịch >75 % chiều cao khối mơi trường lên men Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 3/2017 Xử lý số liệu Các thí nghiệm lặp lại lần số liệu xử lý phần mềm Exel, phân tích thống kê ANOVA (p0,05) nên tuyển chọn cho nghiên cứu 2.2 Kết thí nghiệm kiểm tra khả chịu nồng độ cồn chủng phân lập Khảo sát chủng tuyển chọn cho thấy, nuôi cấy môi trường chứa nồng độ cồn 4% có chủng, nồng độ cồn 6% có chủng, nồng độ cồn 8% có chủng có độ OD540nm khơng khác biệt có ý nghĩa với mẫu đối chứng (p>0,05) Kết thí nghiệm kiểm tra khả chịu nồng độ cồn chủng phân lập chịu nồng độ cồn 8% thể Bảng Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 3/2017 Bảng Ảnh hưởng nồng độ cồn đến sinh trưởng chủng chịu nồng độ cồn 8% (v/v) Nồng độ cồn % (v/v) Chủng tuyển chọn Đối chứng 4% 6% 8% 10% N11 1,79 ± 0,09a 1,75 ± 0,14a 1,71 ± 0,06a 1,05 ± 0,05ab 0,27± 0,05b N23 1,75 ± 0,03a 1,73 ± 0,07a 1,60 ± 0,15a 1,20 ± 0,07ab 0,7 ± 0,64b V11 1,78 ± 0,07a 1,75 ± 0,14a 1,74 ± 0,03a 1,03 ±0,6ab 0,53 ± 0,23b Các giá trị a, b thể khác biệt có ý nghĩa số liệu (p 75 % N23 dạng bột > 75 % V11 dạng bột 50 % - 75 % Kết khảo sát cho thấy chủng N11 N23 có khả kết lắng tốt, dịch lên men độ cao lớn 75% chiều cao dịch lên men sau ngày lên men Kết lắng dạng bột bám đáy ống lên men, thuận tiện trình tách cặn sau lên men Khả kết lắng đặc tính tốt dùng để sản xuất rượu vang, nấm men kết lắng tốt thuộc nhóm nấm men lên men chìm, nhóm nấm men lên men chậm, nên khả giữ mùi hương cao, kết lắng tốt làm cho rượu trong, q trình lắng khơng tốn phụ gia thiết bị lọc Mặt khác nấm men thuộc nhóm nấm men lên men bề mặt, hoạt lực lên men mạnh, CO2 sinh nhiều mang theo chất thơm, làm mùi thơm rượu, sản xuất rượu vang người ta sử dụng nấm men thuộc nhóm lên men bề mặt [8], [14] 2.4 Kết thí nghiệm kiểm tra khả lên men rượu chủng tuyển chọn dịch ép xoài Kết xác định hàm lượng chất rắn hòa tan lại (TSS) hàm lượng cồn tạo thành sau lên men dịch xoài với chủng tuyển chọn thể Bảng Bảng Khả lên men rượu chủng tuyển chọn dịch ép xoài Chủng tuyển chọn Hàm lượng TSS ban đầu (oBrix) Hàm lượng TSS lại (oBrix) Hàm lượng cồn tạo thành (% v/v) N11 16,2 7,10± 0,36a 4,70 ± 0,1bb N23 16,2 7,57 ± 0,51a 4,57 ± 0,21b Các giá trị a, b thể khác biệt có ý nghĩa số liệu (p75%, có khả lên men dịch xồi với hiệu suất chuyển hóa đường 56%, độ rượu tạo thành >4,5% Kết định danh cho thấy chủng N11 N23 có độ tương đồng 99% với chủng Saccharomyces cerevisiae xác định theo Blast TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Ngô Thị Phương Dung, Lý Huỳnh Liên Hương Huỳnh Xuân Phong, 2011 Phân lập, tuyển chọn nấm men xác định điều kiện ảnh hưởng quy trình lên men rượu vang dưa hấu Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ 2011:18b, 137-145 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 15 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2017 Nguyễn Nhật Minh Phương, Chế Văn Hồng, Lý Nguyễn Bình, Châu Trần Diễm Ái, 2011 Tác động enzyme pectinase đến khả trích ly dịch điều kiện lên men đến chất lượng rượu vang xoài sau thời gian lên men Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 2011:20a, 127-136 Nguyễn Hữu Thanh, Nguyễn Thị Kỳ Duyên, Bằng Hồng Lam, Nguyễn Quang Thạch, 2012 Khảo sát số đặc tính sinh học định danh nấm men phân lập từ nấm men rượu đồng sơng Cửu Long Tạp chí Khoa học Phát triển, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Tập 10, số 2, 340-349 Nguyễn Thế Trang, 2007 Nghiên cứu khả lên men rượu chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae môi trường dịch chiết me rừng (Phyllanthus emblyca L) Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn, 12 +13, 113-115 Casey G P., Ingledew W M, 1986 Ethanol tolerance in yeast CRC Critical Reviews in Microbiology, 13(3): 219-280 Czyhrinciwk N., 1966 The technology of passion fruit and mango wines American Journal of Enology and Viticulture, 17: 27-30 Fleet G.H., 2003 Yeasts in fruit and fruit products In: Boekhout T., Robert R., Yeasts and Food Beneficial and Detrimental Aspects BehrsVerlag: 267-288 Guimarães T M., G Moriel G D., Machado I.P., Cyntia M.T., Fadel P., Tania M , Bonfim B., 2006 Isolation and characterization of Saccharomyces cerevisiae strains of winery interest Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences vol 42 n.1 Maragatham C., Panneerselvam A., 2011 Isolation, identification and characterization of wine yeast from rotten papaya fruits for wine production Advances in Applied Science Research, (2): 93-98 Tiếng Anh 10 OanaA A., Vasile A., Katsutada T., Fumiki Y., 1997 Quantitative Study of Yeast Growth in the Presence of Added Ethanol and Methanol Using a Calorimetric Approach, Bioscientist Biotechnology Biochemistry, 61 (4): 664-669 11 Reddy L V A., Reddy O V S., 2005 Production and Characterization of Wine from Mango Fruit (Mangifera indica L) World Journal of Microbiology and Biotechnology,Volume 21, Issue : 1345-1350 12 Reddy L V A., Reddy O V S, 2009 Production, optimization and characterization of wine from Mango (Mangiferaindica Linn.) Indian Journal of Natural Products and Resources (IJNPR), Vol 8(4): 426-435 13 Tahía B., Lucas DEL C., Andrés A., Jaime C., and E Cerdáo l E., 2011 Selection of Wine Yeasts for Growth and Fermentation in the Presence of Ethanol and Sucrose Mycobiology, 39(1): 33–39 14 Xu Li, Yu B., Curran P., Liu S.-Q, 2011 Chemical and volatile Composition of Mango wines fermented with different Saccharomyces cerevisiae yeast strains South African Journal of Enology and Viticulture, Vol 32 Issue 1, p117: 1353-1360 15 Yeon-Ju K, Lee, Yu-Ri C., So-Young L., Jong-Tae P., Jae-Hoon S., Kwan-Hwa P., and Jung-Wan K., 2011 Screening wild yeast strains for alcohol fermentation from various fruits Mycobiology 39(1): 33-39 16 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ... lượng chủng nấm men phân lập từ mẫu trái lên men kí hiệu chủng ghi nhận Bảng Bảng Các chủng nấm men phân lập từ mẫu trái lên men Mẫu phân lập Số lượng Kí hiệu chủng Dịch nho lên men (3 ngày)... N13, N14, N15 Dịch xoài lên men X11, X12 Dịch dâu lên men D11, D12, D13, D14 Dịch nho lên men (1tháng) N22, N23 Dịch vải lên men V11, V12, V13 Kết tuyển chọn chủng nấm men 2.1 Kết thí nghiệm kiểm... dòng nấm men quan sát có chủng hình cầu bầu dục chủng hình elip dài, chủng phân nhánh Như vậy, chủng nấm men phân lập từ trái lên men có đa dạng hình dạng tế bào Một số hình dạng tế bào nấm men phân