Lựa chọn phương pháp phân lập thích hợp cho tảo Microcystis aeruginosa

Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm để xác định phương pháp phân lập thích hợp cho tảo Microcystis aeruginosa. Thí nghiệm được thực hiện với 2 phương pháp phân lập khác nhau: phương pháp pha loãng và nuôi cấy trên môi trường agar với thành phần dinh dưỡng B12, cường độ ánh sáng 2.000 lux, nhiệt độ 25 ºC, chu kỳ quang 12 sáng:12 tối.

Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 1/2017 THÔNG BÁO KHOA HỌC LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP THÍCH HỢP CHO TẢO Microcystis aeruginosa SELECTION OF SUITABLE ISOLATION METHOD FOR THE MICROALGAE Microcystis aeruginosa Nguyễn Thị Thúy1, Lê Minh Hồng1, Trương Thị Bích Hồng1 Ngày nhận bài: 14/6/2016; Ngày phản biện thông qua: 11/10/2016; Ngày duyệt đăng: 10/3/2017 TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu nhằm để xác định phương pháp phân lập thích hợp cho tảo Microcystis aeruginosa Thí nghiệm thực với phương pháp phân lập khác nhau: phương pháp pha loãng nuôi cấy môi trường agar với thành phần dinh dưỡng B12, cường độ ánh sáng 2.000 lux, nhiệt độ 25 ºC, chu kỳ quang 12 sáng:12 tối Kết cho thấy, sau 16 ngày thí nghiệm, tảo Microcystis aeruginosa đạt chủng 100 % phương pháp pha lỗng với tỉ lệ pha lỗng 10-5, chí, tỉ lệ pha loãng 10-4, độ chủng đạt 99 % Trong đó, tảo Microcystis aeruginosa phân lập môi trường agar đạt độ chủng 100 % sau tiến hành phân lập lại nhiều lần Thời gian tiến hành phân lập môi trường agar lâu so với phương pháp pha loãng Như vậy, phương pháp pha loãng xem phù hợp để phân lập Microcystis aeruginosa nghiên cứu Từ khóa: agar, Microcystis aeruginosa, B12, phương pháp phân lập ABSTRACT The objectives of the study were to determine the suitable isolation method for Microcystis aeruginosa Experiments were performed in two different isolation methods: diluted method and culturing algae on the agar medium, with culture condition of nutrient medium B12, light intensity of 2,000 lux, temperature of 25oC, light cycle of (12 light: 12 dark) After 16 days, the results showed that the best purification of Microcystis aeruginosa was in the diluted method which reached at 100% and 99% at the dilution ratio of 10-5 and 10-4 After re-isolating many times, the purification level of Microcystis aeruginosa was still at 100% Moreover, the time needed to isolate was also longer than that of diluted method In conclusion, it can be suggested that the best isolation method for Microcystis aeruginosa was diluted method applied in this study Keywords: agar, Microcystis aeruginosa, B12, isolated method I ĐẶT VẤN ĐỀ Trong số loài vi khuẩn lam gây nở hoa nước hồ, ao loài Microcystis aeruginosa loài bắt gặp thường xuyên Lồi M aeruginosa chứa độc tố thuộc nhóm hepatotoxin (độc tố gan) cấu tạo từ peptid mạch vịng có tên gọi microcystin(MC) [5], [13] Viện Nuôi trồng thủy sản - Trường Đại học Nha Trang 76 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Độc tố gây ảnh hưởng xấu lên hai loại protein serine threonin phosphatases [7], [8], [9] Với đặc điểm tập đoàn bao gồm hàng nghìn tế bào riêng lẻ cỡ từ 2- µm tế bào chứa khơng bào khí Chính tập hợp hàng nghìn khơng bào khí định vị vơ số Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản tế bào giúp chúng mặt nước thu nhận nguồn ánh sáng mặt trời, thơng qua q trình quang hợp tổng hợp sắc tố diệp lục tạo nên váng xanh mặt nước [10] Trên giới nước ta có số phương pháp phân lập giống tảo chủng (Hilary Belcher and Erica Swale (1982) [11] , Nguyễn Thị Hương, 2001 [3], Các phương pháp pha lỗng, ni cấy mơi trường thạch, nhặt tế bào micropipet,… sử dụng phổ biến để phân lập loài tảo Tuy nhiên, loài tảo phù hợp với phương pháp khác Theo Hồng Thị Bích Mai [1] phương pháp pha lỗng phù hợp để phân lập Nitzschia longissima lồi tảo Chlorella sp lại phát triển tốt môi trường thạch agar Cho đến nay, chưa có cơng trình nghiên cứu đầy đủ phân lập lồi tảo M aeruginosa nhà khoa học phân lập phương pháp nuôi cấy thạch agar [12] Các phương pháp khác nhặt tế bào, phương pháp pha lỗng chưa nói đến Do đó, để lựa chọn phương pháp phân lập phù hợp cho loài tảo M aeruginosa việc nghiên cứu phương pháp phân lập thích hợp cho tảo M aeruginosa chúng tơi thực II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 1.1 Đối tượng nghiên cứu Ngành Cyanobaeteria Lớp Cyanophyceae Bộ Chroococcales Họ Microcystaceae Chi Microcystis Loài Microcystis aeruginosa 1.2 Địa điểm nghiên cứu Phịng Norad - Viện Ni trồng Thủy sản 1.3 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6/2015 đến tháng 8/2015 Chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm - Nguồn nước: nước cất - Dụng cụ thu mẫu: lưới vớt thực vật nổi, động vật nổi, chai nhựa thùng xốp đựng mẫu Số 1/2017 2.1 Môi trường nuôi tảo Bảng Môi trường dinh dưỡng B12 [12] Các chất dinh dưỡng NaNO3 Nồng độ (mg/l) 100 mg K2HPO4 10 mg MgSO4.7H2O 75mg CaCl2.2H2O 40mg Na2CO3 20mg Ferric citrate 6mg Disodium EDTA 2H2O 1mg VTM Vitamin B12 Nồng độ (ml/l) 0,1ml 2.2 Vệ sinh dụng cụ nuôi Cho nước cất môi trường dinh dưỡng (trừ VTM) vào bình tam giác 1000 mL, điều chỉnh pH = (bằng HCl KOH) Các dụng cụ ống nghiệm, hộp lồng, bình tam giác, ống đong, pipet, que cấy, bơng gịn, mơi trường dinh dưỡng, tiệt trùng máy Autoclarve nhiệt độ 1210C, áp suất 1.5 at thời gian 30 phút Để nhiệt độ xuống thấp 80 0C lấy dụng cụ Riêng môi trường dinh dưỡng sau lấy ra, để nhiệt độ phòng tảo (25 0C) 20 phút cho VTM vào lắc 2.3 Phương pháp thu mẫu nhân giống tảo để bố trí phân lập Nguồn tảo hỗn hợp thu từ số ao ni cá Ninh Phụng - Ninh Hịa - Khánh Hòa lưới vớt thực vật (Juday gas 98) Sau lọc qua lưới vớt động vật (Juday gas 68) cho vào chai nhựa 500 ml Mẫu tảo để thùng xốp, ướp đá lạnh vận chuyển phịng thí nghiệm Để lắng vòng tiếng, dùng pipet hút lớp dịch lên bề mặt vi khuẩn lam Nhân sinh khối giống bình tam giác 250 ml với môi trường B12, nhiệt độ 250C, cường độ chiếu sáng 2,000 lux, với chu kỳ quang 12 sáng: 12 tối trước đưa vào thí nghiệm 2.4 Phương pháp phân loại Quan sát mẫu kính hiển vi Olympus CX41 có gắn máy ghi hình kỹ thuật số Olympus TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 77 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản để quan sát chụp ảnh tảo Song song với ảnh chụp, chi tiết tảo vẽ lại Căn vào quan sát trực tiếp, hình ảnh, đặc điểm, hình thái kích thước tế bào để phân loại Bằng phương pháp hình thái so sánh, dựa vào khóa phân loại để phân loại đến lồi Chúng tơi sử dụng tài liệu sau: - Phân loại vi khuẩn lam Việt Nam [4] - Phân loại thực vật học bậc thấp [6] Phương pháp nghiên cứu 3.1 Phương pháp phân lập tảo 3.1.1 Phân lập phương pháp nuôi cấy môi trường thạch agar Pha 0,4g agar với 100 ml nước cất bình tam giác 500 ml, Sau đó, đổ vào bình nút mài 500 ml có màu Autoclarve nhiệt độ 1210C, áp suất 1,5 at thời gian 30 phút Để nhiệt độ xuống 80 0C lấy bình để nhiệt độ phòng tảo (250C) 20 phút, cho môi trường dinh dưỡng vào lắc đồng thời đổ vào đĩa petri (10 ml/đĩa) Sau 12 giờ, thạch đông, nguội dùng que cấy tiệt trùng lửa đèn cồn nóng đỏ, chờ nguội dùng que cấy lấy tảo cấy lên bề mặt thạch agar Đậy hộp lồng lại, mép đĩa peptri parafin đặt ánh sáng đèn neon (thời gian chiếu sáng 12 sáng: 12 tối), cường độ chiếu sáng 2,000 lux, nhiệt độ 25 0C Sau 10 - 12 ngày nuôi cấy thấy xuất quần lạc tảo màu xanh có hình dạng khác bề mặt thạch Dùng que cấy (sau hơ lửa đèn cồn để nguội) lấy mẫu từ quần lạc quan sát kính hiển vi để kiểm tra độ chủng Cấy chuyền sang đĩa thạch khác đến thu mẫu chủng 100% 3.1.2 Phân lập phương pháp pha loãng Chuẩn bị 10 ống nghiệm, ống nghiệm chứa ml nước cất Sau đó, Autoclarve nhiệt độ 1210C, áp suất 1,5 at thời gian 30 phút Để nhiệt độ xuống 80 0C lấy ống nghiệm để phịng thí nghiệm ni tảo 78 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Số 1/2017 nhiệt độ 25 0C Sau 24h ống nghiệm nước cất nguội, cho môi trường dinh dưỡng vào lắc Tiến hành ghi nhãn từ 10-1 đến 10-10 để số lần pha loãng Dùng pipet hút 1ml tảo mẫu thu tự nhiên nhân sinh khối đưa sang ống nghiệm 10-1 lắc nhẹ nhàng cho Tiếp tục hút 1ml từ ống nghiệm 10-1 sang ống nghiệm 10-2 lắc nhẹ Lặp lại ống nghiệm thứ 10 (10-10) Các ống nghiệm đặt giá nuôi điều kiện: thời gian chiếu sáng: 12 sáng: 12 tối, nhiệt độ: 250C, cường độ chiếu sáng: 2,000 lux 3.2 Phương pháp xác định tiêu 3.2.1 Xác định mật độ tế bào Việc xác định số lượng tế bào tảo tiến hành cách đếm tế bào buồng đếm hồng cầu Neubacur’s Hemacytometer Đức, buồng đếm có 25 vng lớn, vng lớn có 16 vng nhỏ, vơng nhỏ có diện tích 0,0025 mm2 độ sâu buồng đếm 0,1 mm 3.2.2 Cơng thức tính Theo Mucklow, số lượng tb/mL = (X x 1000 mm3)/(Y x W2 x d) Trong đó: X = số lượng tế bào đếm Y = số lượng ô vuông nhỏ đếm d = độ dày lớp nước buồng đếm W = cạnh vng W2 x d: Thể tích dung dịch ô vuông nhỏ 3.2.3 Xác định số yếu tố môi trường a Đo cường độ ánh sáng: Được đo máy đo Ana-F1 Nhật b Đo pH: Được đo máy đo pH 744, hiệu Metrohm III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Thu mẫu, phân lập loài thuộc chi Microcystis từ ao cá Ninh Phụng - Ninh Hòa Sau thu mẫu từ số ao nuôi cá Ninh Phụng - Ninh Hòa - Khánh Hòa Phịng thí nghiệm Norad - Viện Ni trồng Thủy sản Nhân sinh khối giống bình tam giác 250ml Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản với môi trường B12, nhiệt độ 250C, cường độ chiếu sáng 2,000 lux, với chu kỳ quang (12:12) trước đưa vào thí nghiệm 1.1 Phân loại lồi Microcystis aeruginosa Dựa theo phân loại tài liệu [4], [6] đặc điểm hình thái, kết hợp với kết chụp hình thái kính hiển vi quang học, chúng tơi xác định loài Microcystis aeruginosa Tế bào tảo Microcystis aeruginosa có đặc điểm: Tập đồn có cấu tạo bất thường, Số 1/2017 tế bào xếp rải rác, bao nhầy, suốt, tế bào tròn rộng, dạng hình cầu, đường kính -7 µm Tế bào có màu xanh lam, chứa khơng bào khí bên trong, thường xếp dày đặc Thường tạo thành váng xanh mặt nước Tuy nhiên mẫu nhiều lồi tảo khác chúng tơi tiến hành phân lập tảo phương pháp: nuôi cấy mơi trường thạch agar phương pháp pha lỗng Hình Tảo Microcystis phát triển ao ni cá Ninh Phụng 1.2 Phân lập Microcystis aeruginosa phương pháp nuôi cấy môi trường thạch agar Sau 10 ngày phân lập, quan sát thấy xuất quần lạc có màu xanh mọc rải rác đĩa thạch Dùng que cấy lấy quần lạc tảo từ đĩa petri kiểm tra độ chủng tảo, tảo đạt độ chủng không cao (70%), mẫu bắt gặp nhiều tế bào tảo khác Sau lần cấy chuyền lặp lại với tổng thời gian 30 ngày nuôi cấy môi trường thạch agar chúng tơi thu lồi tảo M aeruginosa có độ chủng 100% Bảng Độ chủng M aeruginosa (%) phương pháp cấy môi trường thạch agar STT Phân lập môi trường thạch agar Thời gian nuôi cấy Độ chủng Đĩa peptri 10 ngày 70% Cấy chuyền từ đĩa peptri qua đĩa peptri 10 ngày 95% Cấy chuyền từ đĩa peptri qua đĩa peptri 10 ngày 100% Hình Quần lạc tảo Microcystis aeruginosa mọc môi trường thạch agar TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 79 Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 1/2017 1.3 Phân lập Microcystis aeruginosa phương pháp pha lỗng Sau 16 ngày ni cấy tảo M aeruginosa độ pha loãng khác từ 10-1 đến 10-10, quan sát ống nghiệm mắt thường thấy dịch tảo có màu xanh lam, màu đặc trưng tảo lam Hình Quần lạc tảo Microcystis aeruginosa chủng (độ phóng đại 400x) Hình Tảo Microcystis aeruginosa phát triển phương pháp pha loãng Khi đưa mẫu tảo độ pha loãng khác lên quan sát, đếm mật độ tảo M aeruginosa thu kết sau: - Độ pha loãng 10-1: sau ngày quan sát thấy lẫn nhiều loài tảo khác; - Độ pha lỗng10-2: sau ngày quan sát thấy lẫn nhiều lồi tảo khác; - Độ pha loãng10-3: sau 16 ngày độ chủng M aeruginosa đạt 80%; - Độ pha loãng10-4: sau 16 ngày độ chủng M aeruginosa đạt 99%; - Độ pha loãng 10-5: sau 16 ngày độ chủng M aeruginosa đạt 100%; Kết thu M aeruginosa chủng 100% từ đĩa có độ pha lỗng 10-5 đến 10-10 Ở ống nghiệm có độ pha loãng 10-4, độ chủng đạt 99% sau 16 ngày ni cấy 80 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG So sánh với phương pháp pha loãng phương pháp ni cấy mơi trường agar, tảo M aeruginosa thu tảo chủng có thời gian lâu (30 ngày) Kết phù hợp với nghiên cứu Hilary Belcher,1982 [11], ông cho phương pháp phân lập cách nuôi cấy môi trường agar phù hợp với loài tảo silic nước tảo lục đơn bào (đặc biệt lồi thuộc chi Chlorella) Nghiên cứu Hồng Thị Bích Mai, 1995 [2] kết luận rằng: phân lập, lưu giữ nuôi sinh khối tảo, cần ý đến đặc điểm sinh thái loài để chọn phương pháp phân lập phù hợp Qua kết ta thấy, phương pháp pha loãng phương pháp thích hợp để phân lập tảo M aeruginosa với độ chủng cao 100% độ pha loãng thấp 10-5 IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trong phương pháp phân lập: phân lập cách pha loãng phân lập cách nuôi cấy môi trường thạch, thấy phân lập theo phương pháp pha lỗng thích hợp cho lồi tảo Microcystis aeruginosa Tảo M aeruginosa đạt chủng 100 % từ độ pha loãng 10-5 Cần nghiên cứu sâu như: tách chiết phân loại độc tố vi khuẩn lam, cụ thể loài M aeruginosa máy sắc ký lỏng cao áp thăm dò khả phân giải độc tố microcystin tảo M aeruginosa động vật thủy sản Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 1/2017 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Hoàng Thị Bích Mai, 2008-2010 Phân lập, lưu giữ nhân sinh khối hai lồi vi tảo có lợi (tảo lục & silic) số ao nuôi tôm thuộc vùng nuôi tôm sinh thái huyện Năm Căn, Ngọc Hiển tỉnh Cà Mau Đề tài cấp Bộ Mã số: B2008-13-35 Hồng Thị Bích Mai, 1995 Sinh sản, sinh trưởng sở khoa học quy trình ni thu sinh khối tảo Silic (Skeletonema costatum Greville Cleve, Chaetoceros sp.) làm thức ăn cho ấu trùng tôm Sú Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại học Nha Trang Nguyễn Thị Hương, 2001 Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố sinh thái lên phát triển quần thể tảo Chaetoceros calcistrans Paulsen, 1905 Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại học Nha Trang Dương Đức Tiến, 1996 Phân loại Vi khuẩn lam Việt Nam NXB Nông Nghiệp Dương Đức Tiến ctv, 2002 Bảo vệ nguồn gen vi tảo (microalgae) đặc hữu Hoàn Kiếm - Hà Nội Báo cáo khoa học chương trình tài trợ bảo vệ mơi trường gìn giữ di sản văn hố - Cơng ty Ford Motor Dương Đức Tiến Võ Văn Chí, 1978 Phân loại Thực vật học bậc thấp NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp: 87-95 Tiếng Anh Carmichael W, 1992 A Status Report on Planktonic Cyanobacteria (Blue-Green Algae) and their Toxins EPA/600/R-92/079 United States Environmental Protection Agency, Cincinnati, Ohio Chorus I., Bartram J., 1999 Toxic cyanobacteria in water A guide to their public health consequences, monitoring and management Published by E & FN Spon on behalf of the World Health Organization Falconer I., Buckley TH., 1989 Tumor promotion by Microcystis sp., a blue-green algae occurring in water supplies Medical Journal of Australia, 150: 351-352 10 Gibson MT., Barrett PRF and Ridge I Welch IM, 1990 Barley straw as an inhibitor of algal growth II: Laboratory studies J Appl Phycol 2: 241-248 11 Hilary Belcher, Erica Swale, 1982 Culturing algae, a guide for shool and colleges Culture collection of algae and protozoa Terrestrial Ecollogy institute, Cambridge 12 Nakagawa M Y., O.Yagi Takamura, 1987 Isolation of the slime from a cyanobacterium, microcystis aruginosa K-3A Agric Biol Chem 51: 329-337 13 Song L R., H.Pan N.Q.Gan, 2005 Toxic Microcystis blooms and microcystin composition in eutrophic lakes in China Algal Culture Collection and the Environment: 89-108 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 81 ... NGHỊ Trong phương pháp phân lập: phân lập cách pha lỗng phân lập cách ni cấy môi trường thạch, thấy phân lập theo phương pháp pha lỗng thích hợp cho lồi tảo Microcystis aeruginosa Tảo M aeruginosa. .. khoa học phân lập phương pháp nuôi cấy thạch agar [12] Các phương pháp khác nhặt tế bào, phương pháp pha lỗng chưa nói đến Do đó, để lựa chọn phương pháp phân lập phù hợp cho lồi tảo M aeruginosa. .. giữ nuôi sinh khối tảo, cần ý đến đặc điểm sinh thái loài để chọn phương pháp phân lập phù hợp Qua kết ta thấy, phương pháp pha lỗng phương pháp thích hợp để phân lập tảo M aeruginosa với độ chủng