Nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp của chủng xạ khuẩn Streptomyces variegatus NN1 nhằm nâng cao hiệu quả kháng nấm Aspergillus flavus gây bệnh trên cam quýt. Các thí nghiệm được thiết kế và thực hiện tập trung vào nghiên cứu đánh giá khả năng sinh chất kháng nấm trong các điều kiện lên men khác nhau của chủng xạ khuẩn Streptomyces variegatus NN1.
Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 11(84)/2017 at bonds involving hydrophobic amino acid residues Biochem Biophys, 200: 981-985 Patrớcia Domingues Pires-Bouỗas, Erika Izumi, Luciana Furlaneto-Maia, Leonardo Sturion and Sérgio Suzart, 2010 Effects of environmental and nutritional factors ongelatinolytic activity by Enterococcus faecalis strainsisolated from clinical sources African Journal of Microbiology Research Vol (10), p 969-976 Paulina Ducka, Ulrich Eckhard, Esther Schönauer, Stefan Kofler, Gerhard Gottschalk, Hans Brandstetter, Dorota Nüss, 2009 A universal strategy for high-yield production of soluble and functional clostridial collagenases in E coli Appl Microbiol Biotechnol (2009) 83: 1055-1065 Shanmugasundaram Senthil Balan, Rajendiran Nethaji, Sudalayandi Sankar, Singaram Jayalakshmi, 2012 Production of gelatinase enzyme from Bacillus spp isolated from the sediment sample of Porto Novo Coastal sites Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, S1811-S1816 Tran LH, Nagano H., 2002 Isolation and Characteristics of Bacillus subtilis CN2 and its Collagenase Production J of Food Science 2002, 67(3): 1184-1187 Survey on culture conditions of recombinant bacteria E coli BL21- pET22b(+) -gelE synthesizing gelatinase Pham My Dung, Pham Cong Hoat, Pham Thi Tam, Le Huy Ham Abstract The investigation of carbon, nitrogen sources, temperature, pH and culture time was conducted to evaluate the effects of culture conditions on growth and gelatinase biosynthesis of E coli BL21- pET22b(+)-gelE strain The results showed that: Nitrogen, carbon sources supplemented to the recombinant breeding medium were E coli BL21pET22b(+)-gelE, yeast extract or peptone 1% + glucose 1% Simultaneously, the suitable culture condition for this recombinant strain was at 30 ÷ 37 oC and pH = ÷ The appropriate culture time for recombinant bacteria E coli BL21- pET22b(+) -gelE was in 24 hours Keywords: Gelatinase, recombinat bacteria, E coli Ngày nhận bài: 14/10/2017 Ngày phản biện: 20/10/2017 Người phản biện: TS Nguyễn Thanh Hải Ngày duyệt đăng: 10/11/2017 XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces variegatus NN1 NHẰM NÂNG CAO HIỆU QUẢ KHÁNG NẤM Aspergillus flavus GÂY BỆNH TRÊN CAM QUÝT Nguyễn Xuân Cảnh1, Lê Hồng Anh1, Cấn Thị Mai Hương1 TĨM TẮT Nghiên cứu tiến hành với mục tiêu xác định điều kiện ni cấy thích hợp chủng xạ khuẩn Streptomyces variegatus NN1 nhằm nâng cao hiệu kháng nấm Aspergillus flavus gây bệnh cam quýt Các thí nghiệm thiết kế thực tập trung vào nghiên cứu đánh giá khả sinh chất kháng nấm điều kiện lên men khác chủng xạ khuẩn Streptomyces variegatus NN1 Kết thu cho thấy môi trường tối ưu cho lên men môi trường A4-H, thời gian sinh chất kháng nấm nhiều sau ngày điều kiện nuôi lắc 200 vòng/phút, pH - 8, nhiệt độ 30 - 35oC, tỷ lệ thể tích mơi trường ni/thể tích bình ni cấy khoảng 10% Khi áp dụng điều kiện nuôi cấy thu sinh khối chủng xạ khuẩn Streptomyces variegatus NN1 cho thấy cam quýt sau phun dịch xạ khuẩn hạn chế khả bị cơng nấm Aspergillus flavus Từ khóa: Aspergillus flavus, Streptomyces variegatus, xạ khuẩn I ĐẶT VẤN ĐỀ Các loại thuộc chi cam quýt mặt hàng có nhu cầu tiêu thụ cao nước đồng thời nhóm xuất chủ lực giá trị dinh dưỡng cao, thích nghi tốt với hầu hết khu vực sinh thái nước ta (Hoàng Ngọc Thuận, 2004) Vấn đề tất các giai đoạn sinh trưởng phát triển, cam quýt dễ bị hại Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam 76 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 11(84)/2017 công nấm mốc, đặc biệt giai đoạn sau thu hoạch Để hạn chế thiệt hại nấm mốc đồng thời kéo dài thời gian bảo quản, cam quýt cần bảo quản điều kiện lạnh Tuy nhiên số chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus bao gồm Aspergillus flavus có khả phát triển nhiệt độ thấp nên gây bệnh loại trái bảo quản lạnh Theo số nghiên cứu công bố, 50% hư hại bệnh mốc xanh thuộc chi cam quýt có nguyên nhân từ chủng Aspergillus flavus (Akhatar et al., 2013) Trong tác nhân sinh học thường dùng để ức chế vi sinh vật gây bệnh, xạ khuẩn nhóm có nhiều tiềm tỷ lệ lồi có khả sinh chất kháng sinh cao Cho tới nay, có khoảng 8000 chất kháng sinh biết giới có tới 80% xạ khuẩn sinh (Dhanasekaran et al., 2012) Trong nghiên cứu sàng lọc xác định chủng xạ khuẩn có khả kháng nấm mốc A flavus gây bệnh chi cam quýt phát chủng xạ khuẩn Streptomyces variegatus NN1 (NN1) thể hoạt tính tương đối cao Nghiên cứu thực với mục tiêu đánh giá ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả đối kháng nấm A flavus chủng xạ khuẩn NN1 xác định điều kiện ni cấy thích hợp nhằm nâng cao khả sinh chất kháng sinh có hoạt tính kháng nấm A flavus chủng xạ khuẩn NN1 Từ làm sở cho việc phát triển sản xuất chế phẩm sinh học bảo quản nông sản sau thu hoạch nói chung cam quýt nói riêng II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Chủng nấm A flavus gây bệnh chi cam quýt, chủng xạ khuẩn Streptomyces variegatus NN1 có hoạt tính kháng A flavus phân lập, xác định bảo quản phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng môi trường điều kiện nuôi cấy a) Ảnh hưởng môi trường lên men Xạ khuẩn nuôi môi trường: SCA (Tinh bột 10 g; casein 10 g; KH2PO4 0,5 g; MgSO4 0,5 g; NaCl g; nước cất 1000 ml; pH 7,5 - 7,8), A4-H (Glucose 15 g; bột đậu tương 15 g; NaCl g; CaCO3 g; nước cất 1000 ml; pH 7,5 - 7,8), ISP2 (Cao nấm men g; dịch chiết malt 10 g; glucose g; nước cất 1000 ml; pH = 7,3), M1ASW (Tinh bột 15 g; glucose g; pepton g; nước cất 1000 ml; pH 7,5 - 7,8) Hút ml môi trường vào ống nghiệm, sau ni lắc 30oC với tốc độ 200 vịng/phút Sau - ngày dịch nuôi cấy xạ khuẩn cấy vào đĩa petri chứa môi trường PDA cấy trải nấm, ủ 4oC giờ, sau cho vào tủ ni Đường kính vịng ức chế sinh trưởng nấm xác định sau ngày nuôi cấy 30oC Chọn môi trường cho hiệu sinh chất kháng nấm cao phục vụ nghiên cứu b) Ảnh hưởng thời gian trạng thái nuôi cấy Xạ khuẩn nuôi ngày mơi trường nhân giống cấp có thành phần: cao nấm men 10 g, dextrose 10 g, nước cất 1000 ml với pH 6.8 Sau hút 10 ml dịch nuôi bổ sung vào 90 ml môi trường lên men thích hợp lựa chọn đựng bình tam giác Các bình ni 30oC hai trạng thái nuôi tĩnh nuôi lắc 200 vịng/phút, kiểm tra khả hoạt tính kháng nấm sau ngày nuôi cấy theo phương pháp mô tả c) Ảnh hưởng pH nhiệt độ Sau xác định môi trường nuôi cấy, trạng thái ni cấy thời gian ni cấy thích hợp, tiến hành nuôi chủng xạ khuẩn điều kiện pH môi trường ban đầu là: 5, 6, 7, 8, 9, 10; điều kiện nhiệt độ khác 25, 30, 35, 40, 50oC Sau khoảng thời gian lên men thích hợp, tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng nấm dịch lên men phương pháp khuếch tán đĩa thạch mô tả d) Ảnh hưởng độ thơng khí Chủng xạ khuẩn ni mơi trường thích hợp bình tam giác 250ml với thể tích dịch ni tương ứng với 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40% thể tích bình nuôi, trạng thái, nhiệt độ pH tối ưu Sau thời gian thích hợp xác định từ thí nghiệm trước, tiến hành thử hoạt tính kháng nấm phương pháp khuếch tán đĩa thạch 2.2.2 Đánh giá hiệu ức chế nấm Aspergillus flavus chủng xạ khuẩn NN1 điều kiện in vivo Chủng nấm gây bệnh A flavus nuôi môi trường thạch PDA đĩa petri sau - ngày 77 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 11(84)/2017 Lấy phần sợi nấm cho vào 100 ml nước vô trùng Chủng xạ khuẩn NN1 nuôi cấy điều kiện xác định sau ly tâm, thu dịch ni cấy, pha lỗng dịch 10 lần nước cất vơ trùng Qt thí nghiệm: Chọn cịn tươi, khơng dập, úng, khơng bị tổn thương lớp vỏ, sau tiến hành xịt cồn, ngâm javen vòng phút rửa lại nước cất vơ trùng Các mẫu qt thí nghiệm nhúng qua dung dịch nuôi cấy xạ khuẩn chuẩn bị, mẫu đối chứng nhúng qua nước cất vô trùng Tiến hành lây nhiễm nhân tạo nấm gây bệnh cho mẫu quýt cách phun dịch bào tử lên bề mặt quả, để khơ, cho vào túi nilon, trì 30 - 32oC, quan sát vết bệnh sau - 10 ngày 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu thực phịng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam từ 01/2016 đến 01/2017 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định ảnh hưởng môi trường điều kiện nuôi cấy đến khả sinh chất kháng nấm 3.1.1 Ảnh hưởng môi trường lên men Chủng xạ khuẩn NN1 tiến hành nuôi môi trường sở SCA, ISP2, A 4-H M1ASW Sau ngày ni, hoạt tính kháng nấm chủng NN1 xác định phương pháp khuếch tán đĩa thạch Kết cho thấy chủng NN1 có hoạt tính kháng nấm nuôi môi trường lên men sở, hoạt tính kháng nấm biểu mạnh nuôi môi trường A4-H với kích thước vịng kháng nấm khoảng 13 mm (Hình 1) Các kết hoàn toàn phù hợp với kết nghiên cứu xác định môi trường lên men thích hợp chủng Streptomyces albogriseolus VD111 (Phạm Thu Trang ctv 2014) Căn vào kết này, sử dụng mơi trường A4-H cho thí nghiệm Hình Ảnh hưởng mơi trường lên men đến khả sinh chất kháng nấm chủng xạ khuẩn NN1 3.1.2 Ảnh hưởng thời gian trạng thái nuôi cấy Nhằm khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy, chủng xạ khuẩn NN1 nuôi môi trường Gause I lỏng Sau ngày nuôi, hút 10 ml dịch nuôi bổ sung vào 90 ml mơi trường A4-H đựng bình tam giác ni nhiệt độ 30oC hai trạng thái tĩnh lắc 200 vịng/phút, sau xác định khả kháng nấm Kết cho thấy trạng thái nuôi lắc sau ngày ni, chủng NN1 có hoạt tính kháng nấm lớn với kích thước vịng kháng nấm 14 mm, sau có biến thiên theo chiều hướng giảm dần giữ hoạt tính kháng nấm sau ngày ni (Hình 2) Kết nghiên cứu chúng tơi có tương đồng với công bố 78 Gulve Deshmukh (2012) Khi nghiên cứu hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn biển tác giả khẳng định thời gian thu chất kháng sinh đa số chủng xạ khuẩn - ngày Tuy nhiên, so với thời gian thu chất kháng sinh lên men chủng Streptomyces sp MS-266 Dm4 nghiên cứu Ababutain (2013) sau ngày ni thời gian thu chất kháng nấm từ chủng xạ khuẩn NN1 sớm Kết thí nghiệm cho thấy khả sinh chất kháng nấm chủng NN1 có sai khác nuôi cấy trạng thái khác Chủng NN1 thể hoạt tính kháng nấm mạnh nuôi cấy môi trường lỏng trạng thái lắc (200 vịng/phút) Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 11(84)/2017 Hình Ảnh hưởng thời gian điều kiện nuôi cấy đến khả sinh chất kháng nấm chủng xạ khuẩn NN1 3.1.3 Ảnh hưởng pH nhiệt độ Độ pH môi trường không ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển xạ khuẩn mà ảnh hưởng tới trình sinh tổng hợp chất kháng nấm Kết xác định ảnh hưởng pH cho thấy dải pH từ - 10, chủng NN1 sinh trưởng biểu hoạt tính kháng nấm tương đối mạnh với đường kính vịng kháng nấm từ - 13 mm (Hình 3) Ở pH - 8, chủng NN1 biểu khả kháng nấm trội hẳn, pH môi trường lớn hoạt tính kháng nấm giảm dần Như thấy chủng xạ khuẩn NN1 sinh trưởng tốt điều kiện pH mơi trường trung tính đến kiềm Kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu cơng bố xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật phát triển tốt mơi trường trung tính kiềm (Lê Thị Thanh Xuân Tăng Thị Chính, 2007) Tiếp đó, chủng xạ khuẩn NN1 ni mơi trường A4-H trạng thái lắc 200 vịng/phút, pH mức nhiệt độ khác 25, 30, 35, 40, 45, 50oC Trong dải nhiệt độ nghiên cứu, chúng tơi nhận thấy chủng NN1 có khả phát triển sinh chất kháng nấm nhiệt độ từ 25 - 35oC; 30oC chủng xạ khuẩn có khả sinh trưởng sinh chất kháng nấm mạnh với đường kính vịng kháng nấm tương ứng 13 mm Với mức nhiệt 40oC chủng NN1 sinh trưởng yếu; nhiệt độ 45 - 50oC chủng NN1 ngừng sinh trưởng Đồng thời lấy dịch nuôi nhiệt độ thí nghiệm tiến hành ly tâm lạnh 4oC, 10.000 vịng/phút 10 phút sau thu dịch khơng ly tâm để thử hoạt tính kháng nấm, chúng tơi thấy đường kính vịng kháng nấm dịch nuôi không qua ly tâm tương đồng kích thước vịng kháng nấm dịch ni qua ly tâm Như vậy, để thu chất kháng nấm với hàm lượng cao cần nuôi chủng NN1 30oC pH Giá trị pH tối ưu cho khả sinh hoạt chất kháng nấm chủng NN1 giá trị pH thích hợp cho lên men thu hợp chất kháng nấm chủng Streptomyces sp KGG32 nghiên cứu Mustafa (2011) cao pH lên men thu hợp chất kháng nấm chủng S rimosus MY02 nghiên Yu (2008) Hình Ảnh hưởng pH nhiệt độ đến khả sinh chất kháng nấm chủng xạ khuẩn NN1 3.2.4 Ảnh hưởng độ thơng khí Chủng xạ khuẩn NN1 cấy vào mơi trường A4-H, pH đựng bình hình tam giác 250 ml với tỷ lệ dịch nuôi tương ứng 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40% thể tích bình Ni cấy nhiệt độ 30oC, tốc độ lắc 200 vịng/phút, sau ngày ni kiểm tra khả 79 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 11(84)/2017 sinh chất kháng nấm Kết thí nghiệm cho thấy với lượng mơi trường lên men chiếm 10% thể tích bình cho hiệu tổng hợp chất kháng nấm cao nhất, vòng kháng nấm 13 mm Kết tương ứng với nghiên cứu thu nhận rapamycin chủng S hygroscopicus ATCC29253 nghiên cứu Hamdy (2011) Vì vậy, điều kiện ni lắc 200 vịng/phút, thể tích dịch ni 10% thể tích bình điều kiện tốt để ni cấy chủng xạ khuẩn NN1 IV KẾT LUẬN - Môi trường lên men thích hợp để nâng cao khả kháng nấm bệnh Aspergillus flavus chủng xạ khuẩn Streptomyces variegatus NN1 mơi trường A4-H Hoạt tính kháng nấm chủng NN1 biểu ngày nuôi cấy thứ đạt cực đại sau ngày nuôi điều kiện ni lắc 200 vịng/phút nhiệt độ 30oC pH chủng NN1 Trong điều kiện ni lắc bình tam giác, hoạt tính kháng nấm cao trì thể tích ni cấy 10% thể tích bình nuôi - Dịch nuôi cấy xạ khuẩn điều kiện xác định có khả ức chế phát triển nấm bệnh Aspergillus flavus quýt điều kiện thí nghiệm in vivo TÀI LIỆU THAM KHẢO Hình Ảnh hưởng thể tích dịch ni đến khả kháng nấm chủng NN1 3.3 Đánh giá hiệu kháng nấm A flavus chủng NN1 điều kiện in vivo Để đánh giá hiệu kháng nấm chủng xạ khuẩn NN1 thực tế, thí nghiệm thử hoạt tính sơ điều kiện in vivo tiến hành Dịch lên men chủng xạ khuẩn chuẩn bị theo điều kiện tối ưu xác định Quá trình xử lý lây nhiễm nhân tạo quýt thực mô tả phần phương pháp Sau ngày lây nhiễm, mẫu thí nghiệm khơng thấy xuất vết bệnh nấm A flavus mọc lên nhiều mẫu đối chứng (Hình 5) Kết thí nghiệm cho thấy dịch ni cấy chủng xạ khuẩn NN1 có khả ức chế cơng nấm A flavus Như nhận thấy việc dụng chủng NN1 phòng trừ nấm bệnh hại cam quýt có tiềm sản xuất quy mơ lớn Thí nghiệm Đối chứng Hình Kết khả đối kháng nấm bệnh Aspergillus flavus chủng xạ khuẩn NN1 trực tiếp quýt 80 Hoàng Ngọc Thuận, 2004 Kỹ thuật chọn tạo trồng cam quýt Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Phạm Thu Trang, Phạm Thanh Huyền, Lê Gia Hy, Phí Quyết Tiến, Hồ Tuyên, Nguyễn Văn Giang , Nguyễn Phương Nhuệ, 2014 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn biển VD111 sinh chất kháng nấm Tạp chí Khoa học Phát triển 2014, 12(8): 1258-1265 Lê Thị Thanh Xuân, Tăng Thị Chính, 2007 Ảnh hưởng điều kiện lên men lên khả sinh chất kháng sinh kháng nấm Fusarium oxysporum hai chủng xạ khuẩn Streptomyces cyaneogriceus HD54 Streptomyces hygroscopicus HD58 Tạp chí Sinh học, 29(1): 89-94 Ababutain IM, Aziz ZKA, AL-Meshhen NA, 2013 Optimization of environmental and nutritional conditions to improve growth and antibiotic productions by Streptomyces sp Isolated from Saudi Arabia Soil Int Res J Microbiol., 4(8): 179-187 Akhatar, N., T Anjum and R Jabeen, 2013 Isolation and identification of storage fungi from citrus sampled from major growing areas of Punjab, Pakistan Int J Agric Biol., 15: 1283-1288 Dhanasekaran D., Thajuddin N., Panneerselvam A., 2012 Applications of Actinobacterial Fungicides in Agriculture and Medicine Fungicides for Plant and Animal Diseases, pp 1-27 Gulve RM, Deshmukh AM, 2012 Antimicrobial activity of the marine actinomycetes Int Multidisciplin Res J., 2(3): 16-22 Hamdy, A A., El-Refai, A F., Sallam, L A R., Osman, M E., Om Kalthoum, H K., Mohamed, M A., 2011 Seed stage manipulation as a tool for improving rapamycin production by Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253 Australian Journal of ... nâng cao khả kháng nấm bệnh Aspergillus flavus chủng xạ khuẩn Streptomyces variegatus NN1 mơi trường A4-H Hoạt tính kháng nấm chủng NN1 biểu ngày nuôi cấy thứ đạt cực đại sau ngày nuôi điều kiện. .. khuẩn Streptomyces variegatus NN1 (NN1) thể hoạt tính tương đối cao Nghiên cứu thực với mục tiêu đánh giá ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả đối kháng nấm A flavus chủng xạ khuẩn NN1 xác định điều. .. thu chất kháng nấm từ chủng xạ khuẩn NN1 sớm Kết thí nghiệm cho thấy khả sinh chất kháng nấm chủng NN1 có sai khác nuôi cấy trạng thái khác Chủng NN1 thể hoạt tính kháng nấm mạnh nuôi cấy môi