Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần dầu hạt của cây tía tô trắng thu hái tại xã mường vi

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LƯƠNG THỊ KIM CHI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN DẦU HẠT CỦA CÂY TÍA TƠ TRẮNG THU HÁI TẠI XÃ MƯỜNG VI, HUYỆN BÁT XÁT, TỈNH LÀO CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LƯƠNG THỊ KIM CHI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN DẦU HẠT CỦA CÂY TÍA TƠ TRẮNG THU HÁI TẠI XÃ MƯỜNG VI, HUYỆN BÁT XÁT, TỈNH LÀO CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Phạm Hà Thanh Tùng Nơi thực hiện: Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực khóa luận tốt nghiệp, tơi nhận nhiều hướng dẫn giúp đỡ thầy cô, bạn bè gia đình Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến ThS Phạm Hà Thanh Tùng – Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy PGS.TS Trần Văn Ơn, ThS Nghiêm Đức Trọng – Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, giúp đỡ tơi q trình thu mẫu phân tích mẫu Khóa luận khơng thể hồn thành khơng có giúp đỡ q báu PGS.TS Panee Sirisaard – Khoa Dược, Đại học Chiang Mai, Thái Lan ông Thanach Sathapanachai – Công ty Jingabell Biotech Co LTD, Thái Lan hoạt động hợp tác nghiên cứu thành phần dầu hạt Tía tơ trắng Tôi gửi lời tri ân đặc biệt tới anh Vàng Văn Sưởng bà dân tộc Giáy xã Mường Vi, huyện Bát Xát, tỉnh Lào Cai giúp đỡ tơi nhiệt tình q trình thu mẫu Tơi xin gửi lời cảm ơn tới sinh viên Đoàn Thị Phương – Đại học Dược Hà Nội sẵn sàng hỗ trợ tơi q trình thực Tơi xin gửi lời cám ơn tới thầy cô, anh chị kỹ thuật viên bạn nghiên cứu khoa học – Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi tơi hồn thành tốt q trình làm thực nghiệm mơn Và cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới ông bà, bố mẹ bạn ủng hộ động viên tơi suốt q trình học tập thời gian nghiên cứu đề tài Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2015 SINH VIÊN Lương Thị Kim Chi MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .2 1.1 Cây Tía tơ 1.1.1 Vị trí phân loại Tía tơ 1.1.2 Đặc điểm hình thái phân bố loài Perilla frutescens L Britton 1.1.3 Đặc điểm sinh thái 1.1.4 Bộ phận dùng 1.2 Phương pháp Mã vạch DNA (DNA Barcoding) trình tự di truyền đoạn DNA ribosom nhân vùng ITS1-5.8S-ITS2 Tía tơ 1.2.1 Phương pháp mã vạch DNA (DNA Barcoding) 1.2.2 Trình tự di truyền đoạn DNA ribosom nhân vùng ITS1-5.8S-ITS2 Tía tơ 1.3 Thành phần dầu hạt Tía tơ 1.3.1 Các acid béo 1.3.2 Vitamin E 1.3.3 Các hợp chất phenolic 10 1.4 Tác dụng sinh học hạt Tía tô 10 1.4.1 Tác dụng hệ hô hấp 11 1.4.2 Tác dụng hệ tim mạch 11 1.4.3 Tác dụng chống viêm 11 1.4.4 Tác dụng não 12 1.4.5 Các tác dụng khác 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên liệu thiết bị 13 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 13 2.1.2 Dung môi, hóa chất 13 2.1.3 Máy móc, thiết bị 14 2.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu 14 2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái 14 2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu 15 2.2.3 Nghiên cứu trình tự di truyền 15 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 Đặc điểm hình thái giám định tên khoa học 19 3.2 Đặc điểm vi phẫu 21 3.2.1 Vi phẫu thân 21 3.2.2 Vi phẫu 23 3.3 Trình tự di truyền đoạn DNA ribosome nhân vùng ITS1-5.8S-ITS2 24 3.3.1 Tách chiết DNA 24 3.3.2 Xác định trình tự rDNA vùng ITS1-5.8S-ITS2 25 3.3.3 So sánh trình tự gen với trình tự gen Perilla frutescens cơng bố Genbank 25 3.4 Hàm lượng thành phần dầu hạt Tía tơ P1 27 3.4.1 Các acid béo 27 3.4.2 Hàm lượng Omega 3,6,9 29 3.4.3 Thành phần Vitamin E 29 3.5 Bàn luận 30 3.5.1 Về thực vật 30 3.5.2 Về trình tự đoạn rDNA vùng ITS1-5.8S-ITS2 31 3.5.3 Về thành phần dầu hạt Tía tơ P1 32 KẾT LUẬN 39 KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt : Tên đầy đủ (Giải thích) P : Perilla AA : Arachidonic acid ALA : α-linolenic acid AOAC : Association of Official Analytical Chemists (Hiệp hội nhà Hóa phân tích) BLAST BOLD Basic local aligning search tool : Barcode of Life Database (Cơ sở liệu Mã vạch sống) bp : base pairs (cặp base) DHA : Docosahexanoic acid DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxynucleotide triphosphates EPA : Eicosapentaenoic acid FAPAS : Food Analysis Performance Assessment Scheme (Hệ thống đánh giá, phân tích thực phẩm) GC : Gas chromatography (Sắc ký khí) GLC : Gas Liquid Chromatography (Sắc ký khí lỏng) HDL : High-density lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng cao) HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) IL-1β : Interleukin-1β ITS : Internal transcribed spacer (Vùng phiên mã nội) LDL : Low-density lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng thấp) LGC : Laboratory of the Government Chemist (Phịng thí nghiệm nhà khoa học phủ) PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng khuếch đại gen) rDNA : Ribosomal DNA (DNA ribosom) TLC/FID : Thin Layer Chromatography with Flame Ionization Detection (Sắc ký lớp mỏng với detector ion hóa lửa) TNF α : Tumor necrosis factor α (Yếu tố hoại tử khối u alpha) w/w : Weight/weight (Khối lượng/Khối lượng) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Kết định lượng thành phần dầu hạt Tía tơ P1 28 Bảng 3.2 Hàm lượng Omega-3,6,9 dầu hạt Tía tơ P1 29 Bảng 3.3 Thành phần vitamin E dầu hạt Tía tơ P1 30 Bảng 3.4: Bảng so sánh tỷ lệ thành phần acid béo bão hòa khơng bão hịa Tía tơ P1 với số mẫu dầu thực vật giới 33 Bảng 3.5 Bảng so sánh hàm lượng số tiêu quan trọng mẫu dầu thực vật khác 37 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc vùng rDNA - ITS mồi thường sử dụng Hình 1.2: Cấu tạo triacylglycerol Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo acid béo no, đơn khơng no, đa khơng no dầu hạt Tía tơ Hình 3.1: Đặc điểm quan sinh dưỡng mẫu P1 19 Hình 3.2: Phân tích hoa mẫu P1 20 Hình 3.3: Chi tiết vi phẫu thân mẫu P1 22 Hình 3.4: Chi tiết vi phẫu mẫu P1 23 Hình 3.5: Điện di sản phẩm DNA toàn phần sản phẩm PCR 24 Hình 3.6: Sắc ký đồ trình tự DNA theo chiều 5’-3’ mẫu P1 với cặp mồi ITS1ITS4 25 Hình 3.7: Kết gióng hàng trình tự rADN mẫu P1 với ngân hàng gen sử dụng công cụ Blast 26 Hình 3.8: Quả (“Hạt”) Tía tơ: (a) Trung Quốc, (b)Thái Lan, (c) P1 (d) mẫu “Tơ tử” chợ Lãn Ơng 31 Hình 3.9: Dầu hạt Tía tơ Okinawa Perilla oil (Aman Prana, Đức) với nhãn giá trị dinh dưỡng 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Tía tơ (Perilla frutescens L Britton), họ Bạc hà (Lamiaceae), cỏ mọc quanh năm, sử dụng lâu đời giới Việt Nam Trong loài P frutescens L Britton, có hai thứ thường gặp phân biệt dựa vào đặc điểm hình thái cách sử dụng P frutescens var.crispa (Thunb.) W Deane loại rau gia vị vị thuốc y học cổ truyền Trung Hoa P frutescens var frutescens cho hạt để ép lấy dầu [25, 26, 29] Các nghiên cứu dịch tễ học thực tiễn lợi ích dầu hạt Tía tô sức khỏe người làm giảm nồng độ cholesterol, triglyceride, lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL) [28, 32], giảm cục máu đông giúp giảm nguy tai biến, nhồi máu tim [21, 28]; giảm triệu chứng dị ứng mẫn, giảm hen suyễn; giảm đau chống viêm; kích thích chức miễn dịch [21]; tham gia vào q trình hình thành phát triển trí não trẻ [8] Ở Việt Nam, việc khai thác Tía tơ để lấy làm rau gia vị phổ biến nhiên việc lấy hạt theo hướng khai thác dầu cịn hạn chế Trong q trình khảo sát thực địa, hạt loại Tía tơ trắng phát sử dụng phổ biến đồng bào dân tộc Giáy xã Mường Vi, huyện Bát Xát, tỉnh Lào Cai để làm lương thực Các đặc điểm mô tả sơ mẫu cho thấy tương đồng cao với đặc điểm loài P frutescens var frutescens Nhận thấy tiềm khai thác Tía tơ trắng theo hướng lấy dầu hạt, thực đề tài với mục tiêu là: • Mơ tả đặc điểm thực vật Tía tơ trắng • Xác định trình tự di truyền đoạn DNA ribosom nhân vùng ITS1-5.8S- ITS2 Tía tơ trắng • Xác định thành phần dầu hạt Tía tơ trắng 38 Đơn vị: mg/100g Chỉ tiêu Omega 6/omega-3 P1 0,29 Tía tơ Tía tơ Thái Hàn Lan Quốc 0,310,41 Okinawa Hạt Hạt Lanh Chia 0,22 0,27 0,35 0,3 Perilla oil Tocophenol 131,64 72,4 55,6 44,4 61,48 Tocotrienol 339,36 1,0 19,1 0,2 9,52 Vitamin E 471 73,4 74,7 44,6 71 2,58 0,01 0,34 0,15 Tocotrienol/ Tocophenol 39 KẾT LUẬN Về thực vật: Đã thu hái mẫu có hoa, mơ tả chi tiết đặc điểm hình thái quan sinh dưỡng quan sinh sản mẫu nghiên cứu Đã giám định tên mẫu nghiên cứu Perilla frutescens var frutescens; mô tả đặc điểm vi phẫu thân, lá; xác định trình tự đoạn gen rDNA – ITS1-5.8S-ITS2 gồm có 664/665 Nucleotid tương đồng (tỷ lệ 99%) với trình tự đoạn rADN trình tự cơng bố có mã gb|KF012860.1| tương ứng với tên khoa học Perilla frutescens var frutescens Về hóa học Đã xác định hàm lượng thành phần acid béo vitamin E có dầu ép từ hạt P frutescens var frutescens Acid béo chủ yếu acid béo không no với hàm lượng omega-3 63, 143g, omega-6 18,032g 100g dầu Vitamin E dầu hạt Tía tơ P1 tồn dạng Tocotrienol (α, β, γ, δ) Tocophenol (α, γ, δ) với hàm lượng 471 mg 100g dầu KIẾN NGHỊ Nghiên cứu đặc điểm nơng học mẫu Tía tơ trắng P frutescens var frutescens để đưa vào canh tác quy mô rộng phát triển sản phẩm dầu Tía tơ đưa thị trường Tiếp tục nghiên cứu tương tự với đa dạng mẫu Tía tơ trắng Việt Nam để khảo sát thành phần dầu 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ môn Thực vật (2012), Thực tập Thực vật nhận biết thuốc, Trung tâm Thông tin - Thư viện Đại học Dược Hà Nội Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng (Tập 2), NXB KHKT, tr 1912 Nguyễn Thị Thu Hiền (2014), Nghiên cứu đặc điểm hình thái, di truyền bán định lượng gymnemagenin lồi dây thìa canh to (Gymnema latifolium Wall Ex Wight) Việt Nam,Luận văn Thạc sĩ dược học - Đại học Dược Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam (Tập 2), NXB Trẻ, tr 862 Vũ Xuân Phương (2000), Thực vật chí Việt Nam (Quyển 2, Họ Bạc hà – Lamiaceae Lind I.), NXB KHKT, tr 183-186 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI AOAC International (2002), AOAC Official Method 996.06: Fat (Total, Saturated, and Unsaturated) in Foods Ian Acworth et al (2012), Quantitation of underivatized omega-3 and omega-6 fatty acids in foods by HPLC and charged aerosol detection, Thermo Fisher Scientific, Chemlsford, MA, USA Mohammad Asif (2011), “Health effects of omega-3, 6, fatty acids: Perilla frutescens is a good example of plant oils", Orient Pharm Exp Med 11, pp 51–59 Mohammad Asif and Atul Kumar (2010), "Nutritional and functional characterisation of Perilla frutescencs seed oil and evaluation of its effect on gastrointestinal motility", Malaysian Pharmaceutical Sciences, Vol 8, No 1, 1–12 Journal of 41 10.Ozan Nazim Ciftci et al (2012), “Lipid components of flax, perilla and chia seeds”, Eur.J.Lipid Sci.Technol 114, pp 794-800 11 Youfang Ding et al (2012), "Charaterization of fatty acid composition from five perilla seed oils in China and its relationship to annual growth temperature", Journal of Medicinal Plants Research vol (9), pp 1645-1651 12 Flora of China 17 (1994), pp 241-242 13.Emma De Fabiami (2011), “The true story of palmitoleic acid: Between myth and reality”, Eur.J.lipid Sci Technol 113, pp 809-811 14.Aron J Fazekas, Maria L Kuzmina, Steven G Newmaster, Peter M Hollingsworth (2012.), "DNA barcoding methods for land plants", DNA Barcodes: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology vol 858, Humana Press, pp 223-252 15.Nieto Feliner G., Rosselló JA (2007), "Better the devil you know? Guidelines for insightful utilization of nrDNA ITS in species-level evolutionary studies in plants", Molecular Phylogenetics and Evolution, Volume 44, Issue 2, pp 911–919 16.Qiaosheng GUO (2009), Illutrated Seeds of Chinese Medicinal Plants, China Higher Education Press, Beijing, pp 307 17.Chen M H et al (2005), “A rapid procedure for analysing rice bran tocopherol, tocotrienol and γ-oryzanol contents”, Journal of Food Composition and Analysis 18, pp 319-331 18.Wanna Kanchanamayoon et al (2007), “Determination of some fatty acids in local plant seeds”, Chiang Mai J Sci 34 (2) 19.Hollingsworth P.M et al (2009), "A DNA barcode for land plants", Proc Natl Acad Sci USA, 106 (31), pp 12794-7 42 20.Hollingsworth P.M (2011), "Refining the DNA barcode for land plants", PNAS vol 108 (49), pp 19451-19452 21.Talbott SM, Hughes K (2006), "Perilla seed oil (Perilla frutescens), The health professional's guide to dietary supplements, Lippincott Williams & Wilkins, pp.258-260 22.Hollingsworth P.M (2011), "Choosing and using a plant DNA barcode", PLoS ONE vol 6, issue 5, e 19254 23.Metagenics (2013), Clinical application of omega-7 and omega-3 fatty acids in cardiovascular health 24.Paul Nestel et al (1994), “Effects of increasing dietary palmitoleic acid compared with palmitic and oleic acids on plasma lipids of hypercholesterolemic men”, Journal of Lipid Research Vol 35,pp 656662 25.Miyuki Nitta et al (2003), "Asia Perilla crops and their weedy forms: Their cultivation, utilization and genetic relationships", Economic Botany 57(2), pp 245-253 26.Anjula Pandey and K.C Bhatt (2008), “Diversity distribution and collection of genetic resources of cultivated and weedy type in Perilla frutescens (L.) Britton var frutescens and their uses in India Himalaya”, Genet Resour Crop Evol 55, pp 883-892 27.Simonpoulos A.P (2002), “Importance of the ratio of omega-6/omega3 essential fatty acids, Biomed Pharmacother 56, pp 365-379 28.Emi Saita et al (2012), "Antioxidant activities of Perilla frutescens against low-density lipoprotein oxidation in vitro and in human subjects", Journal of Oleo Science, pp 113-120 29.Kyu Jin Sa et al (2013), “Identification of genetic variations of cultivated and weedy types of Perilla species in Korea and Japan using 43 morphological and SSR markers”, Genes & Genomics, Volume 35, Issue 5, Springer Netherlands, pp 649-659 30 Sirithon Siriamornpun, Duo Li, Lifeng Yang, Siriwan Suttajit and Maitree Suttajit (2006), "Variation of lipid and fatty acid compositions in Thai Perilla seeds grown at different locations", Songklanakarin J Sci Technol., 28(Suppl 1): 17-21 31.Maitree Suttajit et al (2014), “Contents of omega fatty acids and antioxidant activity in Perilla frutescens varieties from upper provinces in northern Thailand”, 5th Inrernational conference on Natural Products for health and beauty 32.Longvah T et al (2000), "Nutritional and short term toxicological evalutaion of Perilla seed oil", Food Chemistry 70, pp 13-16 33.Hiroyo Yamamoto and Tomohiko Ogawa (2002), "Antimicrobial activity of Perilla seed polyphenols against oral pathogenic bacteria", Biosci Biotechnol Biochem 66 (4), pp 921-924 34.Rui Carlos Zambiazi et al (2007), “Fatty acid composition of vegetable oils and fats”, B.CEPRA, Curitiba vol.25, n.1, pp 111-120 35.Ting Ting Zhao et al (2012), “Impact of roasting on the chemical composition and oxidative stability of Perilla oil”, Food Chemistry Vol 77, Nr 12, pp 1273-1278 INTERNET 36.http://www.barcodeoflife.org/content/about/what-dna-barcoding 37.http://barcoding.si.edu/dnabarcoding.htm 38.http://www.ncbi.nim.nih.gov/genbank PHỤ LỤC TIÊU BẢN CỦA MẪU NGHIÊN CỨU PHỤ LỤC Tín hiệu đọc trình tự đoạn gen rDNA vùng ITS1-5.8S-ITS2 Mồi xi ITS1 (Trang 1) Mồi xuôi ITS1 (Trang 2) PHỤ LỤC Tín hiệu đọc trình tự đoạn gen rDNA vùng ITS1-5.8S-ITS2 Mồi ngược ITS4 (Trang 1) Mồi ngược ITS4 (Trang 2) PHỤ LỤC Phiếu kết phân tích thành phần dầu (1) PHỤ LỤC Phiếu kết phân tích thành phần dầu (2) PHỤ LỤC Phiếu kết phân tích thành phần dầu (3) PHỤ LỤC Phiếu kết phân tích thành phần dầu (4) ... Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LƯƠNG THỊ KIM CHI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN DẦU HẠT CỦA CÂY TÍA TƠ TRẮNG THU HÁI TẠI XÃ MƯỜNG VI, HUYỆN BÁT XÁT, TỈNH LÀO CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP... CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu thiết bị 2.1.1 Mẫu nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm thực vật: phần mặt đất Tía tơ trắng P1 thu hái thôn Cửa Cải, xã Mường Vi, huyện Bát Xát,... (2007) thành phần acid béo số dầu thực vật [34] Kết cho thấy dầu hạt Tía tơ P1 nghiên cứu có hàm lượng acid béo tương đồng với dầu hạt Tía tơ Thái Lan Bên cạnh so sánh với loại dầu thực vật khác, thành