Dùng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) để tìm kháng thể chống lại virus VNNB trên heo thịt của hộ chăn nuôi và heo trang trại.. Từ đó khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên tình t[r]
(1)Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀViêm não Nhật Bản (VNNB) bệnh nhiễm trùng cấp tính loại siêu vi trùng thuộc nhóm Arbovirus có tính với tế bào thần kinh Virus lây truyền qua người nhờ trung gian loại trùng muỗi Bệnh xảy rải rác hay thành dịch
Tùy theo mức độ vị trí bị tổn thương hệ thần kinh trung ương, lâm sàng có biểu triệu chứng nơi bị xâm phạm như: viêm não, viêm màng não, viêm sừng trước tủy sống bệnh cảnh phối hợp: viêm màng não, viêm não, màng não tủy sống Heo động vật cảm nhiễm cao (so với lồi động vật có vú chim), đóng vai trị quan trọng tàng trữ truyền mầm bệnh cho người nhiều loài động vật khác ( Võ Cơng Khanh.2008)
Trên lồi heo, virus thường không gây triệu chứng mà nhiễm trùng thầm lặng, trừ trường hợp nặng : Trên heo nái: Sẩy thai, heo sinh chết ( thai khơ) Trên heo nọc : Giảm tính hăng, giảm lượng tinh trùng (Trần Thanh Phong 1996)
Trên người, bệnh viêm não NB thường xảy trẻ em, virus tác động đến hệ thần kinh trung ương với biểu : co giật , gây viêm não, gây tử vong cao, dẫn đến tàn tật suốt đời ( Võ Công Khanh.2008)
(2)diện tỷ lệ nhiễm virus VNNB heo thịt địa bàn huyện Cần Đước , tỉnh Long An Được phân công trường Đại Học Nông Lâm TPHCM, khoa chăn nuôi thú y, với hướng dẫn thầy Lê Anh Phụng, tiến hành đề tài “ Khảo sát tình hình nhiễm virus viêm não Nhật Bản heo nuôi thịt địa bàn huyện Cần Đước – Tỉnh Long An ”
1.2 MỤC ĐÍCH VÀ U CẦU 1.2.1 Mục đích
Điều tra tỷ lệ nhiễm yếu tố liên quan đến tỷ lệ nhiễm virus viêm não Nhật Bản heo thịt địa bàn huyện Cần Đước, nhằm để làm sở cho việc đề xuất số biện pháp phòng bệnh
1.2.2 Yêu cầu
Dùng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) để tìm kháng thể chống lại virus VNNB heo thịt hộ chăn nuôi heo trang trại Từ khảo sát số yếu tố ảnh hưởng lên tình trạng nhiễm virus VNNB heo thịt địa bàn khảo sát
Xác định hiệu giá kháng thể mẫu huyết dương tính
(3)
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
2.1.1Thời gian : từ tháng 12/ 2010 đến tháng 3/2011 2.1.2 Địa điểm
Địa điểm lấy mẫu xã: Tân Trạch, Phước Vân, thuộc huyện Cần Đước, tỉnh Long An
Địa điểm xét nghiệm mẫu : Phịng thí nghiệm vi sinh, khoa chăn nuôi Thú Y trường Đại Học Nông Lâm TPHCM
2.2 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 2.2.1 Mẫu khảo sát
Huyết heo thịt nhóm đối tượng trại chăn ni hộ chăn ni Huyết heo thịt từ 2-3 tháng, 4-5 tháng tháng
2.2.2 Hồng cầu ngỗng
Ta chọn ngỗng đực trắng ( ngỗng hay không bị lai ) trưởng thành khơng tình trạng thay lông
2.2.3 Kháng nguyên viêm não Nhật Bản
Là kháng nguyên chết, chiết với acetone- ether từ não chuột tiêm virus Kháng nguyên thuộc chủng Nakayama viện Pasteur TPHCM cung cấp
2.2.4 Hóa chất dụng cụ
(4)Dung dịch ACD ( acid citrat dextrose ) Dung dich DGV ( dextrose gelatin veronal )
Kaolin 25% trộn Kaolin với nước cất theo tỉ lệ 1:3 Cồn sát trùng 70 độ, chất tẩy rửa
Dụng cụ: máy li tâm, máy lắc, tủ lạnh , thùng đựng đá, ống nghiệm , ống eppendorf, bơng gịn, nhãn dán mẫu, syringe kim , micropipet, vĩ 96 giếng
2.3 Nội dung khảo sát
Thu thập mẫu huyết heo thịt từ hộ chăn nuôi trại chăn nuôi, địa bàn huyện Cần Đước Sau dùng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) phát kháng thể heo bị nhiễm
So sánh tỉ lệ nhiễm theo tuổi heo thịt
So sánh tỉ lệ nhiễm heo hộ chăn nuôi trại chăn nuôi So sánh tỉ lệ nhiễm heo địa bàn xã
Hiệu giá kháng thể kháng virus VNNB mẫu huyết heo thịt theo hạng tuổi
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Bố trí lấy mẫu huyết thanh
Mẫu huyết heo lấy từ hộ chăn nuôi trại chăn nuôi thuộc địa bàn xã: Tân Trạch, Phước Vân
(5)Hộ chăn nuôi: chọn ngẫu nhiên 30 hộ cho xã danh sách theo thứ tự abc, hộ lấy mẫu huyết
Bảng2.1 Bố trí lấy mẫu huyết heo thịt S
TT Xã
Hô chăn nuôi Trại chăn nuôi Tổng cộng 2-3
tháng
4-5 tháng
Trên 5tháng
2-3 tháng
4-5 tháng
Trên 5tháng
1 Tân Trạch 10 10 10 10 10 10 60
2 PhướcVân 10 10 10 10 10 10 60
Tổng 20 20 20 20 20 20 120
2.4.2 Cách lấy mẫu bảo quản mẫu
*Cách lẫy mẫu
Lấy máu tĩnh mạch tai, số lượng lấy từ 2-3ml
Chắt lấy phần huyết khoảng 1ml cho vào ống eppendort Ghi ký hiệu mẫu thông tin mẫu vào sổ theo dõi
* Bảo quản mẫu
Bảo quản mẫu nhiệt độ 40C – 80C xét nghiệm
Mẫu huyết đạt yêu cầu mẫu không bị dung huyết
2.4.3 Các bước chuẩn bị xét nghiệm
2.4.3.1 Chuẩn bị hồng cầu ngỗng
Lấy máu ngỗng theo tỷ lệ 1,5ml dung dịch ACD (acid citrat dextrose) 8,5ml máu ngỗng Rửa hồng cầu 04 lần dung dịch DGV (dextrose gelation veronal) theo tỷ lệ 1/3 Mỗi lần rửa ly tâm 2500 vòng/ phút, thời gian 10 phút, chắt bỏ nước
(6)Rửa lần 2, 3, 4: Thể tích DGV gấp lần thể tích máu lại sau lần rửa Sau lần rửa 4, xác định thể tích hồng cầu phương pháp Hematocrit
Pha loãng hồng cầu thành huyễn dịch 8% dung dịch DGV, bảo quản 40C.
Khi sử dụng từ huyễn dịch hồng cầu 8% pha loãng 1/24 với dung dịch VAD (virus adjusting diluent) có pH: 6,2 có huyễn dịch hồng cầu 0,33% dùng phản ứng HI (Haemagglutination Inhibition)
2.4.3.2 Xử lý huyết thanh
Trước làm phản ứng phải xử lý huyết để loại bỏ chất kìm hãm gây ngưng kết hồng cầu không đặc hiệu
* Hấp thụ với Kaolin
Lấy huyết trộn với dung dịch Borat pH = dung dịch Kaolin 25% theo tỷ lệ 1:4 :5
Lắc kỹ sau phút (lắc – lần), để tiếp xúc nhiệt độ phòng 15 phút Đem ly tâm 2.500 vòng/phút – 10 phút, chiết lấy huyết bên Bảo quản ngăn mát tủ lạnh
(Huyết sau xử lý có độ pha loãng 1/10)
* Hấp thụ với hồng cầu
Cho 1ml huyết xử lý với Kaolin vào ống nghiệm, để nước đá tan, cho thêm giọt hồng cầu đặc (50l), để tiếp xúc 20 phút, lắc nhẹ sau phút
Ly tâm 2500 vòng/ phút – 10 phút Chiết lấy huyết bảo quản 40C.
2.4.4 Chuẩn độ kháng nguyên ( phản ứng HA: Haemagglutination )
2.4.4.1Mục đích
(7)2.4.4.2Nguyên lý
Virus VNNB có khả gây ngưng kết hồng cầu nhờ phân tử enzym haemagglutinin (H) Trong hỗn dịch có chứa hồng cầu, có diện virus này, ta quan sát thấy tượng hồng cầu bị ngưng kết Trường hợp ngược lại hồng cầu tự lắng xuống tạo nên tượng đóng nút Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) dùng để chuẩn độ virus có khả gây ngưng kết hồng cầu tìm độ pha lỗng huyễn dịch virus dùng để thực phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
* thành phần tham gia phản ứng Dung dịch Borat pH :
Kháng nguyên virus ( chủng Nakayama) Huyễn dịch hồng cầu 0,33%
2.4.4.3phương pháp thực hiện
Cho 50µl dung dịch Borat pH :9 vào vĩ nhựa 96 giếng có đáy hình chữ U, từ giếng thứ đến giếng thứ 12
Cho 50µl dung dịch kháng nguyên vào giếng thứ nhất, pha loãng bậc dung dịch Borat pH : từ giếng thứ đến giếng thứ 11 Bỏ di 50µl giếng thứ 11 Giếng thứ 12 dùng làm đối chứng
Cho 50µl huyễn dịch hồng cầu pha lỗng 0,33% (từ huyễn dịch hồng cầu 8% dung dịch VAD) vào tất giếng (1- 12) để nhiệt độ phịng 30 phút, sau đọc kết
2.4.4.4 Đọc kết quả
Dương tính ++++ : hồng cầu tạo lớp mỏng che kín đáy giếng
(8)Dương tính ++ : đại đa số hồng cầu tụ lại đáy giếng thành cụm, xung quanh có hồng cầu ngưng kết lấm
Hiệu giá ngưng kết kháng nguyên độ pha loãng cuối kháng nguyên khả ngưng kết mức độ “++++” hay “ +++” Ở độ pha loãng này, ta gọi đơn vị ngưng kết hồng cầu (1 đơn vị HA)
Bảng 2.2 Cách thực phản ứng HA Giếng
Thành phần
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Dung dịch
Boat pH: (l) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 KN đặc (l) cho
vào giếng 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Độ pha loãng
của KN 1/2 1/4 1/8 … … … …
1/ 2048 HC ngỗng
0,33% (l) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Trộn Để nhiệt độ phòng 30 phút
( KN : kháng nguyên; HC : hồng cầu)
2.4.5 Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI: Haenagglutination Inhibition)
2.4.5.1 Mục đích
Tìm kháng thể kháng virus VNNB
Định tính định lượng hiệu giá kháng thể huyết
(9)Trong phản ứng HI có tham gia hồng cầu, kháng nguyên virus kháng thể đặc hiệu
Kháng thể đặc hiệu kết hợp với virus làm cho virus gắn với hồng cầu, hồng cầu tự lắng xuống tạo nên tượng đóng nút ( HI dương tính)
Nếu khơng có kháng thể tương ứng với kháng nguyên virus, kháng nguyên có phản ứng kết hợp với hồng cầu gây nên tượng ngưng kết hồng cầu ( HI âm tính)
*Các thành phần tham gia phản ứng HI
Dung dịch Borat có pH:
Huyết xử lý ( pha loãng 1/10) Kháng nguyên virus (chủng Nakayama) Huyễn dịch hồng cầu 0,33%
* Phương pháp thực hiện
Tương tự phản ứng HA, phản ứng HI tiến hành sau , hút lấy 25µl dung dịch Borat pH:9 cho vào giếng ( từ giếng thứ đến giếng thứ 11 theo hàng ngang), vĩ 96 giếng có đáy hình chữ U Riêng giếng 12 cho 50µl dung dịch Borat pH :
Kế đến cho 25µl huyết xử xử lý vào giếng thứ trộn pha loãng bậc từ giếng thứ đến giếng thứ 9, bỏ 25µl từ giếng Cho thêm 25µl huyết xử lý vào giếng thứ 10 để làm đối chứng huyết
Tiếp tục cho 25µl kháng ngun ( có đơn vị HA) vào giếng từ giếng thứ đến giếng thứ vào giếng 11 lắc Giếng thứ 11 dùng làm đối chứng kháng nguyên
Để tiếp xúc nhiệt độ phòng tối thiểu qua đêm độ c
(10)2.4.5.3 Các giếng đối chứng thực ( giếng10,11,12)
Đối chứng kháng nguyên : cho 25µl kháng nguyên có ( đơn vị HA), vào giếng thứ 10 để chứng tỏ kháng ngun có đầy đủ tính gây ngưng kết hồng cầu ngỗng
Đối chứng huyết thanh: cho 25µl huyết (đã xử lý) vào giếng thứ 11 để chứng tỏ huyết loại hết chất gây ngưng kết hồng cầu không đặc hiệu
Đối chứng hồng cầu : Giếng thứ 12 dùng để chứng tỏ hồng cầu khả lắng tụ tốt ( đống nút), khơng ngưng kết
Tính hiệu giá phản ứng HI
Tính hiệu giá phản ứng HI: Hiệu giá phản ứng HI tính theo độ pha loãng huyết giếng cuối cho kết dương tính ( hồng cầu đóng nút)
+ Dương tính giếng tương ứng với hiệu giá 1/20 + Dương tính giếng tương ứng với hiệu giá 1/40 + Dương tính giếng tương ứng với hiệu giá 1/80 ……… Dương tính giếng tương ứng với hiệu giá 1/5120
Bảng2.3 Cách thực phản ứng HI
Giế ng
Thà nh phầ n
Giế ng xét ngh iệm
(11)H T K N H C
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Dun g dịch Boa t pH: (l)
25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50
HT xử lý (pha loãn g 1/10 (l)
25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Độ pha loãn g huy ết than h 1/2
0 1/40 1/80 … … … … …
1/ 512 KN pha đơn vị HA (l)
25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
(12)HC ngỗ ng 0,33 % (l)
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Để 40C vòng
(HT: Huyết thanh, KN: Kháng nguyên virus, HC: Hồng cầu)
2.5 Các tiêu theo dõi
- Tỷ lệ nhiễm virus VNNB heo thịt theo khu vực xã
- Tỷ lệ nhiễm virus VNNB heo thịt hộ chăn nuôi heo trang trại - Tỷ lệ nhiễm virus VNNB heo thịt theo nhóm tuổi
- Hiệu giá kháng thể virus VNNB mẫu huyết heo thịt
Tỷ lệ nhiễm virus phần trăm số mẫu đem xét nghiệm có phản ứng ngăn trở
ngưng kết hồng cầu (phản ứng HI) dương tính
Tỷ lệ nhiễm ( % )=
Số mẫu có phản ứng HI dương tính x 100 Tổng số mẫu đem xét nghiệm
2.6 Phương pháp xử lý số liệu:
Phần mềm Excel sử dụng để lập bảng vẽ biểu đồ so sánh tỷ lệ trắc nghiệm X2 (chi-square) thuộc phần mềm Minital
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
(13)Số mẫu khảo sát Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) 120
Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm virus VNNB heo thịt địa bàn khảo sát
Thôn Tổng số mẫu Số mẫu nhiễm Tỷ lệ nhiễm (%)
Tân Trạch 60
PhướcVân 60
Tổng 120
Bảng 3.3 Tỷ lệ nhiễm virus VNNB hộ chăn ni trại chăn ni
Nhóm heo Số mẫu xét nghiệm Số mẫu nhiễm Tỷ lệ %
Hộ chăn nuôi 60
Trại chăn nuôi 60
Bảng 3.4 Tỷ lệ nhiễm virus VNNB theo tháng tuổi heo thịt hộ chăn nuôi
Tuổi Số mẫu xét nghiệm Số mẫu nhiễm Tỷ lệ
nhiễm( %)
2-3 tháng 20
4-5 tháng 20
Trên tháng 20
Tổng 30
(14)
Tuổi Số mẫu xét nghiệm Số mẫu nhiễm Tỷ lệ nhiễm( %)
2-3 tháng 20
4-5 tháng 20
Trên tháng 20
Tổng 60
Bảng 3.6 Hiệu giá kháng thể chống virus VNNB heo thịt
Mẫu 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 Tổng
Số mẫu (+) Tỷ lệ %
Tài liệu tham khảo
1 Nguyễn Văn Hải, 2010 “ Khảo sát tình hình nhiễm virus viêm não Nhật Bản heo nái heo thịt” Khóa luận tốt nghiệp trường Đại Học Nông Lâm TPHCM
2 Huỳnh Thị Thu Hương, 2002 Điều tra tình hình nhiễm virus viêm não Nhật Bản trên đàn heo huyện Củ Chi
3 Võ công khanh, 2008 Bệnh VNNB người Trung tâm Bệnh Nhiệt Đới HCM
4 Trần Thanh Phong, 1996 Giao trình bệnh truyền nhiễm virus heo Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm TPHCM
5 Lê Anh Phụng, Trần Thị Bích Liên, 1999 Giáo trình virus thú y chuyên biệt Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM
(15)