Từ các kết quả xét nghiệm mẫu bắt cặp kháng nguyên - kháng thể của từng cá thể chó, các tác đã xác định giá trị ngưỡng hiệu giá kháng thể HI trong huyết thanh chó nguyên dạng ứng với mức bảo hộ miễn dịch của chó. Đồng thời, với ngưỡng bảo hộ được xác lập đó, hiệu quả tiêm vaccine CPV trên địa bàn nghiên cứu đã được đánh giá.
TẠP CHÍ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ NƠNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 4(3)-2020:2129-2139 XÁC LẬP THÔNG SỐ CHỈ BÁO MỨC BẢO HỘ MIỄN DỊCH CỦA KHÁNG THỂ CHỐNG BỆNH DO PARVOVIRUS (CPV) TRONG HUYẾT THANH CHĨ Phạm Hồng Sơn*, Ngơ Thị Thanh Trà Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế *Tác giả liên hệ: sonphdhnl@huaf.edu.vn Nhận bài: 08/09/2020 Hoàn thành phản biện: 18/10/2020 Chấp nhận bài: 29/10/2020 TÓM TẮT Được coi “tiêu chuẩn vàng” đánh giá miễn dịch đặc hiệu phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) chưa vận dụng thực tế để kiểm sốt chất lượng vaccine phịng bệnh CPV chó Hơn nữa, hiệu giá kháng thể huyết xét nghiệm HI thường nhật thường thấp mức số nhóm trước sử dụng làm ngưỡng bảo hộ miễn dịch đòi hỏi thiết lập lại quy trình Trong nghiên cứu này, phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) HI thực với thể tích 25 μL thành phần gồm dung dịch NaCl 0,9%, dịch hồng cầu gà 1%, dịch virus vaccine CPV hiệu giá 04 HAU huyết nguyên dạng chó tiêu chảy xuất huyết Đối chiếu kết HI huyết với kết phát kháng nguyên CPV phân theo cá thể xác minh mức kháng thể HI log2 trở lên theo quy trình báo trạng thái bảo hộ miễn dịch chống CPV chó Nghiên cứu cho thấy vaccine CPV sử dụng khu vực thành phố Huế có hiệu lực, cường độ miễn dịch nhóm chó tiêm vaccine (60,59 HIU) cao (P < 0,001) so với nhóm chưa tiêm (6,73 HIU) Tương tự, tỷ lệ chó mắc bệnh CPV (có virus phân) nhóm tiêm vaccine (2,63%) thấp (P < 0,001) so với nhóm chưa tiêm (59,38%) Từ khóa: Bảo hộ miễn dịch, Chó, Huyết thanh, Parvovirus, Tiêu chảy DETERMINATION OF A PARAMETER INDICATING PROTECTIVE LEVELS OF IMMUNE ANTIBODIES IN DOGS’ SERA AGAINST CANINE PARVOVIRUS (CPV) Pham Hong Son*, Ngo Thi Thanh Tra University of Agriculture and Forestry, Hue University ABSTRACT Though considered as “the gold standard” for evaluation of specific immunity, the reaction of haemagglutination inhibition (HI) is still not applied in practice for controlling the quality of CPV vaccination in dogs Moreover, that serum antibody titers in our routine HI tests are often much lower than the level previous authors applied as the threshold of immune protection requested reestablishing the procedures In this research, the techniques of haemagglutination (HA) and HI reactions were performed with the same pipette volumes of 25 μL of 0.9% saline solution, chicken red blood cell 1% suspension, CPV vaccine virus of HAU titre and untreated sera of haemorrhagic diarrhea-suffered dogs Individually matching the serum antibodies and faecal CPV antigens suggested that, according to this protocol, the level of log2 HI of serum antibody titer be an indicator of protective immune status of dogs against CPV The study also showed that the CPV vaccines used in the studied region were effective as the immune intensity in vaccinated dogs was much higher (60.59 HIU) than (P < 0.001) in unvaccinated dogs (6.73 HIU) In addition, the rate (2.63%) of dogs contracted with CPV (having the virus in their faeces) amongst the vaccinated dogs was much (P < 0.001) lower than that (59.38%) of the unvaccinated ones Keywords: Diarrhea, Dog, Immune protection, Serum, Parvovirus http://tapchi.huaf.edu.vn 2129 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY MỞ ĐẦU Chó ni thường mắc nhiều loại bệnh Trong số bệnh viêm ruột xuất huyết chó, bệnh parvo chó CPV (Canine Parvovirus type 2) gây bệnh có tầm quan trọng tồn giới (Prettie, 2004) Với cấu trúc virion khơng có áo ngồi gene DNA sợi tái sản tự lập thuộc họ Parvoviridae (Siegl cs., 1985), parvovirus chó có tính đề kháng cao với điều kiện bất lợi môi trường nên bệnh lây lan diện rộng quần thể chó nhà chó hoang (Parrish, 1990) Chó bệnh thường viêm dày ruột, nơn mửa, tiêu chảy máu đưa đến kết trầm trọng không chữa trị kịp thời (Phạm Sỹ Lăng cs., 1998; Nguyễn Văn Dũng cs., 2018) Ở chó gây nhiễm thực nghiệm khơng điều trị tỷ lệ chết đạt đến 97% (Prettie, 2004) Bệnh lây nhiễm nhanh, tỷ lệ chó nhiễm tỷ lệ chó chết cao, thường thấy chó non từ - 20 tuần tuổi tập trung vào khoảng 08 tuần tuổi, thời điểm miễn dịch thụ động từ sữa mẹ hết mà thể chó chưa tự tạo miễn dịch (Mahon cs., 2017) Việc kiểm tra kháng thể huyết chó trước tiêm vaccine nhằm tránh tác động bất lợi kháng thể thụ động từ sữa mẹ đến vaccine để đánh giá chất lượng tiêm vaccine phòng bệnh cho đàn cần thiết Tiêm vaccine để phòng bệnh CPV cho chó xác định biện pháp phịng bệnh hữu hiệu Hiện nay, thị trường có số loại vaccine phòng bệnh CPV, chưa có nghiên cứu chỗ hiệu vaccine sau tiêm cho chó Việc mặc định tiêm vaccine có hiệu lực, tức chó miễn dịch, dẫn đến hậu đáng tiếc hiệu miễn dịch sau tiêm vaccine phụ thuộc vào chất lượng vaccine, chế độ bảo quản, liều tiêm… kỹ thuật tiêm Chó tiêm vaccine 2130 ISSN 2588-1256 Vol 4(3) 2020:2129-2139 mà khơng có miễn dịch bảo hộ có nguy nhiễm bệnh cao khơng áp dụng biện pháp khác để phịng bệnh, đặc biệt trung tâm điều trị bệnh thú cưng Dù cần thiết, việc kiểm tra miễn dịch sau tiêm vaccine xét nghiệm có thú y phương pháp ELISA (Waner cs., 1996) hay sắc ký miễn dịch (Oh cs., 2006) nghiên cứu dịch tễ học quy mơ mẫu lớn cịn hạn chế, chủ yếu sinh phẩm thiết yếu sẵn nên giá thành cao thiếu chủ động Trong bối cảnh đó, chúng tơi chọn sử dụng kỹ thuật ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) để nghiên cứu đánh giá miễn dịch chó chống CPV áp dụng đánh giá đáp ứng miễn dịch động vật virus có thuộc tính ngưng kết hồng cầu (virus HA) biết (Phạm Hồng Sơn Nguyễn Thị Ngọc Hiền, 2017; Lê Đình Quang cs., 2018; Phan Ngọc Tuyết cs., 2018; Lê Duy Báu cs., 2019) Phương pháp HI coi “tiêu chuẩn vàng” (the gold standard) xét nghiệm định lượng kháng thể (Prittie, 2004; Oh cs., 2006) Tuy nhiên, ngưỡng hiệu giá kháng thể thị bảo hộ miễn dịch vấn đề đáng quan tâm Một số nghiên cứu tác động ức chế miễn dịch đặc hiệu sau tiêm vaccine kháng thể thụ động qua sữa mẹ phản ứng HI với hồng cầu lợn huyết chó xử lý kaolin (Carmichael cs., 1980; Pollack Carmichael, 1982) suy định áp dụng mức hiệu giá HI 1:80 làm mức tiêu chuẩn bảo hộ miễn dịch chó chống lại virus Tuy nhiên, theo nghiên cứu khác (Mahon cs., 2017) lấy mức hiệu giá HI kháng thể huyết 1:80, tức huyết chứa 80 đơn vị ngăn trở ngưng kết hồng cầu (80 HIU) đơn vị thể tích tham gia phản ứng, làm mức chuẩn nồng độ kháng thể bảo hộ có bất cập Xét nghiệm với kỹ thuật HI tương tự cho thấy có 81% Phạm Hồng Sơn Ngơ Thị Thanh Trà TẠP CHÍ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ NƠNG NGHIỆP (65/80) chó điều trị tích cực trung tâm thú y đạt mức kháng thể bảo hộ miễn dịch chống CPV trước chúng tiêm phịng bệnh Trong quy trình đó, việc xử lý huyết chó kaolin trước thực phản ứng xét nghiệm HI (Carmichael cs., 1980; Pollack Carmichael, 1982; Mahon cs., 2017) làm nhiều thời gian đòi hỏi lượng huyết lấy từ động vật phải nhiều mức cần thiết Ngồi ra, việc xử lý làm lỗng huyết nên nguồn huyết thu khơng cịn thích hợp cho xét nghiệm phát kháng nguyên virus với mục đích chẩn đốn bệnh cảm nhiễm virus HA động vật (Phạm Hồng Sơn Nguyễn Thị Ngọc Hiền, 2017; Phan Ngọc Tuyết cs., 2018; Lê Duy Báu cs., 2019) Những bất cập thúc đẩy chúng tơi phải tìm loại hồng cầu phù hợp hơn, thực trực tiếp với huyết khơng qua xử lý Từ đó, việc phát kháng nguyên Parvovirus bệnh phẩm kỹ thuật trắc định xê lệch ngăn trở ngưng kết hồng cầu trực tiếp chuẩn (SSDHI) (Nguyễn Thị Hoàng Oanh cs., 2012; Phạm Hồng Sơn Nguyễn Thị Ngọc Hiền, 2017; Phan Ngọc Tuyết cs., 2018; Lê Duy Báu cs., 2019) thực thành công với đối chứng dương tính parvovirus vaccine Bằng 02 kỹ thuật HI SSDHI, xét nghiệm xác định hiệu giá kháng thể huyết kháng nguyên Parvovirus chó dịch chiết từ phân chó bệnh tiêu chảy xuất huyết Từ kết xét nghiệm mẫu bắt cặp kháng nguyên - kháng thể cá thể chó, chúng tơi xác định giá trị ngưỡng hiệu giá kháng thể HI huyết chó nguyên dạng ứng với mức bảo hộ miễn dịch chó Đồng thời, với ngưỡng bảo hộ xác lập đó, hiệu tiêm vaccine CPV địa bàn nghiên cứu đánh giá http://tapchi.huaf.edu.vn ISSN 2588-1256 Tập 4(3)-2020:2129-2139 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu - Đánh giá khả sử dụng hồng cầu gà việc thực phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) với virus vaccine parvo chó (Biocan P, dạng lỏng) thành phần vaccine Biocan Puppy Inj (Bioveta, Szech, Công ty Greenvet định dạng cung cấp, hay Biocan Puppy Inj., Bioveta - Greenvet) - Xác định hiệu giá kháng thể huyết có mặt parvovirus phân chó tiêu chảy tiêm vaccine chưa tiêm vaccine 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu Hồng cầu thu từ máu gà trống trưởng thành Chó 03 tháng tuổi (để chắn khơng cịn chịu ảnh hưởng kháng thể thụ động từ sữa mẹ) nuôi địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế đưa đến điều trị Trung tâm Chẩn đoán Điều trị động vật thuộc Chi cục Thú y tỉnh Thừa Thiên Huế giai đoạn nghiên cứu (từ tháng 07 năm 2019 đến tháng 01 năm 2020) lý tiêu chảy xuất huyết nghi mắc bệnh CPV 2.2.2 Thiết bị vật liệu nghiên cứu Dụng cụ chủ yếu phản ứng pipet tự động có cỡ thuận tiện cho việc hút chuyển 25 µL khay vi chuẩn độ (microtitration plate) 96 lỗ đáy U Vật liệu chủ yếu cho phản ứng gồm dung dịch sinh lý NaCl (NaCl 0,9% nước), dung dịch chống đông máu (natri citrate 3%), vaccine bệnh parvovirus chó (parvo virus enteritidis canis) vô hoạt (thành phần P vaccine Biocan Puppy Inj., Bioveta Greenvet, dạng lỏng), huyền dịch hồng cầu gà 1% Đồng thời thành phần D (virus febris contagiose canis vaccine, đông khô) vaccine sử dụng làm nguồn 2131 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY kháng nguyên virus làm đối chứng cho kết phản ứng HA virus vaccine CPV) 2.2.3 Lấy mẫu xét nghiệm Hồng cầu gia cầm lấy từ tĩnh mạch cánh vào bơm tiêm chứa dung dịch chống đơng máu phịng thí nghiệm thu lị mổ cách hứng bình chứa dung dịch chống đơng máu dịng máu gia cầm bị cắt tiết, lắc nhẹ cho trộn với chất chống đông máu Thêm dung dịch sinh lý muối, trộn quay ly tâm 2.000 vòng/phút 02 phút để giữ lại cặn tế bào đáy ống Lặp lại việc trộn dịch sinh lý rửa 02 lần Sau quay ly tâm lần cuối, thể tích hồng cầu hút từ đáy ống nghiệm pipet pha vào 100 thể tích dung dịch sinh lý Huyết chó chiết theo cá thể từ máu lấy từ tĩnh mạch cảnh cho máu đông dọc thành ống bơm tiêm đến huyết tách rót vào ống Eppendorf bảo quản tủ lạnh âm 10oC làm xét nghiệm Phân chó tiêu chảy lấy vào bao PE thêm vào lượng nước cất tương đương, vị từ phía ngồi bao đầu ngón tay cho phân trộn đều, để nghiêng cho dịch chảy sang góc bao, hút 1,0 mL vào ống Eppendord quay ly tâm 15.000 vòng/phút 05 phút hút lấy 0,1 mL dịch suốt chuyển sang ống để làm nguyên liệu xét nghiệm nắp kín để bảo quản âm 10oC xét nghiệm Ngồi ra, q trình lấy mẫu, thơng tin liên quan đến chó lấy mẫu tính biệt, tuổi, cân nặng, tiêm phịng, hình thức ni… thu thập kèm theo Trước xét nghiệm, mẫu huyết dịch phân để rã đơng hồn tồn nhiệt độ phịng trộn 2132 ISSN 2588-1256 Vol 4(3) 2020:2129-2139 2.3 Tiến trình thí nghiệm 2.3.1 Kiểm tra thuộc tính ngưng kết hồng cầu (HA) virus vaccine cần kiểm Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) thực với 25 µL yếu tố: dung dịch sinh lý, huyền dịch hồng cầu gà 1% dịch virus vaccine cần kiểm có bố trí đối chứng âm tính hai lỗ cuối (số 11 12) mô tả trước (Phạm Hồng Sơn Nguyễn Thị Ngọc Hiền, 2017) Khi hai lỗ số 11 12 hồng cầu chìm tâm đáy tạo thành chấm đỏ đọc kết dãy phản ứng lỗ lại Hiệu giá ngưng kết hồng cầu (HA) dịch virus gốc xác định độ pha lỗng lớn dịch virus cịn cho kết tương phản với lỗ 11 12 Đại lượng số đơn vị ngưng kết hồng cầu, hay số HAU, biểu số lượng tối thiểu thể tích 25 µL pha từ dịch virus (vaccine) gốc đủ để làm lượng 0,25 mg tế bào hồng cầu 25 µL huyền dịch (mỗi lỗ) kết nối với thành mạng lưới (ngưng kết) chắn 2.3.2 Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) kiểm tra hiệu giá kháng thể huyết Phản ứng HI sử dụng kháng nguyên virus vaccine HAU, huyền dịch hồng cầu 1% dung dịch sinh lý NaCl để pha lỗng mẫu huyết cần kiểm mơ tả trước (Phạm Hồng Sơn Nguyễn Thị Ngọc Hiền, 2017) với lượng đồng 25 µL dung dịch sinh lý, huyết cần kiểm, dịch virus vaccine HAU dịch hồng cầu gà 1% từ phản ứng HA từ mục Các lỗ số 11 12 sử dụng để xác định thời điểm đọc phản ứng, lỗ thứ 10 khơng có huyết để làm đối chứng HA Phản ứng HI dương tính có biểu tương tự lỗ số 11 12 Phạm Hồng Sơn Ngơ Thị Thanh Trà TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP 2.3.3 Phản ứng trắc định xê lệch ngăn trở ngưng kết hồng cầu trực tiếp chuẩn (SSDHI) Ngoài huyền dịch hồng cầu gà 1% virus vaccine HAU nêu trên, phản ứng SSDHI cịn cần có thêm dịch huyết có nồng độ log2 HI điều chỉnh đến gần mức 16 đơn vị HI, hay 16 HIU, với khoảng xê lệch 10% (tức khoảng 16 - 17,6 HIU) Để có kháng huyết tiêm vaccine CPV (thành phần P Biocan Puppy Inj., Bioveta Greenvet) cho chó ba lần, hai lần tiêm cách 04 tuần, lần cuối cách lần trước ngày lấy máu để thu huyết vào ngày thứ 10 sau lần tiêm cuối Phản ứng SSDHI thực với dịch chiết từ phân chó khay vi chuẩn độ 96 lỗ đặt dọc để có 12 dãy dãy lỗ, 11 dãy dùng cho phản ứng xét nghiệm mẫu cần kiểm dãy lại dành cho mẫu đối chứng âm tính Dãy đối chứng âm tính có phản ứng HI thực lại với kháng huyết chuẩn log2 HI Các dãy kiểm khác với dãy chuẩn chỗ 25 µL dung dịch sinh lý lỗ thứ thay 25 µL dịch phân chó trước cho 25 µL huyết chuẩn log2 HI vào dãy lỗ để tiếp tục thao tác thực lại HI 2.4 Xử lý số liệu Tỷ lệ chó nhiễm parvovirus chó có kháng thể CPV tính từ thương số tổng cá thể dương tính so với tổng số mẫu xét nghiệm Giá trị trung bình nhân hiệu giá kháng thể (GMT) tính tốn qua đại lượng trung bình cộng giá trị logarit hóa hiệu giá mẫu kiểm, tức , T1, T2,… Tn hiệu giá mẫu Giá trị sử dụng cường độ miễn dịch quần thể (miễn dịch đàn) chó địa bàn nghiên cứu (Surin cs., 1986) Sự khác biệt tỷ lệ kiểm định http://tapchi.huaf.edu.vn ISSN 2588-1256 Tập 4(3)-2020:2129-2139 theo giá trị P từ chisq.test (Snedecor Cochran, 1980) Chỉ số hiệu giá kháng thể bảo hộ miễn dịch xác định cách xác định biên độ hiệu giá kháng thể huyết nhóm chó tiêu chảy mang virus Giá trị hiệu giá kháng thể cao biên độ coi mức hiệu giá kháng thể bảo hộ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết khảo sát thuộc tính ngưng kết CPV với hồng cầu gà Qua nhiều lần lặp lại việc trộn dãy pha loãng dịch virus vaccine với hồng cầu dãy lỗ khay vi chuẩn độ (Bảng ảnh bên trái Hình 1) chúng tơi khẳng định virus parvo chó (CPV) gây ngưng kết hồng cầu gà trống trưởng thành cách chắn, không bị ảnh hưởng yếu tố cá thể gà Hình ảnh cho thấy với thể tích đồng 25 μL dịch hồng cầu gà 1% virus vaccine CPV pha loãng dần, biểu phản ứng HA âm tính rõ ràng, kết dương tính tương phản Phản ứng thể hiệu giá kháng nguyên virus vaccine CPV mức log2 HA (16 HAU) Phản ứng kiểm tra hiệu giá log2 HA thể rõ ràng hai lỗ đầu có ngưng kết hai lỗ sau khơng có ngưng kết Trong ảnh bên trái, hiệu giá kháng thể HI huyết chó có mức cao log2 HI (hay 256 HIU) Kết phản ứng SSDHI (ảnh bên phải) có 03 số 11 chó tiêu chảy xuất huyết có CPV phân, có 02 mẫu phân xê lệch sang trái 01 lỗ (1+) 01 mẫu phân xê lệch sang trái 02 lỗ (2+) thể có virus đặc hiệu Tất lọ vaccine CPV ngưng kết với tất mẫu hồng cầu gà trống thử, với hiệu giá virus mức ổn định, lọ có biểu log2 HA log2 HA phụ thuộc vào lô huyền dịch hồng cầu gà (có thể hút hồng 2133 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY cầu có lẫn hay khơng lẫn nhiều dung dịch sinh lý) mà không phụ thuộc vào lọ/lô vaccine làm kháng nguyên virus, lơ vaccine bệnh sài sốt chó khơng có thuộc tính cách ổn định Hồng cầu gà trống tươi thu thập từ điểm giết mổ gia cầm không cần phải xử lý đặc ISSN 2588-1256 Vol 4(3) 2020:2129-2139 biệt, bảo đảm vô trùng lấy máu vào dung dịch chống đông máu, rửa với dung dịch sinh lý muối pha tỷ lệ 1% (theo thể tích) để có kết hiệu giá ổn định qua lần xét nghiệm Hình Kết phản ứng HA (trên trái), HI (dưới trái) SSDHI (phải) Bảng Kết biểu hiệu giá virus số lọ vaccine CPV vaccine Carré theo phản ứng ngưng kết với huyền dịch 1% hồng cầu từ máu số gà trống Hiệu giá (log2) ngưng kết hồng cầu (HA) với đương lượng huyền dịch hồng cầu 1% Vaccine Gà Gà Gà Gà Gà P1 4 4 P2 4 4 P3 4 4 P4 4 4 D1 0 0 D2 0 0 D3 0 0 D4 0 0 Từ kết thử thách mẫu hồng cầu với mẫu virus vaccine khẳng định huyền dịch hồng cầu gà trống hỗn hợp dịch với virus CPV bị kết nối với tạo mạng lưới đa chiều lơ lửng dịch sinh lý cách ổn định Hiện tượng ngưng kết hồng cầu (HA) virus sử dụng phương tiện phát định lượng virus dịch virus khiết (lứa cấy, vaccine) xác định hàm lượng kháng thể đặc hiệu chống virus dạng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) từ lâu (Hirst, 1941; Clarke Casals, 1958) Do phản ứng HA thuộc tính tự nhiên số virus hồng cầu số động vật, liên kết kháng 2134 nguyên-kháng thể phản ứng HI đặc hiệu biểu rõ ràng nên phản ứng HI coi “tiêu chuẩn vàng” việc xác định tình trạng miễn dịch chống virus động vật Với trường hợp parvovirus chó, lần áp dụng phản ứng HA HI Tuy nhiên, hồng cầu gà dạng huyền dịch 1% lượng ổn định 25 μL phản ứng với parvovirus huyết chó sử dụng dạng ngun sơ (khơng xử lý) lần đầu Ưu điểm hồng cầu gà loại hồng cầu có nhân bền hồng cầu lợn việc thu hoạch hồng cầu từ máu gà giết mổ (ở gia đình, chợ điểm giết mổ) dễ dàng nhiều Kết trình bày Bảng Hình Phạm Hồng Sơn Ngơ Thị Thanh Trà TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP (ảnh bên trái) cho thấy với nồng độ 1% thể tích thành phần 25 μL phản ứng HA thể rõ ràng, dễ đọc kết Với lượng 25 μL hồng cầu pha thêm vào dịch sinh lý lượng tương đương, huyền dịch hồng cầu trở thành 0,5% thể ngưng kết đồng bốn lỗ Ở lỗ thứ 05 (ảnh bên trái Hình 1) biểu sa lắng tự nhiên hồng cầu khơng hồn tồn lỗ đối chứng âm tính (số 11 12) chứng tỏ virus có nồng độ cao mức trung gian để có tế bào hồng cầu kết nối với qua số lượng đủ lớn hạt virus, kết nối thưa hồng cầu chìm xuống tập trung lại sát gần tâm đáy lỗ khay có kết nối đủ dày để thể khác biệt so với lỗ đối chứng âm tính Trong trường hợp này, cần điều chỉnh giảm nồng độ virus huyền dịch tham gia phản ứng để khơng cịn biểu ngưng kết trung gian áp dụng cho phản ứng HI Kết pha loãng virus với tỷ tệ 1/5 (01 phần virus gốc với 04 phần dung dịch sinh lý) thay cho tỷ lệ 1/4 (01 phần virus với 03 phần dung dịch sinh lý) để chuyển từ hiệu giá log2 HA hiệu giá log2 HA cho kết phản ứng log2 HA có khác biệt rõ ràng ngưng kết không ngưng kết (ảnh bên trái Hình 1) chứng tỏ điều Tuy vậy, cịn có điểm cần lưu ý khác huyền dịch hồng cầu gà 1% cho kết hiệu giá HA virus vaccine (16 HAU 32 HAU) thấp nhiều so với hiệu giá tối thiểu 1024 HAU (tức 10 log2 HA) nhà sản xuất công bố Điều bề mặt tế bào hồng cầu gà có nhiều thụ thể hấp thụ virus parvo so với bề mặt tế bào lợn Bên cạnh đó, việc sử dụng huyền dịch hồng cầu có nồng độ thấp, thường 0,5%, địi hỏi phải tăng thể tích thành phần phản ứng đến 50 - 100 μL để có đủ lượng tế bào hồng cầu cần thiết cho việc quan sát sa lắng Khi đó, thể tích vaccine tăng tương đương diện tích bề mặt tổng số hồng cầu đơn vị thể tích huyền dịch giảm nên hấp http://tapchi.huaf.edu.vn ISSN 2588-1256 Tập 4(3)-2020:2129-2139 phụ hạt virus Điều dẫn đến làm tăng trị số biểu hiệu giá virus Từ thí nghiệm từ số liệu hãng sản xuất cơng bố, ước tính số lượng hạt virus hấp phụ tế bào hồng cầu gà nhiều gấp khoảng 10 - 20 lần so với số lượng hạt virus mà hồng cầu lợn hấp phụ Như vậy, hồng cầu gà nguyên liệu phù hợp cho phản ứng ngưng kết hồng cầu để đánh giá hiệu giá kháng nguyên virus parvo chó Tuy nhiên, kết HA với huyền dịch hồng cầu gà làm tham chiếu để so sánh với kết HA với huyền dịch hồng cầu lợn Hơn nữa, để có số liệu hiệu giá HA có tính so sánh cần phải làm rõ nồng độ thể tích thành phần tham gia phản ứng 3.2 Xác lập thông số hiệu giá kháng thể báo bảo hộ miễn dịch Hình (ảnh bên trái) cho thấy phản ứng HI với lượng đồng 25 μL thành phần hỗn hợp, tổng cộng 75 μL, với huyền dịch hồng cầu gà 1% pha loãng với huyết dịch virus HAU thành tỷ lệ cuối 0,33% thể rõ ràng ngưng kết Điều chứng tỏ tế bào hồng cầu 0,25 mg phân tán 75 μL chất dịch có khoảng cách đủ gần để tạo mạng lưới chắn qua kết nối hạt virus Khi huyết có kháng thể đặc hiệu, chúng phong bế hạt virus hỗn hợp Khi tế bào hồng cầu khơng cịn bị virus kết nối nên chìm xuống đáy lỗ lỗ đối chứng HA âm tính (lỗ 11 12 ảnh bên trái Hình 1) Số lượng hạt virus có chưa biết, có tài liệu (Carter cs., 1995) cho biết có khoảng 104 virion virus cúm đơn vị ngưng kết hồng cầu (HA unit) mà khơng cho biết thể tích đơn vị phản ứng nên khơng thể tham chiếu Khi có phản ứng HI xảy lượng ổn định kháng thể huyết phong bế hết số hạt virus dịch virus HAU đưa hoạt tính HA chúng mức gần khơng (zero) để hồng cầu trở nên tự chìm 2135 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY xuống vào tâm lỗ khay Nếu sử dụng nồng độ virus HAU (gấp đôi) cho phản ứng HI với huyền dịch hồng cầu 1% số lượng phân tử kháng thể đặc hiệu phải cao gấp đôi so với trường hợp dịch virus HAU Như vậy, hiệu giá HI 1:80 xác định với dịch virus HAU nhóm tác giả trước (Carmichael cs., 1980; Pollack Carmichael, 1982; Oh cs., 2006) tương đương với hiệu giá HI 1:160 theo cách thực HI chúng tơi Mức hiệu giá 160 HIU cao so với kết thu (cao log2, tức 256 HIU) Nếu so với việc vận dụng mức hiệu giá HI quy đổi 1:160 làm báo bảo hộ miễn dịch việc tiêm vaccine CPV phịng bệnh cho chó nghiên cứu chúng tơi thất bại q chó (03 số 38 con) thu bảo hộ miễn dịch Nếu lấy từ mức thấp hơn, từ log2 HI (128 HIU), có 13 số 38 chó tiêm vaccine CPV (34,2%) đạt mức bảo hộ miễn dịch Trong đó, muốn ngăn chặn dịch lây lan cần từ 70% trở lên cá thể có miễn dịch hữu hiệu (Shimizu cs., 1999) Ngược lại, Carmichael cộng (1980) coi huyết có hiệu giá kháng thể HI mức 1:40 (tức 40 HIU) âm tính kháng thể miễn dịch (immunonegative) Nếu áp dụng mức vào nghiên cứu có đến 24 số 38 (63,16%) tiêm vaccine CPV khơng có miễn dịch Bất cập đề cập nhóm nghiên Mahon cs (2017) Vì vậy, khơng liên hệ với tình trạng mắc bệnh CPV (có virus phân) khơng mắc bệnh CPV (khơng có virus phân) từ xét 2136 ISSN 2588-1256 Vol 4(3) 2020:2129-2139 nghiệm phát virus kết tiêm vaccine CPV nghiên cứu khơng giải thích Kết xét nghiệm kỹ thuật SSDHI Hình (ảnh bên phải) giúp xác định kết chẩn đoán lâm sàng trường hợp mắc bệnh Parvovirus chó Đồng thời, từ phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu với mẫu huyết thu từ chó tiêu chảy xuất huyết chúng tơi thiết lập bảng tương liên kết theo mức hiệu giá kháng thể HI (Bảng 2) Từ kết Bảng ta thấy tất cá thể có hiệu giá kháng thể chống CPV từ mức log2 HI (16 HIU) trở lên khơng có virus phân tiêu chảy, tức tiêu chảy CPV Như vậy, mức kháng thể log2 HI xứng đáng coi báo mức bảo hộ miễn dịch chó theo quy trình xét nghiệm chúng tơi (với hồng cầu gà 1%, virus CPV nồng độ HAU huyết chó khơng qua xử lý) Quy trình kỹ thuật nhóm trước liên quan nghiên cứu áp dụng tổ hợp phản ứng HA-HI chẩn đốn bệnh CPV chó cịn có thêm số khác biệt, sử dụng hiệu giá virus HAU thay cho HAU, so với quy trình kỹ thuật Huyết cần kiểm trước áp dụng cho HI trộn với kaolin hồng cầu lợn, không tránh khỏi việc pha loãng (nồng độ kháng thể sau xử lý giảm 10 lần) Việc xử lý làm biểu hiệu giá kháng thể HI tăng lên loại bỏ yếu tố ức chế không đặc hiệu huyết Phạm Hồng Sơn Ngô Thị Thanh Trà TẠP CHÍ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 4(3)-2020:2129-2139 Bảng Bảng tương liên tần suất xuất cá thể chó mang kháng nguyên CPV phân tiêu chảy ứng với mức hiệu giá kháng thể HI huyết Nhóm chó chưa tiêm vaccine Nhóm chó tiêm vaccine phòng bệnh CPV phòng bệnh CPV Hiệu giá Kết HI Số chó có Kết HI Số chó có kháng thể HI Tỷ lệ chó Tỷ lệ chó theo parvovirus theo parvovirus (log2) mang virus mang virus mức hiệu giá phân mức hiệu giá phân (%) (%) (con) (SSDHI+) (con) (SSDHI+) 0 0 13 13 100 14 42,86 1 100 0 0 0 12 0 10 0 0 0 10 0 Tổng cộng 32 19 59,38 38 2,63 Tuy nhiên, yếu tố biết khơng tồn với lồi Chẳng hạn, hồng cầu gà huyết vịt xác định có ức chế khơng đặc hiệu huyết gà khơng có tác động (Surin cs., 1986) Đối với chúng tơi việc xử lý huyết thao tác cần tránh tốn thêm công sức bỏ nguồn tài nguyên hữu ích cho phản ứng SSDHI phát kháng nguyên đặc hiệu virus Do đó, việc thay hồng cầu lợn hồng cầu gà để xét nghiệm huyết chó lợi điểm lớn giúp tránh tác động bất lợi yếu tố ức chế không đặc hiệu đến mức không cần đến xử lý huyết thanh, tránh hao hụt kháng huyết 3.3 Đánh giá chất lượng tiêm vaccine CPV phòng bệnh chó Kết phản ứng HI tất mẫu huyết chó tiêu chảy xuất huyết xét nghiệm trình bày Bảng 3, sử dụng mức hiệu giá log2 HI làm thông số báo bảo hộ miễn dịch chống CPV Bảng Tình hình đáp ứng miễn dịch chống CPV chó tiêu chảy xuất huyết đưa đến chẩn trị Trung tâm chẩn đoán điều trị động vật thuộc Chi cục thú y tỉnh Thừa Thiên Huế thời gian khảo sát Số chó có Số chó Số chó có Tỷ lệ chó có Giá trị P Cường độ hiệu giá xét kháng thể mức kháng thể (χ2.test) so (GMT) miễn Nhóm chó kháng thể nghiệm huyết từ log2 HI sánh dịch dịch thể log2 HI trở huyết thanh trở lên (%) nhóm (HIU) lên Đã tiêm vaccine phịng 38 38 37 97,4 60,59 bệnh CPV 0,000 Chưa tiêm (48,36) 32 32 15,6 6,73 vaccine CPV Tổng 70 70 42 60 22,18 Bảng cho thấy tất chó xét nghiệm HI có kháng thể huyết Đối với nhóm tiêm phịng tỷ lệ chó có hiệu giá kháng thể từ log2 HI trở lên (tức đạt mức bảo hộ miễn dịch) cao, 37 chó số 38 http://tapchi.huaf.edu.vn xét nghiệm, đạt 97,3%, cao nhiều (P < 0,01) so với nhóm khơng tiêm phịng đạt 15,6% Kết xét nghiệm Bảng (ở mục trên) cho thấy số 38 chó tiêm phịng mang virus mầm bệnh CPV phát 2137 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY hiện, chiếm tỉ lệ 2,6%, thấp nhiều (P < 0,001) so với số chó mang mầm bệnh phân nhóm khơng tiêm phịng (19 số 32 xét nghiệm có kháng nguyên, hay 59,38%) Điều chứng tỏ tiêm vaccine phịng bệnh parvovirus liên quan chặt chẽ với tình trạng mầm bệnh chó Như vậy, việc tiêm vaccine phịng bệnh CPV cho chó địa bàn nghiên cứu có tác dụng làm giảm nguy nhiễm bệnh KẾT LUẬN Hồng cầu gà nguyên liệu thích hợp cho phản ứng HA virus parvo chó (CPV) phản ứng phái sinh HI (xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu CPV) SSDHI (xác định diện kháng nguyên CPV bệnh phẩm) dù có khác biệt khơng nhỏ biểu giá trị HA HI so với hồng cầu lợn sử dụng nghiên cứu tác giả trước Các yếu tố liên quan đến phản ứng xét nghiệm cần chuẩn hóa để tham chiếu Việc phát parvovirus chó có thuộc tính gây ngưng kết hồng cầu gà ổn định không bị tác động xấu yếu tố ức chế khơng đặc hiệu huyết chó quan trọng giúp phát triển hệ thống xét nghiệm khảo sát miễn dịch mang trùng, hệ thống HA-HI-SSDHI, parvovirus chó (CPV), cho kết nhanh chủ động nguồn vật liệu nên có giá thành thấp Mức hiệu giá kháng thể log2 HI theo quy trình mơ tả nghiên cứu (với huyền dịch hồng cầu gà 1%, virus vaccine CPV HAU, với lượng 25 μL) xác định thơng số báo bảo hộ miễn dịch chó chống bệnh CPV Vaccine CPV sử dụng khu vực nghiên cứu có hiệu tốt LỜI CẢM ƠN Tác giả cảm ơn cán viên chức lao động Trung tâm chẩn đoán điều trị động vật thuộc Chi cục Thú y tỉnh Thừa Thiên Huế giúp đỡ lấy mẫu thực đề 2138 ISSN 2588-1256 Vol 4(3) 2020:2129-2139 tài Cơng trình với kinh phí cá nhân sản phẩm kế tục hệ đề tài KHCN trước đây: B2004-08-07-TĐ DHH2013-02-32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Duy Báu, Phạm Thị Yến Hoa, Lê Thị Ngọc Khánh Phạm Hồng Sơn (2019) Đánh giá miễn dịch cảm nhiễm virus dại chó ni huyện Tun Hóa tỉnh Quảng Bình kỹ thuật HI SSDHI, Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế, 3(1),1003 - 1012 Nguyễn Văn Dũng, Phạm Xuân Thảo, Vũ Kim Chiến Ken Maeda (2018) Dịch tễ học phân tử Parvovirus chó ni thành phố Hồ Chí Minh, Khoa học Kỹ thuật Thú y, 25(4), 12 - 16 Phạm Sỹ Lăng, Trần Minh Châu, Hồ Đình Chúc, Lê Thanh Hải, Đào Hữu Thanh Dương Công Thận (1998) Bệnh thường thấy chỏ cách phòng trị Hà Nội: Nhà xuất Nơng nghiệp Nguyễn Thị Hồng Oanh, Phạm Thị Hồng Lam, Đỗ Thị Lợi Phạm Hồng Sơn (2012) Sử dụng tổ hợp phản ứng ngưng kết hồng cầu trực tiếp với trắc định xê dịch ngăn trở ngưng kết hồng cầu chuẩn (HASSDHI) trắc định xê dịch ngưng kết gián tiếp chuẩn (SSIA) chẩn đoán bệnh Niucatxon Khoa học Kỹ thuật Thú y, 19(1), 48 - 56 Lê Đình Quang, Hồ Thị Ngọc Ánh, Hồ Thị Lệ, Bùi Thị Lan, Nguyễn Hữu Lợi Phạm Hồng Sơn (2018) Đáp ứng miễn dịch gà vaccine La Sota phòng bệnh Newcastle thay đổi theo điều kiện sinh thái chăn ni Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nông nghiệp, trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế, 3(1), 1117 - 1128 Phạm Hồng Sơn Nguyễn Thị Ngọc Hiền (2017) Xác định tình hình đáp ứng miễn dịch dịch thể cảm nhiễm virus dại chó ni địa bàn thành phố Huế phương pháp HI SSDHI, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nông nghiệp trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế, 1(1), 119 129 Phan Ngọc Tuyết, Nguyễn Thị Mỹ Trinh, Phạm Thị Thanh Thúy Phạm Hồng Sơn (2018) Đánh giá hiệu lực vaccine phịng dại chó ni huyện Minh Hóa tỉnh Phạm Hồng Sơn Ngơ Thị Thanh Trà TẠP CHÍ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ NƠNG NGHIỆP Quảng Bình, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nông nghiệp trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế, 2(2), 767 - 780 Tài liệu tiếng nước Carmichael, L E., Joubert, J C., & Pollock, R V H (1980) Hemagglutination by canine parvovirus: serologic studies and diagnostic applications American Journal of Veterinary Research, (41), 784 - 791 Carter, G R., Roberts, A W., & Chengappa, M M (1995) Essentials of Veterinary Microbiology, 5th revised edition Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia Mahon, J L., Rozanski, E A., & Paul, A L (2017) Prevalence of serum antibody titers against canine distemper virus and canine parvovirus in dogs hospitalized in an intensive care unit Journal of the American Veterinary Medical Association, 250(12), 1413 - 418 doi: 10.2460/javma.250.12.1413 Oh, J.-S., Ha, G.-W., Cho, Y.-S., Kim, M.-J., An, D.-J., Hwang, K.-K., Lim, Y.-K., Park, B.-K., Kang, B.-K., & Song, D.-S (2006) One-Step Immunochromatography Assay Kit for Detecting Antibodies to Canine Parvovirus Clinical and Vaccine Immunology, 13(4), 520 - 524 doi: 10.1128/CVI.13.4.520-524.2006 Parrish, C R (1990) Emergence, natural history, and variation of canine, mink, and feline parvoviruses Advances in Virus Research, (38), 403 - 450 Pollack, R V., & Carmichael, L E (1982) Maternally derived immunity to canine http://tapchi.huaf.edu.vn ISSN 2588-1256 Tập 4(3)-2020:2129-2139 parvovirus infection: transfer, decline and interference with vaccination Journal of the American Veterinary Medical Association, (180), 37 - 42 Prittie, J (2004) Canine parvoviral enteritis: a review of diagnosis, management and prevention Journal of Veterinary Emergency and Critical Care, (14), 167176 doi.org/10.1111/j.15346935.2004.04020.x Shimizu, Y., Kanoe, M., Tabuchi, K., Hiramune, T., & Mikami, T (ed.) (1999) Juui densenbyou gaku daigoban Kindai shuppan, Tokyo, 22 Siegl, G., Bates, R C., Berns, K I., Carter, B J., Kelly, D C., Kurstak, E., & Tattersall, P (1985) Characteristics and taxonomy of Parvoviridae Intervirology, (23), 61 - 73 Snedecor, G W., & Cochran, W G (1980) Statistical methods, 7th edition The United States of America: Iowa State University Press, Ames, Iowa Surin, V N., Belousova, P B., Solovjev, K V., & Fomina, N V (1986) Spravotchnik metody laboratornoi diagnostiki virusnych boleznei zhyvotnych Agroproizdat, Moskva Waner, T., Naveh, A., Wudovsky, I., & Carmichael, L E (1996) Assessment of maternal antibody decay and response to canine parvovirus vaccination using a clinic-based enzyme-linked immunosorbent assay Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, (8), 427 - 432 2139 ... bắt cặp kháng nguyên - kháng thể cá thể chó, chúng tơi xác định giá trị ngưỡng hiệu giá kháng thể HI huyết chó nguyên dạng ứng với mức bảo hộ miễn dịch chó Đồng thời, với ngưỡng bảo hộ xác lập đó,... khảo sát Số chó có Số chó Số chó có Tỷ lệ chó có Giá trị P Cường độ hiệu giá xét kháng thể mức kháng thể (χ2.test) so (GMT) miễn Nhóm chó kháng thể nghiệm huyết từ log2 HI sánh dịch dịch thể log2... 1980) Chỉ số hiệu giá kháng thể bảo hộ miễn dịch xác định cách xác định biên độ hiệu giá kháng thể huyết nhóm chó tiêu chảy mang virus Giá trị hiệu giá kháng thể cao biên độ coi mức hiệu giá kháng