Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định đặc điểm sinh học của vi nấm Achlya bisexualis gây bệnh trên cá nuôi thâm canh. Tổng cộng 6 chủng Achlya bisexualis được phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), cá lóc (Channa striata) và cá điêu hồng (Oreochromis sp.).
Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Nơng nghiệp Phát triển nông thôn; ISSN 2588–1191 Tập 126, Số 3D, 2017, Tr 143–152; DOI: 10.26459/hueuni-jard.v126i3D.4105 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI NẤM Achlya bisexualis NHIỄM TRÊN CÁ NUÔI THÂM CANH Đặng Thụy Mai Thy*, Trần Thị Tuyết Hoa, Phạm Minh Đức Trường Đại học Cần Thơ, Đường 3/2, P Xuân Khánh, Q Ninh Kiều, TP Cần Thơ, Việt Nam Tóm tắt: Nghiên cứu thực nhằm xác định đặc điểm sinh học vi nấm Achlya bisexualis gây bệnh cá nuôi thâm canh Tổng cộng chủng Achlya bisexualis phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), cá lóc (Channa striata) cá điêu hồng (Oreochromis sp.) Kết cho thấy A bisexualis phát triển tốt khoảng nhiệt độ 28–33 °C Vi nấm phát triển nhanh pH 6–8 Các chủng phát triển độ mặn 2,0 % Vi nấm sử dụng glucose, maltose, mannose, sucrose arabinose A bisexualis cho phản ứng với NO2 mM không phản ứng với NO2 43 mM Từ khóa: Achlya bisexualis, cá điêu hồng, cá lóc, cá tra, sinh học, vi nấm Đặt vấn đề Vi nấm sinh vật nhân thực, sống dị dưỡng, khơng có diệp lục tố, hấp thụ chất dinh dưỡng qua vách tế bào cách tiết enzymes vào vật chủ sống hoại sinh, cộng sinh ký sinh động vật thực vật [5] Vi nấm nhiễm động vật thủy sản đa dạng thành phần loài, mức độ nhiễm khả gây thiệt hại khác Trong đó, nhóm vi nấm phổ biến gồm Saprolegnia sp., Achlya sp., Aphanomyces sp thường gây bệnh thủy sản [8,2] Hiện nay, đồng sông Cửu Long động vật thủy sản nhiễm vi nấm Achlya sp dần trở nên phổ biến gây thiệt hại cho người nuôi Khảo sát cá lóc nhiễm bệnh An Giang Đồng Tháp cho thấy giống Achlya sp chiếm 21,4 % nhiễm phổ biến cá lóc giai đoạn giống Achlya bisexualis [18,19] Ngoài ra, nghiên cứu Nguyễn Thị Huyền (2006) cho thấy vi nấm Achlya sp cịn có khả gây nhiễm trứng cá tra cá basa Theo Czeczuga cs (2013) vi nấm nhiễm trứng cá da trơn Châu Phi gồm loài Achlya sp., Aphanomyces sp., Leptolegnia sp Saprolegnia sp có khả sử dụng alanine, không sử dụng methionine, lysine, ornithine, leucine glycine [4] Tất loài sử dụng glucose tinh bột, khơng cho phản ứng với arabinose salicin Kết thí nghiệm nấm S diclina A bisexualis ký sinh cá chép (C carpio) cho thấy nhiệt độ tối ưu loài vi nấm 25 °C 10–30 °C vi nấm phát triển [20] Tuy nhiên, nghiên cứu Nguyễn Thị Thúy Hằng (2011) cho thấy nhiệt độ 30–35 °C mức thích hợp cho vi nấm Achlya bisexualis nhiễm cá lóc giai đoạn giống phát triển Có thể thấy vùng địa lý nhiễm ký chủ khác khoảng nhiệt độ phát triển thích hợp vi nấm khác Vì thế, * Liên hệ: dtmthy@ctu.edu.vn Nhận bài: 13–03–2017; Hoàn thành phản biện: 24–07–2017; Ngày nhận đăng: 20–12–2017 Đặng Thị Mai Thy CS Tập 126, Số 3D, 2017 nghiên cứu thực nhằm cung cấp thông tin đặc điểm sinh học vi nấm Achlya bisexualis góp phần việc định danh phân loại vi nấm gây bệnh cá Phương pháp nghiên cứu 2.1 Chủng vi nấm Các chủng vi nấm trữ Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Vi nấm phục hồi môi trường Glucose Yeast Agar – GYA (1 % glucose, 0,25 % yeast–extract, 1,5 % agar) ủ 28 °C Các chủng vi nấm phát triển sau ngày ni cấy sử dụng cho thí nghiệm (Bảng 1) Bảng Các chủng vi nấm Achlya bisexualis thí nghiệm 2.2 TT Chủng vi nấm Lồi cá Cơ quan phân lập PCT01.02 Cá tra Da PAG02.07 Cá tra Da TCT02.02 Cá điêu hồng Da TVL02.03 Cá điêu hồng Mang CĐT02.32 Cá lóc Da CCT01.09 Cá lóc Da Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển vi nấm Phương pháp thí nghiệm thực theo Koeypudsa cs (2005) Dùng ống cắt số (cork borer No 2) cắt khối agar với đường kính 5,5 mm rìa khuẩn lạc có nấm phát triển đặt vào đĩa petri chứa môi trường GYA Ủ đĩa cấy với mức nhiệt độ khác 23, 28, 33 38 °C, đo đường kính phát triển khuẩn lạc nấm sau 3–5 ngày Thí nghiệm thực với lần lặp lại 2.3 Ảnh hưởng pH đến khả phát triển vi nấm Phương pháp thí nghiệm thực theo Koeypudsa cs (2005) có điều chỉnh Dựa vào kết thí nghiệm nhiệt độ xác định nhiệt độ thích hợp cho vi nấm phát triển tốt thí nghiệm Môi trường GY lỏng điều chỉnh khoảng pH 3–11 cách cho thêm dung dịch HCl 1N dung dịch NaOH 1N Dùng ống cắt số (cork borer No 2) cắt khối agar với đường kính 5,5 mm rìa khuẩn lạc có nấm phát triển cho vào ống nghiệm chứa ml GY lỏng Khả phát triển vi nấm quan sát ngày so sánh với ống nghiệm đối chứng (pH: 7) Quan sát ghi nhận kết 5–7 ngày Kết thể qua điểm (0) nấm không phát triển, (1) nấm phát triển có số lượng ít, ngắn 144 Jos.hueuni.edu.vn Tập 126, Số 3D, 2017 chiếm < 20 % khối agar, (2) nấm phát triển có số lượng vừa chiếm 20–70 % khối agar (3) nấm phát triển có số lượng nhiều, dài chiếm > 70 % khối agar Trong trường hợp nấm không phát triển, mẫu agar dùng thí nghiệm rửa nước cất vô trùng cấy trở lại đĩa môi trường GYA để đánh giá khả sống sót nấm Thí nghiệm thực với lần lặp lại 2.4 Ảnh hưởng độ mặn đến khả phát triển vi nấm Phương pháp thí nghiệm thực theo Koeypudsa cs (2005) Dùng ống cắt số cắt khối agar có nấm phát triển với đường kính khoảng 5,5 mm đặt khối agar vào đĩa petri có mơi trường GYA với nồng độ muối khác %; 0,5 %; %; 1,5 % % ủ nhiệt độ tối ưu chọn thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ Thí nghiệm thực với lần lặp lại đo đường kính khuẩn lạc nấm vòng 5–7 ngày 2.5 Khả sử dụng cacbohydrat vi nấm Phương pháp thí nghiệm thực theo Kitancharoen Hatai (1998) Chuẩn bị môi trường gồm 8,4 mM NH4H2PO4; 2,7 mM KCl; 0,8 mM MgSO4.7H2O; 0,035 mM ZnSO4.7H2O 0,02 mM CuSO4.5H2O Bổ sung thêm bromcresol tím cho vào để làm chất thị với nồng độ 50 mg/L môi trường tiệt trùng 121 °C 10 phút Cacbohydrat (glucose, sucrose, maltose, mannose arabinose) bổ sung vào môi trường với nồng độ % Cho mL môi trường vào ống nghiệm 10 mL cấy vi nấm vào Ủ mẫu 14 ngày vúnh hưởng đến trình phát triển nấm, nhiệt độ tăng làm enzyme bị biến tính hủy hoại nên vi nấm không phát triển sinh sản tạo bào tử Kết nghiên cứu tương tự báo cáo Nguyễn Thị Huyền (2006), nhiệt độ thích hợp cho nấm Achlya gây bệnh trứng cá tra cá basa 25–30 °C Các chủng A bisexualis phát triển khoảng 10–35 °C, phát triển tối ưu 25–30 °C không phát triển 40 °C [14,15] 3.2 Ảnh hưởng pH đến phát triển vi nấm Achlya bisexualis pH yếu tố ảnh hưởng đến trình phát triển vi nấm Kết khảo sát ảnh hưởng pH lên phát triển chủng vi nấm môi trường GY lỏng sau ngày nuôi cấy cho thấy chủng A bisexualis phát triển tốt khoảng pH 6–8 không phát triển pH ≤ ≥ 11 pH ức chế phát triển vi nấm mức pH 4, 10 Ở mức pH có chủng A bisexualis cá tra, chủng cá điêu hồng chủng cá lóc phát triển sợi nấm mơi trường Ngồi ra, chủng A bisexualis có sợi nấm phát triển trung bình pH Ở mức pH 10, chủng A bisexualis cá điêu hồng bị ức chế (Bảng 3) Bảng Ảnh hưởng pH đến phát triển vi nấm A bisexualis A bisexualis loài cá pH 10 11 Cá tra 3 1 Cá điêu hồng 3 0 Cá lóc 3 1 Ghi chú: 3: vi nấm phát triển nhiều; 2: vi nấm phát triển vừa; 1: vi nấm 0: vi nấm không phát triển 147 Đặng Thị Mai Thy CS Tập 126, Số 3D, 2017 Kết tương đồng với kết Madan Thind (1998) cho thấy vi nấm chịu đựng mơi trường có khoảng pH rộng sinh trưởng tối ưu pH môi trường axít nhẹ Q trình phát triển nấm bị ngưng lại mơi trường axít (pH 3) kiềm (pH 8–9) Hơn nữa, mơi trường axít màng tế bào vi nấm bị bão hịa, làm hạn chế trao đổi ion thiết yếu Các giống Saprolegnia, Aphanomyces Achlya phát triển khoảng pH tối ưu từ đến 10 [10] Ngoài ra, Achlya A bisexualis nhiễm cá rô phi Thái Lan sinh trưởng tốt động bào tử nảy mầm pH 4–11 nấm phát triển tối ưu khoảng pH 6–8 [16] A klebsiana nhiễm cá chép phát triển pH 6–7 [3] 3.3 Ảnh hưởng độ mặn đến phát triển vi nấm Achlya bisexualis Khảo sát ảnh hưởng độ mặn (NaCl) đến phát triển vi nấm ghi nhận độ mặn tăng A bisexualis phát triển giảm Các chủng nấm A bisexualis không phát triển độ mặn % A bisexualis sinh trưởng tốt đến độ mặn 0,5 % Ở nồng độ %, tăng trưởng chủng vi nấm giảm ½ so với nồng độ 0–0,5 % Độ mặn mức 1,5 % ức chế phát triển chủng A bisexualis (Bảng 4) Kết xử lý thống kê cho thấy khơng có khác biệt độ mặn 0–0,5 % khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) độ mặn 1–2 % Bảng Ảnh hưởng độ mặn đến phát triển vi nấm Achlya bisexualis A bisexualis loài cá 0% 0,5 % 1% 1,5 % 2% Đường kính khuẩn lạc (mm) sau ngày Cá tra 79,2 ± 1,5aA 78,6 ± 3,4aA 36,9 ± 3,1bA 18,4 ± 2,4cA – Cá điêu hồng 80,3 ± 2,1aA 80,0 ± 2,3aA 39,1 ± 2,9bB 16,6 ± 3,4cB – 77,9 ± 2,1 78,2 ± 2,4 38,7 ± 2,5 16,9 ± 3,5 – Cá lóc aA aA bB cB Ghi chú: Các chữ thường khác hàng chữ in hoa khác cột thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Kết nghiên cứu tương đồng với kết Nguyễn Thị Thúy Hằng (2011) Achlya bisexualis cho thấy nấm phát triển đến độ mặn % bị ức chế hoàn toàn độ mặn % Theo Abking cs (2008), trứng cá tra dầu (Pangasianodon gigas) nấm Achlya spp tăng trưởng tối ưu với nồng độ muối 1,5 % không thấy có phát triển nấm độ mặn %–2,5 % Trong đó, Fuangsawat cs (2011) cho nấm Achlya bisexualis có khả tồn đến nồng độ muối 2,5 % Hơn nữa, tăng nồng độ muối ảnh hưởng trực tiếp đến trình thẩm thấu sợi nấm Lúc này, NaCl hoạt động chất độc màng tế bào nấm gây ổn định màng hoạt động enzym, số lồi vi nấm phát triển tốt mơi trường có muối [6] 3.4 148 Khả sử dụng cacbohydrat vi nấm Achlya bisexualis Jos.hueuni.edu.vn Tập 126, Số 3D, 2017 Cacbohydrat nguồn dinh dưỡng chủ yếu cho q trình sinh trưởng vi nấm Thí nghiệm bổ sung nguồn cacbohydrat khác ghi nhận chủng A bisexualis sử dụng sucrose, maltose manose trình phát triển Tuy nhiên, chủng vi nấm khác sử dụng loại đường khác chủng nấm nhiễm cá tra khơng có khả sử dụng arabinose ngược lại chủng A bisexualis nhiễm cá điêu hồng cá rô phi có khả sử dụng arabinose Hai chủng nấm nhiễm cá điêu hồng có khả sử dụng maltose, sucrose, arabinose, mannose có chủng nấm có khả sử dụng (Bảng 5) Bảng Khả sử dụng cacbohydrat Achlya bisexualis A bisexualis loài cá Glucose Sucrose Maltose Mannose Arabinose Cá tra + + + + – Cá điêu hồng + + + + + Cá lóc + + + + + (+): vi nấm phát triển (–): vi nấm không phát triển Kết thí nghiệm có tương đồng với kết Kitancharoen Hatai (1998) cho thấy tất chủng Achlya sp sử dụng 14/19 loại cacbohydrat glucose, maltose, mannose, sucrose lại không sử dụng arabinose Theo tác giả, glucose cacbohydrat mà tất giống nấm hấp thu được, arabinose, xylose sucrose khả đồng hóa giống vi nấm khác Một số cacbohydrat có khả gây độc cho vi nấm bổ sung vào môi trường cho thấy vi nấm khơng có khả phát triển Theo Czeczuga cs (2013), thí nghiệm nghiên cứu trứng cá da trơn Châu Phi ghi nhận thấy loài Achlya, Aphanomyces, Leptolegnia Saprolegnia sử dụng glucose tinh bột, khơng đồng hóa arabinose salicin 3.5 Ảnh hưởng nitrit đến phát triển vi nấm Achlya bisexualis Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng nitrit đến phát triển vi nấm ghi nhận chủng A bisexualis loài cá phát triển mơi trường có bổ sung NO2 nồng độ mM không phát triển nồng độ 43 mM Đường kính khuẩn lạc trung bình 2/3 chủng A bisexualis mơi trường có mM NO2 cao so với môi trường không bổ sung NO2 (Bảng 6) Bảng Ảnh hưởng NO2 đến phát triển vi nấm A bisexualis 149 Đặng Thị Mai Thy CS A bisexualis loài cá Tập 126, Số 3D, 2017 mM 43 mM Đường kính khuẩn lạc (mm) sau ngày Cá tra 32,4 ± 1,9aA 26,3 ± 2,2bA – Cá điêu hồng 37,2 ± 2,9aB 34,8 ± 2,5bB – Cá lóc 34,3 ± 3,1aB 34,2 ± 2,3bB – Ghi chú: Các chữ thường khác hàng chữ in hoa khác cột thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Kết tương tự với kết Kitancharoen Hatai (1998) giống Achlya, Saprolegnia, Aphanomyces, Pythium, Leptolegnia nhiễm trứng cá hồi Chúng phát triển mơi trường NO2 (5 mM), có Saprolegnia Leptolegnia tồn nồng độ NO2 43 mM NO2 chất gây độc cho tế bào sống nồng độ 43 mM NO2 chủng A bisexualis khơng phát triển [17] Bên cạnh đó, ni tơ nguồn dinh dưỡng cần thiết cho vi nấm Trong tế bào vi nấm, ni tơ sử dụng để tổng hợp hợp chất hữu protein, enzyme, số vitamin chitin Thông qua trình trao đổi chất, vi nấm sử dụng nitrat chuyển thành NO2, hyponitrite ammonia Vi nấm thường không sử dụng NO2 môi trường pH tối ưu axít Nitrit gây độc khơng thể hịa tan axít nitrơ, ảnh hưởng đến protein axít amin tế bào vi nấm [12] Kết luận A bisexualis sinh trưởng phát triển nhiệt độ 28–33 C, pH khoảng 6–8, độ mặn 0–0,5 % sử dụng nguồn cacbonhydrat chủ yếu glucose sucrose Trong mơi trường có NO2 nồng độ mM A bisexualis tồn phát triển Tài liệu tham khảo Abking, N., W Fuangsawat and O Lawhavinit (2008), Achlya spp isolated from eggs of the Mekong Giant Catfish (Pangasianodon gigas, Chevey), Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine, Kasetsart University, Bangkok 10900, Thailand Bly, J.E., L.A Lawson, D.J Dale, A.J Szalai, R.M Durborow and L.W Clem (1992), Winter saprolegniasis in channel catfish, Diseases of Aquatic Organisms, 13, 155–164 Chukanhom, K and K Hatai (2004), Freshwater fungi isolated from eggs of the common carp Cyprinus carpio in Thailand, Mycoscience, 45, 42–48 Czeczuga, B., E Czeczuga-Semeniuk, A Semeniuk and J Semeniuk (2013), Straminipiles (Oomycota) developing on the eggs of an African catfish, Clarias gariepinus Burchell in water bodies of Poland, African Journal of Microbiology Research , (20), 2378–2384 150 Jos.hueuni.edu.vn Tập 126, Số 3D, 2017 De Hoog, G.S., J Guarro, J Gené and M.J Figueras (2000), Atlas of clinical fungi 2nd edition, Centraalbureau voor schimmelculture 1126p El-Abyad, M.S., H Hindorf and M.A Rizk (1988), Impact of salinity stress on soil-borne fungi of sugarbeet I Pathogenicity implications, Plant Soil, 110, 27–32 Fuangsawat, W., N Abking and O Lawhavinit (2011), Sensitivity comparison of pathogenic aquatic fungal hyphae to sodium chloride, hydrogen peroxide, acetic acid and povidone iodine, Kasetsart Journal, 45, 84–89 Hatai, K and G.I Hoshiai (1994), Pathogenicity of Saprolegnia parasitica Coker In: Saloon saprolegniasis, 87–98 Kitancharoen, N and K Hatai (1998), Some biochemical characteristics of fungi isolate from salmonid eggs, Mycoscience, 39, 249–255 10 Kitancharoen, N., A Yamamoto and K Hatai (1997), Fungicidal effect of hydrogen peroxide on fungal infection of rainbow trout eggs, Mycoscience, 38, 375–378 11 Koeypudsa, W., P Phadee, J Tangtrongpiros and K Hatai (2005), Influence of pH, temperature and sodium chloride concentration on growth rate of Saprolegnia sp Journal of Scientific research Chulalongkorn University, 30 (2), 123–130 12 Madan, M and K.S Thind (1998), Physiology of Fungi, APH Punlishing Corporation, New Delhi, 219 13 Nguyễn Thị Huyền (2006), Xác định nấm thủy mi nhiễm trứng cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) cá Basa (Pangasius bocouri) – thử nghiệm hiệu phòng, Luận văn Thạc sỹ Sinh học, Đại Học Quốc Gia TP.HCM 14 Nguyễn Thị Thúy Hằng (2011), Phân lập định danh vi nấm ký sinh cá lóc (Channa striata) giai đoạn giống, Luận văn tốt nghiệp cao học, Đại Học Cần Thơ 15 Panchai, K., C Hanjavanit and N Kitancharoen (2007), Charaterristics of Achlya bisexualis isolated from eggs of Nile tilapia (Oreochromis niloticus Linn.), KKU Research Journal, 12 (3), 195–202 16 Panchai, K., C Hanjavanit, N Rujinanont, S Wada, O Kurata, K.Hatai (2014), Freshwater oomycete isolated from net cage cultures of Oreochromis niloticus with water mold infection in the Nam Phong River, Khon Kaen Province, Thailand AACL Bloflux, (6), 529–542 17 Pateman, J.A and J.R Kinghorn (1976), Nitrogen metabolism In: The filamentous fungi, vol 2, Biosynthesis and metabolism, (ed by Smith, J.E and Berry, D.R.), 159–237, Academic Press, London 18 Phạm Minh Đức Nguyễn Thị Thúy Hằng (2011), Bước đầu nghiên cứu bệnh nấm thủy mi cá lóc (Channa striata) giống tỉnh Đồng Tháp, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thơn 12, 35–43 19 Phạm Minh Đức, Trần Ngọc Tuấn Trần Thị Thanh Hiền (2012), Khảo sát mầm bệnh cá lóc (Channa striata) ao ni thâm canh An Giang Đồng Tháp, Tạp chí Khoa học Trường Đại Học Cần Thơ, 21b, 124–132 20 Rakmanee, C, C Hanjavanit and N Yuasa (2004), Effect of the temperature, pH and sodium chloride on the growth of Saprolegnia and Achlya isolated from infected eggs of African 151 Đặng Thị Mai Thy CS Tập 126, Số 3D, 2017 catfish (Clarias gariepinus Burch) and common carp (Cyprinus carpio L.) – In: Rakmanee, C M.Sc Thesis, Khon Kaen University BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF Achlya bisexualis INFECTED IN INTENSIVELY CULTURED FISH Đang Thuy Mai Thy*, Tran Thi Tuyet Hoa, Pham Minh Đuc Can Tho University, 3/2 Road, Ninh Kieu, Can Tho, Vietnam Abstract: This paper aims at determining the biological characteristics of Achlya bisexualis which causes pathogenic in some intensively cultured freshwater fish The experiment was carried out on six strains of A bisexualis isolated from striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus), snakehead fish (Channa striata) and red tilapia (Oreochromis sp.) The results showed that optimal temperature of the strains ranged from 28 °C to 33 °C All isolates tested grew rapidly at pH 6–8 The strains were unable to grow at 2.0 % salinity The strains were able to consume glucose, maltose, mannose, sucrose and arabinose A bisexualis were able to react with NO2 mM but did not react with NO2 43 mM Keywords: Achlya bisexualis, red tilapia, snakehead fish, striped catfish, biochemical, strain 152 ... cấp thông tin đặc điểm sinh học vi nấm Achlya bisexualis góp phần vi? ??c định danh phân loại vi nấm gây bệnh cá Phương pháp nghiên cứu 2.1 Chủng vi nấm Các chủng vi nấm trữ Bộ môn Bệnh học Thủy sản,... Các chủng vi nấm Achlya bisexualis thí nghiệm 2.2 TT Chủng vi nấm Loài cá Cơ quan phân lập PCT01.02 Cá tra Da PAG02.07 Cá tra Da TCT02.02 Cá điêu hồng Da TVL02.03 Cá điêu hồng Mang CĐT02.32 Cá. .., chủng A bisexualis cá điêu hồng bị ức chế (Bảng 3) Bảng Ảnh hưởng pH đến phát triển vi nấm A bisexualis A bisexualis loài cá pH 10 11 Cá tra 3 1 Cá điêu hồng 3 0 Cá lóc 3 1 Ghi chú: 3: vi nấm phá