Bài viết trình bày việc tiến hành tối ưu hóa bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm nhằm tìm ra điều kiện chiết xuất saponin hiệu quả từ lá đu đủ và phân tích định tính nhóm chất saponin có trong lá đu đủ.
Journal of Science & Technology 129 (2018) 096-100 Tối ưu hóa q trình chiết saponin tổng số từ đu đủ Carica papaya L Optimizing of Conditions for Saponin Extract Process from Carica Papaya L Leaves Bùi Thị Niên, Đỗ Thị Hoa Viên* Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội – Số 1, Đại Cồ Việt, Hai Bà Trưng, Hà Nội Đến Tịa soạn: 18-5-2017; chấp nhận đăng: 28-9-2018 Tóm tắt Lá đu đủ sử dụng hỗ trợ điều trị ung thư số nước, có Úc, Mỹ, Brasin, Việt nam… Lá đu đủ có chứa nhóm hoạt chất như: alkaloid, saponin, carotenoid, hợp chất phenolic… Trong nghiên cứu tiến hành tối ưu hóa phương pháp quy hoạch thực nghiệm nhằm tìm điều kiện chiết xuất saponin hiệu từ đu đủ phân tích định tính nhóm chất saponin có đu đủ Cao chiết tổng số chiết MeOH Ba yếu tố có ảnh hưởng nhiều đến trình chiết xuất cao chiết tổng số từ đu đủ thời gian chiết, nhiệt độ chiết tỷ lệ nguyên liệu/dung môi lựa chọn để khảo sát Kết khảo sát cho thấy điều kiện chiết xuất cao chiết tổng số từ đu đủ tối ưu thời gian chiết: 53 giờ, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/7 g/ml, nhiệt độ chiết: 49oC, thu cao chiết tổng số với hàm lượng 14,49 ± 0,64% so với nguyên liệu đu đủ khô Tiếp tục chiết xuất saponin từ cao chiết tổng số với dung môi đặc hiệu n-butanol, sau rửa chloroform, chúng tơi thu saponin thơ toàn phần với hàm lượng 1,69 ± 0,37% so với nguyên liệu đu đủ khô Tiến hành phân tích định tính saponin phương pháp tạo bọt sắc kí mỏng, chúng tơi xác định nhóm saponin có mặt đu đủ saponin steroid Từ khóa: Chiết xuất, qui hoạch thực nghiệm, tối ưu hóa, saponin, saponin steroid Abstract Papaya leaves are used to support for treatment of cancer in some countries such as Australia, American, Brasin, Vietnam… Papaya leaf contains alkaloid, saponin, carotenoid, phenolic compounds… In this study we optimise saponin extracted conditions from papaya leaves by using Design Expert program, and qualitative analyse saponin in papaya leaves The total extract is extracted by MeOH Three main factors are examined There are extracted time, temperature and the ratio of material/extracted solvent The research result show that optimised extracted conditions for total extract from papaya leaves are extracted time: 52.5 hours, the rate of material/solvent: 1/7 and extracted temperature: 48.51oC Continue to extract saponin from the total extract with n-butanol, then purify by chloroform, we obtained total crude saponin with the content is 1,69 ± 0,37% compairing with dried material Qualitative analyse saponins with foaming reaction and thin layer chromatography, we determine that saponins presented in papaya leaves is saponin steroid Keywords: Extract, Design Expert, optimization, saponin, saponin steroid Đặt vấn đề Bản Mỹ cho thấy dịch chiết đu đủ có tác dụng ngăn chặn tăng trưởng dòng tế bào ung thư khác Kết nghiên cứu cho thấy đu đủ có chứa hoạt chất gây độc cho tế bào ung thư làm tiêu diệt giảm trình phát triển chúng, đồng thời có hoạt chất kích thích phát triển dòng tế bào lympho Th1 hệ miễn dịch [2] Saponin nhóm glycoside lớn thường gặp thực vật với cấu tạo gồm hai phần genin (sapogenin) phần đường Dựa vào cấu trúc phần genin, saponin chia thành hai nhóm saponin tritrerpene saponin steroid Saponin nhóm chất có cấu trúc amphiphilic, có đầu ưa nước (carbohydrate) đầu kị nước (steroid triterpene) [1] Hoạt tính sinh học saponin kích thích hệ miễn dịch thể ức chế phát triển khối u Trong nghiên cứu tiến hành tối ưu hóa q trình chiết xuất saponin thơ tổng số từ đu đủ Ở nhiều nơi giới, đặc biệt khu vực châu Á, đu đủ sử dụng loại thuốc dân gian để chữa lành vết bỏng, giảm triệu chứng hen suyễn, điều trị giun đường ruột vấn đề đường tiêu hóa, điều trị bệnh lị nhiễm trùng amip [1] Ngoài ra, đu đủ sử dụng làm tăng thèm ăn, giảm đau bụng kinh, giảm buồn nôn Nước sắc đu đủ công bố có tác dụng chống ung thư, thuốc dân gian thổ dân Úc, phổ biến qua nhiều nước khác có Việt Nam Nghiên cứu gần nhà khoa học Nhật Địa liên hệ: Tel.: (+84) 961.806.218 Email: vien.dothihoa@hust.edu.vn * 96 Journal of Science & Technology 129 (2018) 096-100 để làm tiền đề cho việc khảo sát hoạt tính sinh học khả ứng dụng chúng hỗ trợ phòng chống ung thư Để chiết xuất saponin, phương pháp chiết thu dịch chiết tổng số, sau sử dụng dung mơi có độ phân cực tăng dần để chiết nhóm chất Trong nghiên cứu này, chiết loại hợp chất khơng phân cực trước, sau chiết thu dịch tổng chất phân cực, tiếp đến sử dụng n-butanol để chiết thu saponin [3, 4] saponin dịch chiết tổng số từ đu đủ phản ứng định tính đặc trưng Tiến hành tối ưu cổ điển trình chiết cao chiết tổng số dung môi MeOH tinh khiết (≥ 98%) ba yếu tố lựa chọn khảo sát nhiệt độ, thời gian chiết tỉ lệ nguyên liệu/dung môi để chọn khoảng tối ưu thích hợp Thực tối ưu hóa q trình chiết nói phương pháp quy hoạch thực nghiệm Xác định giá trị tối ưu ba yếu tố: nhiệt độ chiết, thời gian chiết tỉ lệ lệ nguyên liệu/dung môi chiết cách sử dụng mơ hình Box-Benken, yếu tố tiến hành ba mức (+1; 0; -1) Các thí nghiệm bố trí bảng 1, gồm 17 thí nghiệm, có thí nghiệm thực tâm với hàm mục tiêu hàm lượng cao chiết tổng số thu lớn Các thí nghiệm tiến hành điều kiện máy lắc, tốc độ lắc 200 vịng/phút Mỗi thí nghiệm tiến hành với gam nguyên liệu Xử lí số liệu thực nghiệm phần mềm thống kê Design-Expert 10 trial [5, 6] Nguyên liệu phương pháp 2.1 Nguyên liệu Lá đu đủ thu hái huyện Đông Anh, Hà Nội Lá đảm bảo tươi xanh, trưởng thành khỏe mạnh không bị sâu bệnh hại Lá sau thu hái làm sạch, sấy khô nghiền nhỏ đến kích thước 1mm Bột có độ ẩm 9,7%, bảo quản túi bóng hàn kín để nơi khơ ráo, thống mát 2.2 Phương pháp Chiết xuất saponin tổng số thơ sơ đồ hình [3, 4] Kết thảo luận 3.1 Khảo sát giá trị thích hợp thơng số kỹ thuật trình chiết thu cao chiết tổng số Lá đu đủ sấy khô Nghiền Chúng lựa chọn MeOH tinh khiết (≥ 98%) làm dung môi để chiết thu cao chiết tổng số [3, 4]; chọn thông số có ảnh hưởng nhiều đến q trình chiết nhiệt độ chiết, thời gian chiết tỉ lệ nguyên liệu/dung môi để tiến hành khảo sát [7] Tiến hành tối ưu cổ điển với khoảng khảo sát ban đầu yếu tố là: Nhiệt độ chiết : 40 - 60oC Thời gian chiết : 24 - 72 Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi : 1/5 - 1/8 Bột đu đủ CH2Cl2 Bã chiết MeOH Cao chiết tổng số (cô quay chân không) n-butanol/nước (3 lần) 3.1.1 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ chiết với giá trị thời gian chiết cố định 48 tỉ lệ ngun liệu/dung mơi chiết 1/7 Kết trình bày hình Dịch chiết n-butanol (cơ quay chân khơng) CHCl3 (3 lần) Hàm lượng cao chiết, % Cao saponin tổng số Sấy đông khô Saponin tổng số thô (dạng bột) 10,000 7,854 8,463 6,481 6,548 5,000 0,000 40 45 50 Nhiệt độ chiết, 60 oC Hình Quy trình chiết xuất saponin tổng số Hình Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hàm lượng cao chiết tổng số Xác định độ ẩm nguyên liệu thiết bị phân tích độ ẩm Sartorius MA 35 Xác định có mặt 97 Journal of Science & Technology 129 (2018) 096-100 Kết cho thấy: nhiệt độ chiết 45oC cho hàm lượng cao chiết cao (8,463%) Khi tăng nhiệt độ chiết lên 50oC 60oC hàm lượng cao chiết tổng số có xu hướng giảm Điều giải thích q trình chiết dung môi methanol, ta tăng dần nhiệt độ làm cho động học trình chiết tăng lên chất chiết khỏi tế bào thực vật tốt Tuy nhiên, nhiệt độ tăng, số chất bị phân hủy, đồng thời nồng độ chất có mặt dung mơi chiết tăng lên dẫn đến bão hịa làm giảm khả chiết tách chất Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi chiết khảo sát với yếu tố lại cố định nhiệt độ chiết 45oC thời gian chiết 48 Kết thể hình Kết khảo sát cho thấy tăng lượng dung môi chiết hàm lượng cao chiết tăng lên Điều hồn tồn hợp lí lượng dung mơi tăng làm tăng khả hịa tan chất có ngun liệu Tuy nhiên hàm lượng dịch chiết thu tỉ lệ ngun liệu/dung mơi chiết 1/7 1/8 có khác biệt không đáng kể Và hàm lượng dịch chiết thu tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết 1/5 1/6 khơng có khác biệt rõ ràng Vì vậy, chúng tơi lựa chọn khoảng giá trị tỉ lệ ngun liệu/dung mơi chiết thích hợp 1/6 - 1/8 g/ml 3.1.2 Ảnh hưởng thời gian chiết Khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết với nhiệt độ chiết 45oC, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết 1/7 hình Kết tăng thời gian chiết hàm lượng cao chiết tăng lên đạt cực đại 48 Tuy nhiên sau 48 hàm lượng cao chiết lại giảm dần Điều giải thích thời điểm 48 thời điểm hòa tan lượng chất bão hòa nhiều Tuy nhiên sau chất nguyên liệu chiết tách thời gian dài số chất bị biến chất thành chất dễ bay 3.2 Tối ưu hóa trình chiết dich chiết tổng số quy hoạch thực nghiệm Bảng gồm 17 thí nghiệm tương ứng với 17 giá trị khác ba yếu tố nhiệt độ, thời gian tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết Ảnh hưởng yếu tố đến hàm mục tiêu xây dựng hàm hồi quy bậc cho hàm mục tiêu (hàm lượng cao chiết tổng số thu được) sau: Yi = βo + ∑ki=0 βixi + ∑ βiixi^2 + ∑ βijxixj (1) Trong đó, Yi hàm mục tiêu, βo hệ số tự do; βi, βii, βij vectơ tham số mơ hình xác định qua thực nghiệm (i, j = 1÷3) Mơ hình thống kê có ý nghĩa sử dụng sau thỏa mãn tiêu chuẩn thống kê Sự phù hợp có nghĩa mơ hình phân tích phương pháp ANOVA, có nghĩa hệ số hồi quy kiểm định chuẩn F Kết phân tích cho thấy: giá trị p mơ hình thỏa mãn p < 0,0001 mơ hình hồn tồn có nghĩa Các yếu tố nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi cặp yếu tố ảnh hưởng có nghĩa ( p < 0,05) Tuy nhiên cặp yếu tố nhiệt độ - tỉ lệ nguyên liệu/dung môi thời gian - tỉ lệ ngun liệu/dung mơi lại có giá trị p > 0,05 cho thấy chúng có ảnh hưởng tương tác đồng thời khơng nhiều đến mơ hình Hệ số hồi quy (R 2) tiến đến tốt, tính 0,9894 Điều thể có 98,94% số liệu thực nghiệm tương thích với số liệu tiên đốn theo mơ hình Mặt khác, giá trị R2 tiên đốn 0,8586 phù hợp với R2 hiệu chỉnh 0,9758 (độ lệch 0,1172 < 0,2) Độ nhiễu 21,569 > tín hiệu đầy đủ Như vậy, phương trình hồi quy tiên đốn tương thích với thực nghiệm Từ giá trị phân tích có nghĩa trên, giá trị hàm mong đợi mà phần mềm Design Expert 10 đưa biểu diễn theo phương trình cụ thể sau: Yi = -7,0105 + 0,1371X1 + 0,0629X2 + 0,7038X3 + 0,0003X1X2 – 0,0014X1X3 + 0,0008X2X3 – 0,0015X12 – 0,0008X22 – 0,0481X32 ( Trong Yi hàm lượng cao chiết khảo sát; giá trị X1, X2, X3 giá trị yếu tố nhiệt độ, thời gian tỉ lệ nguyên liệu/dung môi Hình Ảnh hưởng thời gian chiết đến hàm lượng cao chiết tổng số 3.1.3 Ảnh hưởng tỉ lệ chiết ngun liệu/dung mơi Hình Ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng cao chiết tổng số 98 Journal of Science & Technology 129 (2018) 096-100 Bảng Giá trị mức yếu tố nhiệt độ chiết, thời gian chiết, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi Các yêu tố Kí hiệu Đơn vị Bảng Ma trận thực nghiệm với yếu tố nhiệt độ, thời gian tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết Số TN n Các giá trị khảo sát Nhiệt độ chiết X1 o C 40 45 50 Thời gian chiết X2 42 51 60 Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi X3 g/ml 1/6 1/7 1/8 40 42 1/7 Hàm mục tiêu Yi Lượng cao chiết tổng số từ 3g nguyên liệu (g) 0,285 50 42 1/7 0,345 40 60 1/7 0,306 50 60 1/7 0,423 40 51 1/6 0,291 50 40 51 51 1/6 1/8 0,387 0,336 50 51 1/8 0,405 45 42 1/6 0,306 10 45 60 1/6 0,351 11 45 42 1/8 0,294 12 45 60 1/8 0,366 13 14 45 45 51 51 1/7 1/7 0,435 0,444 15 45 51 1/7 0,435 16 45 51 1/7 0,447 17 45 51 1/7 0,441 nghiệm a Nhiệt độ thời gian chiết Yếu tố thí nghiệm X1 X2 X3 Nhiệt độ Thời gian Tỉ lệ chiết chiết chiết (oC) (giờ) (g/l) Bề mặt đáp ứng yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết cao chiết tổng số mơ hình Phương trình (2) cho thấy yếu tố khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung mơi chiết có ảnh hưởng lớn đến hàm mong đợi hàm lượng cao chiết tổng số; nhiệt độ thời gian có ảnh hưởng Để bảo tồn hoạt tính chất chiết, chúng tơi không chiết nhiệt độ cao mà khảo sát khoảng nhiệt độ từ 40 đến 60oC Kết tối ưu quy hoạch thực nghiệm cho thấy khoảng biến thiên nhiệt độ việc kéo dài thêm thời gian chiết không ảnh hưởng nhiều đến hàm lượng cao chiết tổng sô thu Dựa vào giải pháp tối ưu mà phần mềm đưa ra, lựa chọn thông số tối ưu cho q trình chiết cao chiết tổng số quy mơ phịng thí nghiệm sau: nhiệt độ chiết 49oC, thời gian chiết 53 tỉ lệ chiết 1/7 g/ml Chúng tiến hành chiết xuất thu cao chiết tổng số từ đu đủ theo thông số tối ưu trên, số thí nghiệm lặp lại lần Kết thu hàm lượng cao chiết tổng số trung bình 0,4347 ± 0,0064 gam giá trị dự đốn mơ hình 0,4554 gam, sai khác 4,5% (< 5%) nằm khoảng sai số chấp nhận b Nhiệt độ tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 3.3 Chiết saponin từ cao chiết tổng số hệ dung môi n-butanol nước c Thời gian tỉ lệ ngun liệu/dung mơi Hình Bề mặt đáp ứng yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết cao chiết tổng số Cao chiết tổng số tiếp tục chiết lỏng - lỏng hệ dung môi n-butanol (nồng độ ≥ 98%) 99 Journal of Science & Technology 129 (2018) 096-100 nước Tiến hành khảo sát tỉ lệ n-butanol nước với tỉ lệ chiết 1/3, 1/4 1/5 [7], thu pha chiết n-butanol tiến hành sấy đến khối lượng không đổi thu cao chiết saponin Kết chiết bảng cho thấy lượng cao chiết saponin thu tỷ lệ nbutanol/nước 1/4 cao (0,0938 ± 0,0017 gam) Tiến hành chiết lỏng-lỏng tỷ lệ nbutanol/nước 1/4 để thu cao chiết saponin, sau tinh chloroform để loại tạp chất, thu hàm lượng saponin tổng số 0,0509 ± 0,0342 gam từ gam nguyên liệu khô ban đầu Hàm lượng cao thô saponin so với nguyên liệu khô ban đầu chiếm 1,69 ± 0,37%, cao hẳn so với kết chiết tác giả Bùi Thanh Phương (0,96%) [7] saponin steroid (hình 6b) Phân tích định tính saponin SKBM với dung mơi triển khai n-butanol bão hịa nước, thuốc thử màu H2SO4 10% ethanol, sấy khơ 105-110oC Trong sắc ký đồ SKBM có vết màu tím hoa cà - đặc trưng cho hợp chất saponin có liên kết đơi phân tử (hình 7) Kết luận Sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm đáp ứng bề mặt xác định điều kiện tối ưu cho trình chiết thu cao chiết tổng số từ đu đủ dung môi MeOH nhiệt độ 49oC, thời gian 53 tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1/7 g/ml Tiếp tục chiết thu saponin từ cao chiết tổng số phương pháp chiết lỏng – lỏng, sử dụng hệ dung môi n-butanol/nước với tỉ lệ 1/4, loại tạp chất chloroform thu saponin tổng số với hàm lượng 1,69 ± 0,37% so với nguyên liệu đu đủ khơ Kết phân tích định tính sơ xác định hợp chất saponin có mặt đu đủ thuộc nhóm saponin steroid Bảng Kết khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ nbutanol/nước đến trình chiết saponin Tỉ lệ n-butanol/nước 1/3 Lượng cao chiết saponin (g/3g nguyên liệu) 0,0935 ± 0,0021 1/4 0,0938 ± 0,0017 1/5 0,0861 ± 0,0019 Lời cám ơn Nghiên cứu thực với hỗ trợ kinh phí đề tài mã số CNHD.ĐT.065/15-17 thuộc Chương trình Hóa Dược, Bộ Cơng thương Tài liệu tham khảo a Tạo bọt môi b Tạo bọt môi trường trường nước axit mơi trường kiềm Hình Định tính saponin phương pháp tạo bọt [1] [2] [3] [4] M1 M2 M1 M2 a.Trước phun TT b Sau phun TT Hình Định tính saponin SKBM (M1, M2: saponin tổng số trước sau tinh chloroform; TT: thuốc thử) [5] 3.4 Phân tích định tính saponin Phân tích định tính saponin dịch chiết đu đủ phương pháp tạo bọt sắc ký mỏng (SKBM) [1] Kết định tính phương pháp tạo bọt cho thấy môi trường nước cột bọt cao bền 30 phút (hình 6a), điều khẳng định thêm có mặt nhóm chất saponin đu đủ Trong môi trường kiềm (pH = 13) cột bọt cao hẳn so với môi trường axit (pH = 1) chứng tỏ đu đủ chứa chủ yếu nhóm [6] [7] 100 Bộ Mơn Dược Liệu, Bài giảng Dược liệu tập 1, NXB Hà Nội, Hà Nội (1998) Nam.H.Dang Noriko Otsuki, Emi Kumagai, Akira Kondo, Satoshi Iwata, Chikao Morimoto - Aqueous extract of Carica papaya leaves exhibits anti-tumor activity and immunomodulatory effects, Journal of Ethnopharmacology, 127 (2010) 760-767 K Hostettmann and A Marston, Saponins, Cambridge University Press (1995) K Hostettmann et al., Guide des travaux pratiques de phytochimie, Institut de Pharmacognosie et Phytochimie – Université de Lausanne, Suisse (2000) Alireza Azizian Neda Zangeneh, Leonard Lye, and Radu Popescu, Application of response surface methodology in numerical geotechnical analysis, The 55th Canadian Society for Geotechnical Conference, Hamilton, Ontario, University of Newfoundland (2002) Mustapha RGUIG, Méthodologie des surfaces de réponse pour l’analysé en fiabilité des plates-formes pétrolières offshore fissuré, Mécanique [physics.med-ph], Université de Nantes Faculté des Sciences et des Techniques, Franỗais (2005) Bựi Th Thanh Phng, Nghiờn cu chit xut khảo sát hoạt tính miễn dịch nhóm hoạt chất saponin từ đu đủ, Luận văn Thạc sĩ Kĩ thuật, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội (2014) Journal of Science & Technology 129 (2018) 096-100 101 ... thơng số tối ưu cho q trình chiết cao chiết tổng số quy mơ phịng thí nghiệm sau: nhiệt độ chiết 49oC, thời gian chiết 53 tỉ lệ chiết 1/7 g/ml Chúng tiến hành chiết xuất thu cao chiết tổng số từ đu. .. sau chiết thu dịch tổng chất phân cực, tiếp đến sử dụng n-butanol để chiết thu saponin [3, 4] saponin dịch chiết tổng số từ đu đủ phản ứng định tính đặc trưng Tiến hành tối ưu cổ điển trình chiết. .. cao chiết, % Cao saponin tổng số Sấy đông khô Saponin tổng số thô (dạng bột) 10,000 7,854 8,463 6,481 6,548 5,000 0,000 40 45 50 Nhiệt độ chiết, 60 oC Hình Quy trình chiết xuất saponin tổng số