Mục tiêu nghiên cứu của luận án là xây dựng quy trình kỹ thuật biểu hiện NK1R tái tổ hợp của người thông qua hệ thống biểu hiện SFV trên dòng tế bào động vật. Đánh giá sự biểu hiện và hoạt tính của NK1R tái tổ hợp thu được. Tạo ra lượng lớn tế bào động vật biểu hiện NK1R tái tổ hợp. Đánh giá khả năng tương tác với NK1R tái tổ hợp của mộ
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phạm Thị Hồng Nhung NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH BIỂU HIỆN THỤ THỂ NEUROKININ-1 TÁI TỔ HỢP TRÊN MỘT SỐ HỆ THỐNG TẾ BÀO ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN DƯỢC PHẨM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62420121 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2018 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đinh Đoàn Long PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Phản biện: Phản biện: Phản biện: Luận án bảo vệ trước Hội đồng cấp sở chấm luận án tiến sĩ họp tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN vào hồi: .giờ .phút, ngày .tháng .năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Thụ thể neurokinin - (viết tắt NK1R) nói riêng thụ thể kết cặp với G-protein (viết tắt GPCR) nói chung đích tác dụng quan trọng nhiều thuốc Khi NK1R tương tác với chất chủ vận nội sinh dẫn truyền cảm giác đau đớn từ vùng thần kinh ngoại vi thần kinh trung ương, gây trạng thái lo âu triệu chứng giống trầm cảm Ngoài ra, NK1R tham gia kích thích co trơn điều hịa phản ứng miễn dịch thể Trên sở nghiên cứu cấu trúc chức NK1R, nhiều loại thuốc giảm đau cho bệnh nhân bị chứng đau nửa đầu, thuốc chống trầm cảm, chống nôn cho bệnh nhân ung thư… hãng dược phẩm đầu tư phát triển thương mại hóa Sàng lọc hợp chất có hoạt tính sinh học hướng đích GPCR để phát triển thành thuốc nhu cầu mang tính thời nghiên cứu dược lý học phân tử Có số lượng lớn hợp chất có nguồn gốc tự nhiên, bán tổng hợp tổng hợp (được gọi chung thuốc thử) cần xác định đích thụ thể tác dụng chế tác động lên thể Việc sử dụng GPCR tự nhiên nghiên cứu thường gặp khó khăn GPCR tự nhiên biểu mức độ thấp, có nhiều dạng biến thể khác dẫn đến nhận định nhầm khả tương tác với thuốc thử Tuy nhiên, khó khăn khắc phục cách sử dụng tế bào biểu GPCR tái tổ hợp người GPCR tái tổ hợp biểu mức độ cao đầy đủ hoạt tính cung cấp nguồn nguyên liệu dồi cho thí nghiệm xác định hoạt tính liên kết với phối tử chức liên kết G-protein Chính vậy, xây dựng mơ hình biểu mạnh GPCR tái tổ hợp người hệ thống tế bào động vật nghiên cứu cấp thiết có giá trị thực tiễn giới Việt Nam Mặc dù nhiều hệ thống biểu phát triển nhằm biểu protein ngoại lại tế bào nhân sơ đến nhân chuẩn, đến biểu hiệu suất cao chủ động protein xuyên màng tế bào thách thức lớn Sự biểu GPCR mức độ thấp có liên quan chủ yếu tới cấu trúc yêu cầu cuộn gập, vận chuyển nội bào khả gây độc tính tế bào thụ thể Có thuận lợi GPCR có cấu trúc khơng gian tương đồng, vậy, mơ hình biểu thành cơng cho thụ thể có khả mở rộng áp dụng cho nhiều thụ thể khác, đặc biệt thụ thể họ Trong hệ thống biểu hiện, hệ thống biểu Semliki Forest virut (viết tắt SFV) ghi nhận hệ thống biểu protein tế bào động vật hiệu Hệ thống ứng dụng biểu cho 100 GPCR khác mức độ biểu phần lớn trường hợp cao Ứng dụng làm chủ hệ thống biểu SFV hứa hẹn cung cấp cơng cụ sinh học hữu ích nghiên cứu y sinh dược Từ tiền đề sở thực tiễn nêu trên, tiến hành thực luận án: “Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình biểu thụ thể neurokinin-1 tái tổ hợp số hệ thống tế bào định hướng ứng dụng nghiên cứu phát triển dược phẩm” Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu tổng quát Biểu NK1R tái tổ hợp người với đầy đủ hoạt tính dịng tế bào không biểu thụ thể dạng tự nhiên ban đầu, ứng dụng bước đầu sàng lọc hoạt chất hướng đích NK1R Qua đó, hồn thiện quy trình kỹ thuật xây dựng mơ hình biểu thụ thể tái tổ hợp áp dụng cho GPCR khác dòng tế bào động vật khác 2.2 Mục tiêu cụ thể (1) Xây dựng quy trình kỹ thuật biểu NK1R tái tổ hợp người thông qua hệ thống biểu SFV dòng tế bào động vật (2) Đánh giá biểu hoạt tính NK1R tái tổ hợp thu Tạo lượng lớn tế bào động vật biểu NK1R tái tổ hợp (3) Đánh giá khả tương tác với NK1R tái tổ hợp số dịch chiết methanol tinh chất thu từ 10 loài dược liệu Việt Nam Nội dung nghiên cứu (1) Xây dựng hệ vectơ Semliki Forest virut biểu NK1 tái tổ hợp người Việt Nam (2) Ni cấy lựa chọn dịng tế bào nhân chuẩn phù hợp cho việc biểu NK1 tái tổ hợp ( 3) Xây dựng quy trình biểu NK1R tái tổ hợp người dòng tế bào động vật có vú (4) Đánh giá mức độ biểu hoạt tính chức NK1R (5) Tạo lượng lớn tế bào biểu mức độ cao NK1 tái tổ hợp, ứng dụng bước đầu nghiên cứu dược lý in vitro thụ thể NK1 tái tổ hợp dịch chiết methanol tinh chất 10 lồi dược liệu Việt Nam Những đóng góp luận án Luận án cơng trình Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ xây dựng vectơ chuyển gen mã NK1R người đến biểu thụ thể tái tổ hợp dịng tế bào động vật có vú Kết luận án có giá trị khoa học thực tiễn cao tiếp cận nghiên cứu tạo dòng tế bào động vật biểu thụ thể người mà dạng tự nhiên không biểu Thông qua hệ thống biểu SFV chúng tơi tạo dịng tế bào biểu mạnh NK1R, qua đưa quy trình mơ hình biểu thụ thể có khả áp dụng biểu cho nhiều GPCR khác Chúng tơi xây dựng mơ hình sàng lọc in vitro hoạt chất hướng đích NK1R phục vụ các nghiên cứu sàng lọc dược phẩm Đây công cụ đại phục vụ cho nghiên cứu dược lý, phù hợp với định hướng phát triển thuốc dược liệu Việt Nam Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án Về mặt khoa học Kết nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc cDNA mã hóa NK1R thu từ người Việt Nam, mở hướng nghiên cứu kỹ thuật biểu ổn định thụ thể GPCR tái tổ hợp phục vụ cho nghiên cứu cấu trúc phân tử, dược lý in vitro, góp phần định hướng cho nghiên cứu phát triển thuốc giai đoạn sau (nghiên cứu dược lý in vivo, nghiên cứu lâm sàng, nghiên cứu dược động học, ) Cơ sở khoa học hiệu kỹ thuật chuyển gen, biểu protein tái tổ hợp với hệ thống biểu SFV khẳng định thông qua việc phát triển thành công vectơ SFV mang gen mã NK1R người biểu hiệu cao dòng tế bào động vật Luận án, báo đăng tải tạp chí khoa học cơng nghệ nước quốc tế tư liệu có giá trị tham khảo nghiên cứu giảng dạy Về mặt thực tiễn Kết nghiên cứu dược lý in vitro thụ thể NK1R cho phép xác định hoạt chất hướng đích cụ thể chế tác động chúng lên tế bào Nghiên cứu mở triển vọng ứng dụng thực tiễn phát triển thuốc dược liệu, tiêu chuẩn hoá đại hoá sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên, góp phần phát huy mạnh nguồn tài nguyên dược liệu phong phú Việt Nam Không biểu hiệu GPCR, hệ thống SFV cịn cơng cụ hữu ích để chuyển gen biểu loại protein khác dòng tế bào động vật Nhiều nghiên cứu khác giới cho thấy tiềm ứng dụng hệ thống biểu SFV liệu pháp gen trị liệu ung thư hay công nghệ sản xuất vắc-xin CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN Luận án có trang (kể tài liệu tham khảo) chia thành chương, phần: Mở đầu (04 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (25 trang), Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (18 trang), Chương 3: Kết nghiên cứu bàn luận (45 trang), Kết luận đề nghị (02 trang), Các cơng trình cơng bố liên quan đến luận án (01 trang), Tài liệu tham khảo (16 trang), Phụ lục (12 trang) Luận án có bảng, 42 hình tham khảo 146 tài liệu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tổng kết nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Vai trò GPCR nghiên cứu y dược; (2) Các hệ thống biểu thụ thể GPCR tái tổ hợp; (3) Ý nghĩa nghiên cứu biểu NK1R tái tổ hợp dòng tế bào động vật; (4) Sơ lược thuốc dùng nghiên cứu Có bốn siêu họ thụ thể chính, đó, GPCR siêu họ thụ thể lớn đa dạng người (Lundstrom K., 2009) Theo thống kê năm 2017, 108 GPCR đích tác dụng 475 (chiếm khoảng 34%) thuốc Cơ quan Quản lý Thực phẩm Thuốc Hoa Kỳ (viết tắt FDA) phê duyệt Tổng doanh thu thuốc giới lên đến 180 tỷ đô la Mỹ tương ứng 27% thị phần năm (Hauser A.S cs, 2017) Do liên quan đáng kể đến sinh lý bệnh thể giá trị khám phá dược lý, GPCR đích nghiên cứu thuốc có giá trị quan tâm nhiều Tuy vậy, nghiên cứu dược lý phân tử sàng lọc thuốc sử dụng GPCR tự nhiên gặp nhiều trở ngại Cụ thể, GPCR tự nhiên thường biểu mức độ thấp, đồng thời có nhiều dạng phụ khác dạng biến thể khác dẫn đến nhận định khơng xác khả tương tác với thuốc thử (Hassaine G cs, 2006; Lundstrom K., 2006) Thêm nữa, dịng tế bào tự nhiên thường biểu tín hiệu yếu với nhiều loại thụ thể GPCR nên phép đo xác định thông số dược lực học phân tử có kết sai số lớn Dễ dàng nhận thấy khó khăn khắc phục cách sản xuất tế bào biểu protein GPCR tái tổ hợp người dùng chúng làm đích phân tử cho thí nghiệm nghiên cứu dược lý phân tử sàng lọc thuốc Bằng công nghệ DNA tái tổ hợp, đích phân tử protein có giá trị dược lý quan trọng (kể dạng phụ hay biến thể loại) phân lập, nhân dòng chủ động sản xuất lượng đủ lớn phục vụ cho nghiên cứu dược lý phân tử sàng lọc thuốc (Hassaine G cs, 2006) Hình 1.9 Các hệ thống vectơ biểu GPCR xây dựng SFV (A) Hệ thống gồm vectơ biểu vectơ hỗ trợ (B) DNA vectơ có độ dài đầy đủ hệ gen SFV (C) Các vectơ DNA biểu biến nạp trực tiếp vào tế bào động vật có vú để biểu GPCR Hiện nay, GPCR tái tổ hợp nghiên cứu biểu hệ thống dịch mã phi tế bào, hệ thống biểu tế bào nhân sơ nhân chuẩn Trong đó, hệ thống biểu Semiliki Forest virut (viết tắt SFV) đánh giá hệ thống có hiệu sản xuất GPCR tái tổ hợp người dịng tế bào động vật Hệ thống tạo lượng lớn thụ thể biểu chức không khác biệt so với dạng tự nhiên Các vectơ SFV đến ứng dụng biểu cho 100 GPCR mức độ biểu phần lớn trường hợp cao đo phối tử đánh dấu lai Western (Lundstrom K., 2006) Thụ thể neurokinin-1 (viết tắt NK1R) thuộc phân họ thụ thể tachykinin, thuộc họ thụ thể A (họ thụ thể lớn siêu họ GPCR) Ở hệ thần kinh trung ương, NK1R đóng vai trị định sống tế bào thần kinh, tham gia điều hịa phản xạ nơn, chức tim mạch, hô hấp điều chỉnh hành vi phản xạ (Ebner K cs, 2006; Marieke V.D.H., 2009) Hiện nay, nhiều chất đối vận với NK1R phát triển thành thuốc dùng cho giảm đau điều trị đau nửa đầu, thuốc chống trầm cảm, thuốc chống nôn cho bệnh nhân ung thư, … Một số nghiên cứu chất đối kháng thụ thể NK1, sau liên kết với thụ thể NK1 có tác dụng chống ung thư ức chế tăng sinh, xâm lấn, di cư tế bào ung thư cảm ứng tế bào ung thư chết theo chu trình (Berger M cs, 2014; Munoz M cs, 2015) Mười thuốc lựa chọn cho thử nghiệm đánh giá tương tác với thụ thể NK1R dựa kinh nghiệm dân gian tài liệu y học cổ truyền Ngồi canhkina lồi ngoại nhập, chín lồi cịn lại thuốc Việt Nam sử dụng nhiều thuốc y học cổ truyền Ngoại trừ Râu mèo chọn ngẫu nhiên, thuốc lại chọn dựa tác dụng chúng liên quan đến tác dụng sinh lý biết NK1R an thần, giảm đau, kháng viêm, chữa thấp khớp, hen suyễn, tăng cường miễn dịch, chống nôn, tăng co giãn trơn, thúc đẩy phân bào Trong nghiên cứu này, giả thiết ban đầu tác dụng thuốc liên quan đến NK1R 2.2.1 Nhóm phương pháp phát triển hệ thống vectơ SFV biểu NK1R, bao gồm phương pháp: (1) Khảo sát trình tự cDNA mã NK1R phân lập từ người chương trình Nucleotide Blast/ Blastx TMHMM server 2.0; (2) Thiết kế cặp mồi khuếch đại gen PCR dựa phần mềm PerPrimer phiên 1.1.14; (3) Phát triển vectơ biểu pSFV-KLEPT1.2, pSFV-KLEPT2.1 chèn NK1 vào vectơ SFV dựa công nghệ DNA tái tổ hợp; (4) Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli DH5α phương pháp sốc nhiệt; (5) Sàng lọc chủng vi khuẩn mang vectơ tái tổ hợp kỹ thuật colony-PCR giải trình tự; (6) Nhân dịng, tách chiết bảo quản vectơ 2.2.2 Phương pháp phiên mã in vitro từ vectơ biểu vectơ hỗ trợ, gồm bước bản: (1) Mở vòng plasmit pSFV-NK1 pSFV-Helper enzym giới hạn; (2) Thực phản ứng phiên mã in vitro sử dụng enzym SP6 RNA polymerase mũ m7G kiểm tra sản phẩm điện di gel agarose 2.2.3 Phương pháp tạo hạt SFV chuyển gen NK1R người mRNA tái tổ hợp chứa NK1R mRNA vỏ virut đồng biến nạp vào tế bào BHK-21 để sản xuất hạt virut SFV mang gen NK1R Công đoạn gồm bước: (1) Chuẩn bị tế bào BHK-21 đạt khoảng 80% tế bào đồng dòng để chuyển gen; (2) Đồng biến nạp RNA vào tế bào BHK-21 xung điện; (3) Thu hoạch hạt virut tạo từ tế bào BHK-21 với màng lọc 0,22 µm; (4) Cơ đặc định lượng hạt virut SFV thu thông qua đo hấp thụ quang bước sóng 260 280 nm 2.2.4 Phương pháp biểu NK1R tái tổ hợp thông qua lây nhiễm SFV 11 Virut SFV hoạt hóa thơng qua α-chymotrypsin apotinin trước lây nhiễm Khi tế bào bình T25 đạt 70 đến 80% đồng dịng, 0,5 mL dịch chứa hạt SFV hoạt hóa bổ sung vào bình ni cấy Tế bào tiếp tục nuôi 37oC qua đêm tủ CO2 để virut lây nhiễm biểu NK1R tế bào chủ Sau 12 - 48 nuôi cấy, thu tế bào để thử hoạt tính trước sử dụng cho đánh giá tương tác thuốc thử - thụ thể 2.2.5 Phương pháp đánh giá mức độ biểu hoạt tính NK1R Hạt virut tạo từ vectơ pSFV-EGFP-NK1 dùng để nghiên cứu động học biểu protein tái tổ hợp thông qua biểu protein huỳnh quang lục mạnh eGFP Hai phương pháp sử dụng để kiểm tra biểu thụ thể NK1R (1) Đánh giá có mặt NK1R thông qua lai Western; (2) Đánh giá biểu chức NK1R qua phép thử Fura-2 với phối tử đặc hiệu NK1R chất P (viết tắt SP) Chúng sử dụng Kit Fura-2AM đo động học máy đo huỳnh quang Chameleon liên tục 60 giây Quá trình đo động học liên tục giúp xác định biến thiên nồng độ Ca2+ nội bào theo thời gian Mỗi thí nghiệm lặp lại lần tiến hành đĩa 96 giếng với 100 µl môi trường chứa khoảng 60.000 tế bào 2.2.6 Phương pháp nghiên cứu dược lý in vitro dịch chiết methanol tinh chất số dược liệu Việt Nam thụ thể NK1 tái tổ hợp Trong phép thử Fura 2AM đánh giá tương tác thụ thể phối tử, thuốc thử thử với với ba lần lặp lại vùng nồng độ 10-1 - 103 g/mL với dịch chiết methanol 10-3 - 103 M với tinh chất Dịch chiết methanol tinh chất pha loãng theo dãy logarit đệm HBSS 10x 12 Các giá trị thu từ nồng độ thuốc thử dùng để dựng đường cong liều lượng - đáp ứng (dose response curve) phần mềm Graph Prism 6.01 theo mơ hình sigmoid (động học thụ thể/ enzym) Thông số động học thuốc thử (EC50/Kd chất chủ vận IC50/Ki chất đối kháng) xác định qua đường cong liều lượng - đáp ứng CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1 Phát phát triển hệ thống vectơ SFV biểu NK1R Kết so sánh trình tự cDNA mã NK1R phân lập từ người Việt Nam với trình tự công bố GeneBank (NM_001058.3) cho thấy xuất đột biến thay nucleotit, dạng đột biến đồng hoán (transition mutation) thay adenin (A) thành guanin (G) vị trí 187, 373, 644 998 Hai trình tự DNA có độ tương đồng 99% (giống 1327/1331 nucleotit) Tiếp theo, kết so sánh trình tự protein suy diễn từ cDNA với trình tự protein NK1 cơng bố (mã P25103.1) cho thấy hai chuỗi polypeptit có độ tương đồng 99% (giống 403/407 axit amin) Căn vào cấu hình 3D thụ thể NK1 xây dựng dựa vào trình tự P25103.1 (Santosh A Và cs, 2005) chúng tơi dự đốn đột biến cDNA làm thay đổi axit amin Tuy nhiên, vị trí quan trọng đột biến làm thay đổi hoạt tính thụ thể khơng bị thay đổi Sử dụng phần mềm TMHMM server 2.0, kết cho thấy trình tự protein suy diễn từ cDNA mã cho NK1R tạo vùng xuyên màng Như vậy, cDNA mã NK1 sử dụng nghiên cứu có khả biểu protein với cấu trúc điển hình gồm chuỗi xuyên màng GPCR 13 Các cặp mồi phục vụ cho sàng lọc vectơ SFV mang gen mã NK1R thiết kế với vị trí mơ tả Hình 3.5 Sàng lọc khuẩn lạc có vectơ pSFV-KLEPT1.2 pSFV-EGFP cài cDNA mã NK1R thông qua hai cặp mồi tương ứng SFV-F1/NK1R-R2 (Hình 3.9) SFV-F1/ NK1-R2 (Hình 3.11) Khuẩn lạc mang đoạn chèn NK1 chiều vectơ tạo sản phẩm colony-PCR có kích thước khoảng 900 bp Kết giải trình tự đoạn chèn vectơ khuẩn lạc lên băng colony khoảng 900 bp cho thấy đoạn chèn mã cho NK1R, có độ tương đồng 100% với trình tự cDNA mã NK1R vectơ nhân dịng pJET1.2-NK1 Như chúng tơi tạo thành công vectơ biểu pSFV chèn cDNA mã cho NK1R có chiều dài đầy đủ Hình 3.5 Vị trí mồi dùng nhân dịng đoạn chèn mã cho NK1R vectơ pSFV2-EGFP-NK1 pSFV-KLEPT1.2NK1 NK1: gen mã cho neurokinin-1, EGFP: gen mã cho protein huỳnh quang lục mạnh, OM6: đoạn trình tự mã hóa cho Đi Flag, poly-Histidin vị trí Thrombin 14 Hình 3.8 Kết sàng lọc khuẩn lạc mang vectơ tái tổ hợp pSFV-KLEPT1.2-NK1 Kết ni cấy đĩa LB đặc có bổ sung ampicillin khuẩn lạc E.coli biến nạp: (A) hỗn hợp nối pSFV-KLEPT1.2-NK1; (B) hỗn hợp nối chứa pSFV-KLEPT1.2 mở vòng (C) Kết điện di sản phẩm colony - PCR với cặp mồi SFV-F1/NK1R-R2: (-): đối chứng âm (PCR E.coli không biến nạp); (+): đối chứng dương (PCR gen NK1); 1-5: sản phẩm colony - PCR với mồi SFV-F1 NK1R2; M1: thang chuẩn DNA 1kb Hình 3.11 Kết sàng lọc khuẩn lạc mang vectơ tái tổ hợp pSFV-EGFP-NK1 Kết nuôi cấy đĩa LB đặc có bổ sung ampicillin khuẩn lạc E.coli biến nạp: (A) hỗn hợp nối pSFV- EGFP -NK1; (B) hỗn hợp nối chứa pSFV2 mở vòng (C): Kết điện di sản phẩm colony - PCR với cặp mồi SFVF2/NK1R-R2: (-): đối chứng âm (PCR E.coli không biến nạp); (+): đối chứng dương (PCR gen NK1); 1-4: sản phẩm colony - PCR với mồi SFV-F1 NK1R2; M1: thang chuẩn DNA 1kb 15 3.2 Phiên mã in vitro từ vectơ biểu vectơ Kết điện di gel agarose 1% Hình 3.12, pS (DNA plasmit pSFV-KLEPT1.2-NK1R mở vòng enzym NruI) pH (DNA plasmit pSFV-Helper2 mở vòng enzym SpeI) thu băng DNA tương đồng với kích thước lý thuyết Như vậy, q trình mở vòng vectơ đạt hiệu mong muốn Kết điện di sản phẩm RNA tạo từ vectơ pSFV- KLEPT1.2-NK1R pSFV-Helper2 có độ đặc hiệu cao, sản phẩm phiên mã hoàn toàn với độ dài đầy đủ; khơng có vệt băng kéo dài phản ứng phiên mã khơng hồn tồn Hình 3.12 Kiểm tra chất lượng DNA plasmit mở vòng sản phẩm RNA phiên mã in vitro gel agraose 1% M1: thang chuẩn DNA 1kb; pS: DNA plasmit pSFV- KLEPT1.2-NK1R mở vịng enzym NruI (kích thước khoảng 12.4 kb); pH: DNA plasmit pSFV-Helper2 mở vòng enzym SpeI (kích thước khoảng 8,2 kb); mS mH: RNA pSFV- KLEPT1.2NK1R pSFV-Helper2 phiên mã invitro 3.3 Tạo hạt SFV chuyển gen NK1R người Ở bước tạo hạt virut, hai đoạn RNA tạo từ pSFVNK1R pSFV-Helper2 đồng biến nạp vào tế bào BHK-21 phương pháp xung điện với điều kiện sau tối ưu hiệu 16 điện kiểu bắn xung trình bày Bảng 3.2 Sau lần lặp lại thí nghiệm tối ưu kết quan sát lô tạo hạt virut sau đó, chúng tơi nhận thấy tượng tan bào BHK-21 ổn định sau 42 Chính vậy, 42 sau chuyển gen xung điện thường lựa chọn thời điểm thu hạt virut từ môi trường ni cấy sử dụng màng lọc 0.22 µm Bảng 3.2 Chế độ xung điện đồng biến nạp RNA hệ SFV vào tế bào BHK-21 thiết bị Gene pulser Xcell II Bình ni T75 (chứa BHK-21) Bình tạo virut (bổ sung RNA) Đối chứng vật lý (không RNA) Đối chứng sinh học (khơng RNA) Kiểu bắn xung Trở kháng (µF) Phân rã theo hàm mũ Phân rã theo hàm mũ Hiệu Số lần điệu bắn (V) xung Thời gian 75 360 0.9 ms 75 360 0.9 ms - - - Mật độ virut thu sau đặc theo quy trình nêu phần 2.3.3 trung bình 34.9 ng/mL tương ứng 50 1010 (hạt virut/mL) với OD260/280 1.04 ± 0.8 3.4 Nuôi cấy chọn dòng tế bào biểu NK1R tái tổ hợp Kết lai Western thể Hình 3.14 cho thấy dòng tế bào U937, HeLa, HEK-293 xuất băng có kích thước phù hợp với thụ thể NK1R (khoảng 46 kDa) Trong dòng tế bào ni cấy, có dịng tế bào CHO khơng biểu NK1R dạng tự nhiên lựa chọn để biểu NK1R tái tổ hợp người 3.4.2 Chuyển gen thông qua lây nhiễm virut SFV 17 Hình 3.14 Kết lai Western dòng tế bào động vật với kháng thể neurokinin beta actin Kí hiệu làn: dịng tế bào nghiên cứu 3.5 Đánh giá biểu NK1R tái tổ hợp tế bào CHO 3.5.1 Đánh giá động học biểu protein Kết quan sát tế bào CHO cho thấy tế bào biểu eGFP mạnh sau 24 đến 48 lây nhiễm virut SFV mang gen eGFP tái tổ hợp Như vậy, tế bào CHO sử dụng nghiên cứu liên quan đến biểu protein tái tổ hợp khoảng thời gian từ 24 đến 48 sau lây nhiễm virut SFV Hình 3.15 Ảnh hiển vi huỳnh quang tế bào CHO lây nhiễm virut SFV mang gen eGFP tái tổ hợp Ảnh chụp tế bào sau lây nhiễm hạt SFV-eGFP 24 (A) 48 (B) 18 3.5.2 Đánh giá mức độ biểu NK1R qua lai Western Kết băng lai Western Hình 3.17 cho thấy có dịng tế bào CHO-NK1R xuất băng tương ứng với kích thước thụ thể NK1R 46 KDa Như vậy, biểu thành công thụ thể NK1 người dịng tế bào CHO mà dạng tự nhiên khơng biểu thụ thể thông qua hệ thống biểu SFV Hình 3.17 Ảnh lai Western với kháng thể tubulin kháng thể NK1R tế bào CHO tự nhiên tế bào CHO biểu NK1R CHO: mẫu tế bào CHO tự nhiên; CHO -NK1R: mẫu tế bào CHO phân tích 24 sau lây nhiễm hạt SFV-NK1R; Marker: thang chuẩn protein PageRuler™ Prestained (sử dụng ảnh hình màng lai) 3.5.3 Phép thử chức thụ thể sử dụng Fura-2AM Với phép thử chức thụ thể phương pháp Fura-2, Lượng Ca2+ giải phóng tính từ tỉ số F340/F390 tăng SP kích thích cho thấy tế bào CHO-NK1R biểu thụ thể có chức truyền tín hiệu (đường số , Hình 3.18), tế bào CHO khơng lây nhiễm virut SFV khơng có đáp ứng tế bào suốt thời gian đo dù bổ sung SP (đường số , Hình 3.18) Từ kết lai Western Fura-2, CHO lây nhiễm hạt 19 virut SFV khẳng định biểu thành công thụ thể NK1R hoạt động chức năng, sẵn sàng sử dụng cho nghiên cứu dược lý phân tử sàng lọc thuốc Hình 3.18 Sự thay đổi Ca2+ nội bào tế bào CHO CHO-NK1R theo thời gian sau bổ sung chất P 3.6 Nghiên cứu dược lý in vitro dịch chiết methanol tinh chất số dược liệu Việt Nam thụ thể NK1 tái tổ hợp 3.6.1 Xác định thông số dược lực học chất chủ vận chất đối kháng đặc hiệu Kết Hình 3.19 cho thấy tế bào CHO khơng lây nhiễm virut (CHO đối chứng) khơng có đáp ứng tế bào xảy xử lý với SP nồng độ Trong đường số , nồng độ SP tăng từ 10-12 đến 10-5M tế bào CHO lây nhiễm SFV-NK1R xuất đáp ứng nội bào, thể qua lượng Ca2+ giải phóng tăng theo hàm sigmoit trở nên bắt đầu bão hòa nồng độ cao SP (10-7 đến 10-6 M) Từ hàm hồi quy thu được, xác định Kd SP 7,32 ± 1,24 nM, thuộc vùng nanomol, giống phần lớn phối tử đặc hiệu tương tác với thụ thể GPCR nói chung (Kroeze W.K.,2003; Marinissen M.J.,2001) 20 thụ thể tachykinin (NK-1R, NK-2R NK3-R) nói riêng (Almeida Ta,2004; Pannefather Jn, 2004) Từ kết chúng tơi xác định EC80 (nồng độ kích thích thụ thể đạt 80% hoạt độ tối đa) SP 10-7M Trong điều kiện có mặt 10-7M SP, bổ sung nồng độ tăng dần từ 10-12 đến 10-5M chất đối kháng đặc hiệu AP Ở kết thể đường số Hình 3.19, hoạt độ thụ thể giảm rõ rệt nồng độ AP tăng dần Qua đó, chúng tơi xác định giá trị Ki AP thông qua Phương trình Cheng-Prusoff mơ hình tế bào CHO-NK1R nghiên cứu 41,1 ± 9,90 nM, thuộc vùng nanomol Hình 3.19 Đường cong đáp ứng theo liều thể hoạt tính biểu chức thụ thể NK1R tái tổ hợp người Giá trị Kd SP tương tác với tế bào NK1R-CHO dựa đường cong đáp ứng theo liều (đường số ) giá trị Ki chất đối vận aprepitant có mặt 10-7M SP (đường số ) Tế bào CHO không lây nhiễm virut dùng làm đối chứng âm (CHO đối chứng) không đáp ứng xử lý SP nồng độ (đường số ) 21 Trong thí nghiệm sơ cấp, dịch chiết methanol tinh chất 10 loài thuốc chọn cho nghiên cứu thử nghiệm với tế bào CHO lây nhiễm SFV-NK1R không gây đáp ứng tăng sinh Ca2+ nội bào nồng độ thử nghiệm dải từ đến 1000 g/mL (được chuẩn bị theo dãy Log10) Điều chứng tỏ khơng có dịch chiết lồi thuốc có xu hướng biểu hoạt tính chủ vận, hay hoạt hóa thụ thể Kết nghiên cứu trùng lặp với nhiều nghiên cứu sàng lọc trước đây, cho thấy bắt gặp hợp chất tự nhiên có hoạt tính chủ vận thụ thể hệ thần kinh trung ương (Matsushima.M., 1994; Simmen U., 1999) Từ kết sơ đó, chúng tơi tiến hành thí nghiệm thứ cấp với giả thiết dịch chiết/ tinh chất có hoạt tính đối kháng thụ thể NK1R Trên sở đường cong liều lượng - đáp ứng xây dựng, xác định số IC50 dịch chiết/ tinh chất Phân tích kết chúng tơi nhận thấy số 10 lồi dược liệu sàng lọc, tính trung bình hoạt độ mạnh quan sát thấy lồi Bình vơi với giá trị IC50 xác định khoảng từ 4,7 0,21 đến 53,1 1,93 g/mL; giá trị IC50 trung bình (IC50TB) lồi 20,1 g/mL Tiếp theo Hồ tiêu với giá trị IC50 dao động từ 5,7 ± 0,41 đến 60,5 ± 2,77 g/mL (IC50TB 29.9 g/mL) Hòe với giá trị IC50 từ 15,4 0,27 đến 63,5 1,42 g/mL (IC50TB 58.5 g/mL) Nhình chung, dịch chiết methanol lồi khác có hoạt độ yếu (IC50TB > 60 g/mL) với hoạt lực xác định theo trật tự: Cỏ mần trầu (IC50TB 76,1 g/mL) > Râu mèo (IC50TB 93,1 g/mL) > loài Panax (IC50TB 99,2 g/mL) > Đảng sâm (IC50TB 100,1 g/mL) > Canh ki na (IC50 TB 433,7 g/mL) Riêng dịch chiết Ba Kích, số IC50 khơng xác định tín hiệu 22 huỳnh quang có xu hướng khơng đổi nồng độ dịch chiết tăng tới 100 g/mL, nồng độ 1000 g/mL tín hiệu tăng đột ngột Vì nồng độ cao dịch chiết nên tượng biểu kiểu tương tác khơng đặc hiệu đó.Tiếp tục phân tích sâu hơn, tiến hành đánh giá trực tiếp tương tác tinh chất kể với thụ thể NK1R, phân tích lặp lại lần Điều đáng ý chúng tơi tìm thấy hoạt độ ức chế mạnh rotundin từ Bình vơi với IC50 xác định 0,88 M Hoạt tính ức chế thấp quan sát thấy capsaicin piperine từ Hồ tiêu với IC50 hai chất vào khoảng 2,0 M Trong đó, rutin không ức chế thụ thể NK1R nông độ tăng cao đến 100 M 3.7 Khả phát triển ứng dụng y dược từ kết nghiên cứu 3.7.1 Nghiên cứu di truyền dược lý dạng phụ khác thụ thể NK1 3.7.2 Sản xuất dòng tế bào biểu thụ thể GPCR tái tổ hợp người phục vụ sàng lọc in vitro hoạt chất hướng đích 3.7.3 Liệu pháp gen điều trị ung thư sản xuất vắc-xin KẾT LUẬN Đã thiết lập quy trình kỹ thuật biểu thụ thể neurokinin-1 (NK1R) tái tổ hợp người thông qua hệ vectơ biểu Semliki Forest Virut (SFV) Trong bốn dịng tế bào ni cấy (CHO, U937, HeLa, HEK- 293), có CHO khơng biểu NK1R dạng tự nhiên nên lựa chọn dòng tế bào biểu NK1R tái tổ hợp người 23 Đã tạo lượng lớn tế bào CHO biểu mạnh thụ thể NK1R tái tổ hợp thông qua lây nhiễm hạt virut Semliki Forest Mặc dù cDNA mã NK1R phân lập từ mẫu sinh phẩm bệnh nhân người Việt Nam có vị trí khác so với trình tự cơng bố NCBI (#M81797.1), NK1R tái tổ hợp biểu chức đầy đủ qua phân tích phương pháp lai Western phép thử chức thụ thể Fura-2 Đã bước đầu thử nghiệm mơ hình đánh giá tương tác dược lực học phân tử đích NK1R dịch chiết methanol tinh chất thu từ 10 loài dược liệu Việt Nam Đáng lưu ý, dược lực in vitro dịch chiết củ Bình vơi (S cambodica) thụ thể NK1R có tương quan với hàm lượng Rotundin Rotundin có hoạt lực ức chế NK1R tương đối mạnh (IC50 = 0,88 µM), định hướng NK1R đích phân tử quan trọng Rotundin KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Mở rộng áp dụng thụ thể NK1R tái tổ hợp tạo từ đề tài nghiên cứu dược lý học dược liệu khác Việt Nam Áp dụng mở rộng quy trình kỹ thuật thiếp lập để nhân dòng biểu thụ thể GPCR khác Tăng cường nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học cấp phân tử dược liệu Việt Nam 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Phạm Thị Hồng Nhung, Đinh Đoàn Long (2014), “Hệ vectơ SemLiki Forest Virut: nghiên cứu phát triển vectơ ứng dụng sinh y - dược”, Hội nghị Khoa học Công nghệ tuổi trẻ Khoa Y Dược ĐHQGHN lần I, tr.1-8 Phạm Thị Hồng Nhung, Hoàng Thị Mỹ Nhung, Đinh Đoàn Long (2015), “Cải biến vectơ hệ Virut Semiliki Forest (SFV) nhằm biểu thụ thể GPCR người Việt Nam”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 31(1), tr.47-52 Long Doan Dinh, Nhung Hong Thi Pham, Nhung My Thi Hoang, Cuong Trinh Tat, Van Hong Thi Nguyen, Lan Thuong Thi Vo, Huyen Thanh Pham, Kenneth Lundstrom (2015), “Expression of Human Neurokinin-1 Receptor in CHO Cells to Evaluate Involvement with Vietnamese Medicinal Plant Extracts”, 12th Protein Expression in Animal Cells, pp.175 Long Doan Dinh, Nhung Hong Thi Pham, Nhung My Thi Hoang, Cuong Trinh Tat, Van Hong Thi Nguyen, Lan Thuong Thi Vo, Huyen Thanh Pham, Kenneth Lundstrom (2015), “Interaction of Vietnamese Medicinal Plant Extracts with Recombinantly Expressed Human Neurokinin-1 Receptor”, Journal of Planta Medica Letters 2(1), pp e42 - e47 Tác giả phụ Bằng độc quyền sáng chế: “Quy trình sản xuất dịng tế bào biểu thụ thể Neurokinin-1 người (hNK1R)” Cấp theo Quyết định số 49722/QĐ-SHTT, ngày 25/07/2017 Cục Sở hữu Trí tuệ (Bộ Khoa học Cơng nghệ, Việt Nam) Phạm Thị Hồng Nhung, Đinh Đoàn Long (2018), “Xây dựng mơ hình sàng lọc invitro hoạt chất hướng đích dựa thụ thể hệ thần kinh trung ương tái tổ hợp”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 34(1), tr.105-110 ... hóa quy trình biểu thụ thể neurokinin-1 tái tổ hợp số hệ thống tế bào định hướng ứng dụng nghiên cứu phát triển dược phẩm” Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu tổng quát Biểu NK1R tái tổ hợp người... nghiên cứu biểu hệ thống dịch mã phi tế bào, hệ thống biểu tế bào nhân sơ nhân chuẩn Trong đó, hệ thống biểu Semiliki Forest virut (viết tắt SFV) đánh giá hệ thống có hiệu sản xuất GPCR tái tổ hợp. .. thể họ Trong hệ thống biểu hiện, hệ thống biểu Semliki Forest virut (viết tắt SFV) ghi nhận hệ thống biểu protein tế bào động vật hiệu Hệ thống ứng dụng biểu cho 100 GPCR khác mức độ biểu phần