Đánh giá khả năng bảo hộ của gà được tiêm chủng kháng nguyên tái tổ hợp haemagglutinin dung hợp IgMFc có nguồn gốc từ thực vật

Nghiên cứu này trình bày các kết quả gây đáp ứng miễn dịch trên gà của kháng nguyên HA oligomer (H5TG oligomer, được tạo thành do sự dung hợp kháng nguyên H5TG trimer với motif IgMFc) có nguồn gốc từ thực vật và đánh giá khả năng bảo hộ gà bằng thí nghiệm công cường độc với chủng virus A/duck/TG/NAVET(3)/2013 clade 1.1.

Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(3): 477-485, 2020 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẢO HỘ CỦA GÀ ĐƯỢC TIÊM CHỦNG KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP HAEMAGGLUTININ DUNG HỢP IgMFc CÓ NGUỒN GỐC TỪ THỰC VẬT Phạm Thị Vân1, 2, Hồ Thị Thương1, Nguyễn Thu Giang1, Phạm Bích Ngọc1,2, Vũ Huyền Trang1,2, Phan Trọng Hoàng3, Trần Xuân Hạnh4, Udo Conrad3, Chu Hồng Hà1,2, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện nghiên cứu trồng di truyền thực vật (IPK), Gatersleben, Cộng hòa Liên bang Đức Công ty Cổ phần thuốc thú y Trung ương NAVETCO, Việt Nam Người chịu trách nhiệm liên lạc E-mail: chuhoangha@ibt.ac.vn  Ngày nhận bài: 11.10.2019 Ngày nhận đăng: 20.8.2020 TĨM TẮT Tiêm phịng vaccine biện pháp hiệu bảo vệ vật nuôi chống lại virus cúm A/H5N1 Haemagglutinin (HA) glycoprotein màng virus A/H5N1 kháng nguyên quan trọng phát triển vaccine phòng bệnh cúm Vaccine dựa vào HA sản xuất thực vật chứng minh có khả kích thích sản sinh kháng thể trung hịa Nghiên cứu trình bày kết gây đáp ứng miễn dịch gà kháng nguyên HA oligomer (H5TG oligomer, tạo thành dung hợp kháng nguyên H5TG trimer với motif IgMFc) có nguồn gốc từ thực vật đánh giá khả bảo hộ gà thí nghiệm cơng cường độc với chủng virus A/duck/TG/NAVET(3)/2013 clade 1.1 Các huyết gà sau lần tiêm phân tích phương pháp Western blot, ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent assay) phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (haemagglutinin inhibition, HI) Kết phân tích cho thấy, kháng nguyên H5TG oligomer kích thích sản sinh kháng thể IgY đặc hiệu HA kháng thể trung hòa virus cao so với kháng nguyên H5TG trimer không dung hợp IgMFc Tỷ lệ bảo hộ gà kháng nguyên H5TG oligomer đạt 80%, tỷ lệ bảo hộ gà kháng nguyên H5TG trimer đạt 50% Đáng ý tỷ lệ bảo hộ gà kháng nguyên H5TG oligomer thấp không đáng kể so với tỷ lệ bảo hộ gà vaccine thương mại (90%) Công ty CP thuốc thú y trung ương (NAVETCO) sản xuất Kết mở triển vọng cho việc ứng dụng kháng nguyên HA dung hợp IgMFc để tạo kháng nguyên HA tái tổ hợp dạng oligomer có nguồn gốc từ thực vật nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh cúm tương lai Từ khoá: Haemagglutinin, kháng nguyên tái tổ hợp, tiêm chủng, cơng cường độc virus, kháng thể trung hịa, tỷ lệ bảo hộ MỞ ĐẦU Cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI) virus cúm A/H5N1 gây bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh tỷ lệ gây chết cao đàn gia cầm bị bệnh Kể từ xuất lần vào năm 1996 nay, virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao gây nhiều vụ đại dịch nhiều nước giới, Việt Nam điểm nóng với số ổ dịch bùng phát cao giới Dịch cúm gia cầm liên tục tái phát hàng năm với tốc độ lây lan nhanh diễn biến phức tạp Đặc biệt, chủng virus cúm A/H5N1 cịn xâm nhiễm gây bệnh người với tỉ lệ tử vong cao trở thành mối đe 477 Phạm Thị Vân et al dọa nguy hiểm cho sức khỏe cộng đồng Theo thống kê từ năm 2003 đến tháng năm 2019, Việt Nam có 2780 điểm bùng phát dịch cúm virus A/H5N1 hầu hết tỉnh, thành phố, khiến hàng chục triệu gia cầm bị chết bị thiêu hủy, đặc biệt nghiêm trọng có 127 trường hợp lây nhiễm bệnh người số người tử vong 64 người (OIE, 2019; WHO, 2019) Theo thống kê, tính tới 06/09/2017 thiệt hại mặt kinh tế lên tới 1,8% GDP quốc gia (FAO, 2020) Virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae (Swayne & Suarez, 2000) Hệ gen virus cúm A RNA sợi đơn âm, gồm phân đoạn gen riêng biệt, mã hóa cho 11 protein khác virus, phân đoạn xếp theo trật tự: PB2, PB1 (PB1 PB1-F2), PA, HA, NP, NA, M (M1 M2), NS (NS1 NS2) Trong đó, virus cúm A chia thành subtype dựa vào khác hai kháng nguyên bề mặt haemagglutinin (HA) neuraminidase (NA) (Sfakianos, 2006) HA có chức giúp virus bám dính vào tế bào cảm thụ làm xâm nhập vật liệu di truyền virus vào bên tế bào Các glycoprotein HA định tính kháng nguyên đặc hiệu loại virus khác vị trí để loại thuốc kháng virus điều trị bệnh gắn kết phát huy tác dụng diệt virus Đồng thời HA có vai trị quan trọng việc định tính kháng nguyên sản xuất vaccine (Klenk, 2015) Vaccine biện pháp hiệu bảo vệ sức khỏe người vật nuôi chống lại virus cúm A/H5N1 (Gerhard, 2001) Phát triển vaccine hiệu quả, an toàn với giá thành rẻ phòng chống lại virus cúm A mục tiêu nghiên cứu quan trọng Việc sản xuất vaccine tái tổ hợp dựa vào HA sản xuất thực vật xu hướng thay quan trọng cho vaccine truyền thống (Shoji et al., 2009, Kalthoff et al., 2010; Floss, Conrad, 2012; Phan et al., 2017; Pham et al., 2017) Vaccine dựa vào HA sản xuất thực vật dạng trimer oligomer chứng minh có khả kích thích sản sinh kháng thể trung hòa động vật tiêm chủng (Phan et al., 2013; Phan et al., 2017) Hiện nay, việc nghiên cứu tạo protein HA tái 478 tổ hợp virus A/H5N1 dạng oligomer vấn đề nhiều nhà khoa học quan tâm Với mục tiêu tạo protein HA tái tổ hợp virus A/H5N1 dạng oligomer, nghiên cứu trước, chúng tơi dung hợp gen mã hóa protein HA (H5TG) có nguồn gốc từ virus A/duck/Vietnam/TG24-01/2005 với GCN4pIIIgMFc để tạo protein tái tổ hợp H5TGpIIIgMFc (H5TG oligomer) Protein H5TGpIIIgMFc tiếp biểu tạm thời thuốc Nicotiana benthamiana Bước đầu phân tích đặc điểm cấu trúc hoạt tính sinh học cho thấy, protein H5TGpII-IgMFc có tồn dạng oligomer hàm lượng protein H5TG oligomer nhỏ để gây ngưng kết tế bào hồng cầu gà (1 HAU) 0,06 µg thấp nhiều so với protein H5TG trimer (là 0,24 µg) Điều cho thấy việc dung hợp IgMFc vào protein H5TG tạo trạng thái oligomer H5TG với hoạt tính ngưng kết hồng cầu mạnh so với protein H5TG không dung hợp với IgMFc Kết mở khả ứng dụng motif IgMFc việc tạo oligomer dung hợp với protein khác nhằm tăng cường hoạt tính sinh học protein đích nghiên cứu tạo vaccine tái tổ hợp (Pham et al., 2020) Để tiếp tục hướng nghiên cứu trên, nghiên cứu này, hoạt tính sinh học protein tái tổ hợp H5TG oligomer đánh giá in vivo gà Đầu tiên, protein tái tổ hợp gây đáp ứng miễn dịch gà Tiếp đến, khả bảo hộ gà protein H5TG tái tổ hợp đánh giá công cường độc với virus cúm A/duck/TG/NAVET(3)/2013 clade 1.1 Ngồi ra, kháng thể trung hịa kháng thể IgY đặc hiệu HA huyết gà đánh giá phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu, phản ứng Western blot ELISA NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Kháng nguyên haemagglutinin Protein haemagglutinin có (H5TG oligomer) khơng dung hợp IgMFc (H5TG trimer) tinh loại, có nguồn gốc sản xuất thuốc biến nạp tạm thời cung cấp Phịng Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(3): 477-485, 2020 Công nghệ tế bào thực vật Phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Viện Cơng nghệ sinh học Gà thí nghiệm, chủng virus cơng cường độc Gà thí nghiệm chủng virus cơng cường độc chuẩn bị theo tiêu chuẩn Công ty NAVETCO Gà giống tuần tuổi chưa tiêm vaccine cúm gia cầm chưa bị nhiễm tự nhiên với virus cúm gia cầm có huyết âm tính với kháng thể H5N1 Chủng virus cho công cường độc A/duck/TG/NAVET(3)/2013 thuộc clade 1.1 Thí nghiệm miễn dịch gà Có nhóm thí nghiệm, nhóm thí nghiệm sử dụng 10 gà tuần tuổi, bao gồm hai nhóm thí nghiệm chứa kháng ngun HA tái tổ hợp H5TG oligomer H5TG trimer (10 g kháng nguyên HA/con gà), hai nhóm đối chứng gồm vaccine NAVETCO – nhóm đối chứng dương sử dụng vaccine Navet-Vifluvac PBS – nhóm đối chứng âm, đệm PBS (100 mM NaCl, 32 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, pH 7,2) không chứa kháng nguyên HA tái tổ hợp Gà tiêm lần với nhóm kháng nguyên tương ứng, lần tiêm 0,5 mL/gà (như mơ tả Hình 1) Lần tiêm chủng thứ cách lần tiêm chủng thứ hai tuần Một ngày trước tiêm chủng lần thứ hai trước công cường độc, huyết gà tất nhóm thu thập để phân tích Western blot, ELISA HI (gọi huyết trước công) Hai tuần sau tiêm chủng lần thứ hai, gà tất nhóm thí nghiệm cơng cường độc với chủng virus A/duck/TG/NAVET(3)/2013 clade 1.1 Liều công từ 106-106,5 ELD50 cho cách nhỏ mắt Gà theo dõi vòng 10 ngày Ở ngày 10, lấy máu gà sống để đo hàm lượng kháng thể trung hòa phản ứng HI (gọi huyết sau công cường độc) Theo dõi sống, chết gà tất nhóm vịng 10 ngày sau cơng cường độc Hình Mơ hình thí nghiệm tiêm chủng công cường độc gà Phản ứng Western blot ELISA gián tiếp Để phát kháng thể IgY đặc hiệu H5TG huyết gà gây miễn dịch, Western blot thực Protein H5TG tinh SEC (700 ng) phân tách 10 giếng gel SDS-PAGE biến tính (polyacrylamide 10%) tiếp chuyển lên màng nitrocellulose 22 V, qua đêm Sau đó, màng khóa bột sữa khơng béo 5% (w/v) hịa tan dung dịch đệm PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4) Sau giờ, màng tách biệt cách cắt ủ nhiệt độ phòng 90 phút với độ pha loãng : 20 hỗn hợp huyết từ 10 gà nhóm thí nghiệm sau lần tiêm chủng thứ thứ hai Tiếp theo, màng ủ với độ pha loãng ∶ 5000 kháng thể kháng IgY gà (Anti-chicken IgY (whole molecule) Alkaline phosphatase antibody) nhiệt độ phịng Các tín hiệu phát cách ủ màng với 3,3diaminobenzidine (DAB), hòa tan 0,05 M Tris 0,04% hydro peroxide 10 phút bóng tối ELISA gián tiếp dựa phương pháp mô tả Phạm Bích Ngọc cộng (2017) có cải tiến Đầu tiên, 100 ng H5TG tinh phương pháp SEC (size exclusion chromatography) trước thêm vào giếng đĩa microtitre 96 giếng (ImmunoPlateMaxisorp, hãng Nalgen Nunc) ủ nhiệt độ phịng qua đêm Các giếng sau 479 Phạm Thị Vân et al khóa albumin huyết bò 3% (w/v) (BSA) 0,05% (v/v) Tween20 PBS (PBST) Tiếp theo, 100 µL huyết gà tiêm chủng với độ pha loãng 1000 lần bổ sung lên giếng ủ 25 °C Mỗi độ pha loãng huyết lặp lại bốn lần Các giếng rửa lần PBST sau ủ với 100 µL kháng thể kháng IgY gà (kháng thể pha loãng 35000 lần 1% (w/v) BSA) PBST 25 °C Sau đó, 100 µL dung dịch diethanolamine-HCl 0,1M (pH 9,8) có chứa chất enzyme p-nitrophenyl phosphate (pNPP) bổ sung vào ủ nhiệt độ 37 oC Tất huyết gà tất đĩa đo điều kiện ELISA Tín hiệu độ hấp thụ xác định 405 nm Các giá trị ELISA giếng kiểm tra huyết gà trừ đối chứng âm BSA pha rắn Các giá trị ELISA tất huyết gà chuẩn hóa cách sử dụng huyết kiểm soát nội gà số nhóm sau lần tiêm chủng với độ pha loãng 1000 lần Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (haemagglutination inhibition, HI ) Các thí nghiệm HI theo quy trình chuẩn Office International des Epizooties (OIE) từ năm 2004 (OIE, 2004) Kháng nguyên chủng A/H5N1 clade 1.1 bất hoạt (NAVETCO) sử dụng cho thí nghiệm HI Một lượng huyết 25 μL từ gà thêm vào giếng đĩa microtitre đáy chữ V chứa 25 μL PBS Pha lỗng nối tiếp hai lần sau thực hàng 12 giếng Một thể tích 25 μL chứa HAU protein HA tinh khiết chủng bất hoạt dị hợp đưa vào giếng ủ 30 phút 25 °C Cuối cùng, 25 μL tế bào hồng cầu gà 1% bổ sung vào giếng đĩa ủ 30 phút 25 °C Hiệu giá HI định nghĩa đối ứng độ pha lỗng cao huyết ức chế hồn tồn q trình ngưng kết tế bào hồng cầu Phân tích thống kê tính tỷ lệ bảo hộ Các phân tích thống kê cho ELISA HI thực t-test Sự khác biệt giá 480 trị trung bình liệu mẫu so sánh xác định X ± độ lệch chuẩn (SD) Giá trị P < 0,05 xem có khác biệt có ý nghĩa Tỷ lệ bảo hộ số gà sống sót tổng số gà thí nghiệm sau công cường độc KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phát kháng thể IgY đặc hiệu H5TG phản ứng Western blot ELISA gián tiếp Khả miễn dịch kháng nguyên H5TG tái tổ hợp kiểm tra cách tiêm chủng cho gà Các phản ứng miễn dịch thể dịch phụ thuộc kháng thể IgY chống lại protein H5TG phân tích SDS-PAGE biến tính Western blot (Hình 2) Các huyết gà thu thập sau tiêm chủng lần thứ thứ hai nhóm trộn lẫn sử dụng làm kháng thể thứ Kết phân tích cho thấy kháng thể IgY đặc hiệu chống lại protein H5TG phát sau lần tiêm chủng Trong đó, sau lần tiêm chủng thứ hai, tín hiệu băng Western blot mạnh nhiều thấy rõ so với lần tiêm chủng thứ nhóm tiêm chủng kháng nguyên H5TG oligomer, H5TG trimer vaccine NAVETCO Điều chứng tỏ đáp ứng miễn dịch tăng cường sau lần tiêm chủng thứ hai Còn gà đối chứng âm tiêm chủng đệm PBS, khơng có phản ứng kháng thể IgY đặc hiệu H5TG tạo ELISA xét nghiệm miễn dịch phổ biến sử dụng để phát định lượng kháng ngun kháng thể đích, phản ứng enzyme sử dụng để khuếch đại tín hiệu có chất đích (O'Connor, 2015) Trong nghiên cứu này, phản ứng miễn dịch huyết gà nhóm xác định ELISA gián tiếp Các huyết gà nhóm tiêm chủng xác định so sánh phân tích thống kê hàm t-test Kết phân tích thể Hình cho thấy, giá trị trung bình OD405 huyết gà nhóm tiêm chủng kháng nguyên H5TG oligomer cao cách có ý nghĩa so với nhóm tiêm chủng kháng nguyên H5TG trimer thấp so với nhóm đối chứng dương vaccine NAVETCO lần sau tiêm chủng thứ thứ hai (P 0,05 Thanh ngang nhóm biểu diễn cho giá trị HI trung bình nhóm Phân tích tỷ lệ bảo hộ kháng nguyên H5TG tái tổ hợp virus A/H5N1 clade 1.1 Để đánh giá hiệu kháng nguyên HA nghiên cứu, tỷ lệ bảo hộ số cho thấy kháng nguyên trở thành ứng cử viên cho sản xuất vaccine hay không Các nhóm gà tiêm chủng cơng cường độc chủng virus A/duck/TG/NAVET(3)/2013 thuộc clade 1.1 Tất gà nhóm đối chứng âm chết sau đến ngày công cường độc Các gà tiêm chủng kháng nguyên H5TG oligomer H5TG trimer không chết sau ngày công cường độc Sau 10 ngày công cường độc, 8/10 (tỷ lệ bảo hộ 80%) gà tiêm chủng kháng nguyên H5TG oligomer sống sót hai gà nhóm bị chết ngày thứ sáu bảy sau công cường độc virus; 5/10 (tỷ lệ bảo hộ 50%) gà sống sót tiêm chủng kháng nguyên H5TG 482 trimer không dung hợp IgMFc gà nhóm bị chết ngày thứ tư, năm, sáu bảy sau công cường độc virus So sánh với đối chứng dương NAVETCO (là vaccine thương mại Navet-Vifluvac, loại vaccine vô hoạt sản xuất từ virus cúm A/H5N1 chủng NIBRG-14 kỹ thuật di truyền ngược, nuôi cấy phôi trứng gà bất hoạt Formalin), có 9/10 (tỷ lệ bảo hộ 90%) gà sống sót (Hình 5) Điều cho thấy kháng nguyên H5TG oligomer có tỷ lệ bảo hộ tương đối cao so với đối chứng dương có tiềm để sử dụng làm nguồn vaccine phòng chống virus cúm A/H5N1 clade 1.1 Việc dung hợp motif vào protein đích dẫn đến thay đổi cấu trúc chức protein Trong nghiên cứu trước đây, Phan Trọng Hoàng thiết kế cấu trúc kháng nguyên HA dạng monomer có dung hợp ELP Báo cáo cho thấy kháng nguyên HA-ELP biểu mạnh thuốc kháng thể IgY đặc hiệu HA Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(3): 477-485, 2020 phát huyết gà kháng thể trung hịa khơng tạo tất gà bị chết hai ngày sau cơng cường độc, ngoại trừ có gà chết sau ba ngày cơng (Phan, 2012) Tiếp đó, HA dạng homotrimer dạng giống với cấu trúc HA tự nhiên tạo cách gắn motif GCN4 vào HA có dung hợp ELP (H5pII trimer ELP hố) khơng dung hợp ELP (H5pII trimer) Cả hai cấu trúc HA timer chứng minh có khả sinh kháng thể trung hồ kháng virus đồng chủng dị chủng chuột thí nghiệm (Phan et al., 2013) Hiệu giá HI trung bình nhóm kháng nguyên H5pII trimer cao nhóm kháng nguyên H5pII trimer ELP hóa kiểm tra HI sau lần tiêm chủng (Phan et al., 2013) Những nghiên cứu tiếp chứng minh HA oligomer làm tăng cường tính sinh miễn dịch HA động vật so với HA trimer (Phan et al., 2017; Pham et al., 2017; Phạm Thị Vân et al., 2020) Đặc biệt, kháng nguyên H5TG oligomer tạo cách dung hợp HA trimer với tiểu phần Fc kháng thể IgM (gọi tắt IgMFc) chứng minh có cấu trúc protein biểu thực vật dạng oligomer hoạt tính ngưng kết hồng cầu cao so với HA trimer khơng gắn với IgMFc Sự hình thành cấu trúc H5TG oligomer liên kết disulfide motif IgMFc tạo thành cầu nối HA trimer lại với (Phạm Thị Vân et al., 2020) Trong nghiên cứu này, kháng nguyên H5TG oligomer tiếp tục báo cáo kết đánh giá tính sinh miễn dịch khả bảo hộ gà thí nghiệm Đây bước quan trọng để đánh giá xem liệu kháng nguyên có tiềm cho sử dụng làm vaccine phịng bệnh cúm hay khơng Phân tích cho thấy, kháng nguyên H5TG oligomer tạo từ việc dung hợp HA trimer với IgMFc kích thích khả sản sinh kháng thể IgY đặc hiệu kháng thể trung hòa bảo vệ gà chống lại virus A/H5N1 clade 1.1 mạnh nhiều so với kháng nguyên HA dạng trimer không dung hợp IgMFc Đặc biệt, khả bảo hộ gà sau thí nghiệm cơng cường độc kháng nguyên H5TG oligomer (80%) thấp không đáng kể so với vaccine thương mại công ty NAVETCO (90%) Kết bước phát triển đầy hứa hẹn việc tạo vaccine cúm tiểu đơn vị có nguồn gốc từ thực vật mở hướng phát triển vaccine nước ta Hình Tỷ lệ gà sống sót sau cơng cường độc với chủng A/duck/TG/NAVET (3)/2013 KẾT LUẬN Kháng nguyên H5TG oligomer kích thích sản sinh kháng thể IgY đặc hiệu H5TG kháng thể trung hòa virus cúm A/H5N1 clade 1.1 gây miễn dịch gà thí nghiệm Tỷ lệ bảo hộ gà kháng nguyên H5TG oligomer thí nghiệm cơng cường độc với virus cúm A/duck/TG/NAVET (3)/2013 clade 1.1 đạt 80% mở triển vọng ứng dụng kháng nguyên 483 Phạm Thị Vân et al H5TG oligomer nghiên cứu sản xuất vaccine tiểu đơn vị có nguồn gốc thực vật phịng bệnh cúm A/H5N1 gia cầm tương lai Lời cảm ơn: Nghiên cứu hỗ trợ kinh phí Bộ Khoa học Công nghệ đề tài “Nghiên cứu sản xuất kháng ngun HA virus cúm A/H5N1 có tính sinh miễn dịch cao phương pháp biểu tạm thời thuốc lá”, mã số NĐT.07.GER.15 thực Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam với hợp tác Viện nghiên cứu trồng di truyền thực vật (IPK), Gatersleben, CHLB Đức Kết phần luận án nghiên cứu sinh Phạm Thị Vân Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Office International des Epizooties (OIE) - World Organization for Animal Health (2019) Update on avian influenza in animals http://www.oie.int/en/animal-health-in-theworld/update-on-avian-influenza/ Pham NB, Ho TT, Nguyen GT, Le TT, Le NT, Chang HC, Pham MD, Conrad U, Chu HH (2017) Nanodiamond enhances immune responses in mice against recombinant HA/H7N9 protein J nanobiotechnology 15: 69, doi:10.1186/s12951-0170305-2 Pham Thi Van, Phan Trong Hoang, Ho Thi Thuong, Nguyen Thu Giang, Pham Bich Ngoc, Vu Huyen Trang, Udo Conrad, Chu Hoang Ha (2020) Biofunctional enhancement of plant basedhaemagglutinin by fusion with IgMFc Tạp chí Cơng nghệ sinh học 18(2) FAO (2020) FAO in Viet Nam 5000 ngày chiến đấu với cúm gia cầm Việt Nam http://www.fao.org/vietnam/news/detail/vn/c/1038732/ Phan HT (2012) ELPylated avian flu vaccines from plants: Improvement of expression and development of a new purification strategy Thesis of PhD, MartinLuther-Universität Halle-Wittenberg, Halle (Saale), 02 October 2012 Floss DM, Conrad U (2012) Plant molecular pharming – veterinary applications In: Meyers R A (Ed.): Encyclopedia of sustainability science and technology Springer 11: 8073-8080 Phan HT, Floss DM, Conrad U (2013) Veterinary vaccines from transgenic plants: highlights of two decades of research and a promising example Curr Pharm Design 19: 5601-5611 Gerhard W (2001) The role of the antibody response in influenza virus infection Curr Top Microbiol Immunol 260: 171-190 Phan HT, Ho TT, Chu HH, Vu TH, Gresch U, Conrad U (2017) Neutralizing immune responses induced by oligomeric H5N1-hemagglutinins from plants Vet Res 48: 53, doi:10.1186/s13567-017-0458-x TÀI LIỆU THAM KHẢO Kalthoff D, Giritch A, Geisler K, Bettmann U, Klimyuk V, Hehnen HR, Gleba Y, Beer M (2010) Immunization with plant-expressed hemagglutinin protects chickens from lethal highly pathogenic avian influenza Virus H5N1 challenge infection J Virol 84: 12002-12010 Klenk HD (2015) Influenza viruses en route from birds to man Cell Host Microb 15(6): 653-4 O'Connor TP (2015) SNAP assay technology Top Companion Anim Med 30: 132-8 DOI: 10.1053/j.tcam.2015.12.002 Office International des Epizooties (OIE) - World Organization for Animal Health (2004) Highly pathogenic avian influenza, in manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds, and bees) 258–269 http://www.oie.int/en/international-standardsetting/terrestrial-manual/access-online/ 484 Phan HT, Pohl J, Floss DM, Rabenstein F, Veits J, Le BT, Chu HH, Hause G, Mettenleiter T, Conrad U (2013) ELPylated haemagglutinins produced in tobacco plants induce potentially neutralizing antibodies against H5N1 viruses in mice Plant Biotechnol J 11: 582-593, doi:10.1111/pbi.12049 Shoji Y, Bi H, Musiychuk K, Rhee A, Horsey A, Roy G, Green B, Shamloul M, Farrance CE, and Taggart B (2009) Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza Vaccine 27: 1087-1092 World Health Organization (WHO) Cumulative number of confirmed human cases for avian influenza A(H5N1) reported to WHO, 2003-2019 https://www.who.int/influenza/human_animal_interf ace/2019_04_09_tableH5N1.pdf?ua=1 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(3): 477-485, 2020 PROTECTION OF CHICKENS AGAINST A/H5N1 VIRUS BY PLANT-BASED HAEMAGGLUTININ FUSED IgMFc Pham Thi Van1, 2, Ho Thi Thuong 1, Nguyen Thu Giang1, Pham Bich Ngoc 1,2, Vu Huyen Trang 1,2 , Phan Trong Hoang3, Tran Xuan Hanh4, Udo Conrad3, Chu Hoang Ha 1,2 Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology Graduate of Science and technology, Vietnam Academy of Science and Technology Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK), Gatersleben, Germany National Veterinary Joint Stock Company NAVETCO, Vietnam SUMMARY Vaccination is one of the most effective and cost-beneficial interventions for protection of animals against the highly pathogenic A/H5N1 avian influenza virus Haemagglutinin (HA) is a transmembrane glycoprotein of A/H5N1 virus and is a critical antigen for development of the influenza vaccine The haemagglutinin-based vaccine produced in plants was demonstrated as a candidate vaccine since it elicited neutralizing antibodies against A/H5N1 virus In this study, immunogenicity and protective ability of a plant-based recombinant HA antigen which was fused to IgMFc to form oligomerized HA antigen (H5TG oligomer) had been evaluated by vaccination in chickens Chicken sera after each vaccination were collected for Western blot, ELISA and HI assays Ten days after the second vaccination, the chickens have been challenged with A/duck/TG/NAVET(3)/2013 virus, clade 1.1 The analysis results showed that the oligomeric recombinant H5TG antigen elicited stronger H5TG-specific IgY antibodies and A/H5N1 clade 1.1 virus-neutralizing antibodies than the H5TGpII trimeric recombinant antigen without fusing IgMFc in vaccinated chickens Notably, the chicken protection rate against A/H5N1 clade 1.1 virus of the H5TG oligomer antigen was 80% that is not significantly lower than that of a commercial vaccine as a positive control from National Veterinary Joint Stock company NAVETCO, Vietnam with the chicken protective rate of 90% Whereas the chicken protection rate against A/H5N1 clade 1.1 virus of the H5TG trimer antigen was 50% These results suggest that the IgMFc motif plays an important role in the forming of oligomeric proteins which had been proved for enhancing immunogenicity and protection ability in this study Therefore, the plant-based oligomerized recombinant H5TG antigen is a potential vaccine candidate against A/H5N1 influenza virus in the future Keywords: Haemagglutinin, recombinant antigen, vaccination, virus challenge, neutralizing antibodies, protective rate 485 ... chứa kháng nguyên HA tái tổ hợp Gà tiêm lần với nhóm kháng nguyên tương ứng, lần tiêm 0,5 mL /gà (như mơ tả Hình 1) Lần tiêm chủng thứ cách lần tiêm chủng thứ hai tuần Một ngày trước tiêm chủng. .. trung bình nhóm Phân tích tỷ lệ bảo hộ kháng nguyên H5TG tái tổ hợp virus A/H5N1 clade 1.1 Để đánh giá hiệu kháng nguyên HA nghiên cứu, tỷ lệ bảo hộ số cho thấy kháng nguyên trở thành ứng cử viên... dịch gà Tiếp đến, khả bảo hộ gà protein H5TG tái tổ hợp đánh giá công cường độc với virus cúm A/duck/TG/NAVET(3)/2013 clade 1.1 Ngồi ra, kháng thể trung hịa kháng thể IgY đặc hiệu HA huyết gà đánh