Ứng dụng phương pháp PCR trong việc xác định nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa, magnaporthe oryzae

Trong nghiên cứu này cặp mồi Pot2 transposon vốn được biết là chỉ hiện diện ở các nòi đạo ôn khác nhau sẽ được sử dụng để phát triển phương pháp PCR phát hiện chính xác M.oryzae trên lúa (Kachroo và cộng sự, 1994). Quy trình PCR này sẽ được tiến hành và đánh giá nhằm phát hiện M.oryzae trên lá lúa nhiễm bệnh một cách nhanh chóng và chính xác.

KỸ THUẬT – CÔNG NGHỆ 104 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR TRONG VIỆC XÁC ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA, MAGNAPORTHE ORYZAE ĐỒN THỊ HỊA Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học Môi Trường, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh niemtincsk33@gmail.com VÕ THỊ NGỌC LINH Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học Môi Trường, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh hoarequat2005@gmail.com TRƯƠNG THÀNH NHẬP Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học Mơi Trường, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh 11126341@st.hcmuaf.edu.vn NGUYỄN BẰNG PHI Khoa Tài Nguyên Môi Trường, Đại Học Thủ Dầu Một, Bình Dương bangphibdu@gmail.com NGUYỄN NGỌC BẢO CHÂU Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh – chau.nnb@ou.edu.vn NGUYỄN BẢO QUỐC Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học Môi Trường, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh baoquoc@hcmuaf.edu.vn (Ngày nhận: 19/01/2016; Ngày nhận lại: 15/03/2016; Ngày duyệt đăng: 10/06/2016) TĨM TẮT Nấm đạo ơn, Magnaporthe oryzae, tác nhân gây thiệt hại lớn đến canh tác sản xuất lúa giới Triệu chứng bệnh đạo ôn lúa giai đoạn đầu thường dễ bị nhầm lẫn với triệu chứng bệnh nấm khác gây ra, dẫn đến khó khăn cho cơng tác phịng trừ bệnh kịp thời Việc xác định nấm M.oryzae gây bệnh đạo ôn lúa phương pháp truyền thống thường nhiều thời gian, công sức khơng xác Một phương pháp thay khác phản ứng chuỗi polymerase (PCR) với cặp mồi chuyên biệt Pot2 transposon nhằm giúp giảm chi phí, thời gian công sức thực đánh giá việc xác định nấm đạo ôn nghiên cứu Kết tính chuyên biệt Pot2 transposon việc phát nấm đạo ôn lá/cổ nhiễm đạo ôn lúa không phát mẫu nấm bệnh khác Chính phương pháp PCR xem phương pháp thay chẩn đoán, đặc biệt việc phát bệnh đạo ơn đồng ruộng Từ khóa: PCR; nấm đạo ôn; bào tử; Pot2 transposon; Magnaporthe oryzae Identification of the rice blast fungus, Magnaporthe oryzae by the polymerase chain reaction (PCR) ABSTRACT Magnaporthe oryzae is a causal agent of the rice blast disease resulting serious damages in the production of rice worldwide The early symptom of rice blast disease can be confused with those caused by other fungal diseases leading to many difficulties in efficient and effective disease management Currently, identification of the rice blast fungus by using conventional method requires more time (at least 24 hours), labour and unreliability An alternative method by using polymerase chain reaction (PCR) with the primers of Pot2 transposon known to reduce those factors for detection of the rice blast fungus will be done in this study The results indicated the specificity of Pot2 transposon can be used for the rapid detection of both Magnaporthe oryzae and blast fungus infected leaf/neck in rice, but not in other phytopathogenic fungi Therefore, PCR method has been considered as an alternative tool of diagnostic, particularly in-field detection of blast disease in practice Keywords: PCR; rice blast fungus; conidia; Pot2 transposon; Magnaporthe oryzae TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ (49) 2016 Đặt vấn đề Bệnh đạo ơn hay cịn gọi bệnh cháy lúa biết đến loại nấm sợi có tên khoa học chung Magnaporthe oryzae (các tên khác Pyricularia oryzae, Pyricularia grisea, Magnaporthe grisea) gây mối đe doạ gây thiệt hại nghiêm trọng cho việc trồng lúa Nấm đạo ôn xem mơ hình chuẩn nghiên cứu tương tác nấm bệnh trồng (Talbot, 2003; Hà Viết Cường cộng sự, 2015) Nấm M.oryzae công lúa tất giai đoạn phát triển gây nhiễm lá, thân, nốt thân cổ công cụ xâm nhiễm bào tử, giác bám cọc xâm nhiễm để công tế bào lúa nhằm lấy chất dinh dưỡng cho tồn phát triển nấm đạo ôn (Howard cộng sự, 1991) Việc xác định diện M.oryzae gây bệnh lúa thường khó khăn thời gian tùy thuộc vào kinh nghiệm chuyên gia, điều kiện mẫu, vết bệnh quan sát diện đồng thời nhiều tác nhân nấm gây bệnh khác mẫu Các quy trình phát M.oryzae dùng theo phương pháp truyền thống thông qua việc lấy mẫu nhiễm, ủ 24 tiếng đồng hồ quan sát hình thái bào tử nấm đạo ơn xuất Tuy nhiên phương pháp đòi hỏi nhiều thời gian cơng sức Việc phát bệnh thực đồng ruộng theo phương pháp quan sát điều tra tỷ lệ bệnh, số bệnh Phương pháp xác vết bệnh hình thành rõ lúa, mức độ bệnh lan rộng gây thiệt hại rõ rệt đồng ruộng Do cơng tác phát kịp thời xác diện M.oryzae lúa giúp ích nhiều việc đưa biện pháp phòng trị sớm, kịp thời hiệu Ngày nay, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) xem phương pháp phổ thông thông dụng việc phát xác định tác nhân gây bệnh trồng kết đáng tin cậy, tiết kiệm thời gian so với phương pháp truyền thống tính 105 xác cao (Barros cộng sự, 2001; Beretta cộng sự, 1997; Chiocchetti cộng sự, 1999; Errampalli cộng sự, 2001; Kerkoud cộng sự, 2002; Larsen cộng sự, 2002; Oliveira Vallim, 2002; Pooler Hartung, 1995) Một ưu điểm phương pháp PCR so với phương pháp phát bệnh truyền thống khả tìm tác nhân gây bệnh trồng giai đoạn đầu nhiễm bệnh mà với phương pháp truyền thống dễ nhầm lẫn với tác nhân gây bệnh khác Chính nghiên cứu cặp mồi Pot2 transposon vốn biết diện nịi đạo ơn khác sử dụng để phát triển phương pháp PCR phát xác M.oryzae lúa (Kachroo cộng sự, 1994) Quy trình PCR tiến hành đánh giá nhằm phát M.oryzae lúa nhiễm bệnh cách nhanh chóng xác Phương pháp nghiên cứu 2.1 Chủng nấm, môi trường nuôi cấy Các mẫu nấm bệnh dùng nghiên cứu phân lập từ mẫu lúa nhiễm bệnh đạo ôn Đồng Nai, Tiền Giang theo phương pháp với số thay đổi mô tả trước (Harmon cộng sự, 2003) Những mẫu giữ môi trường PDA (potato dextrose agar) nhiều tháng Mẫu nấm nuôi cấy 100 ml môi trường CM lỏng (0,3% casamino acids, 0,3% yeast extract, 0,5% sucrose) 260C cho việc chiết xuất DNA tổng số 2.2 Kích hoạt hình thành bào tử nấm Kích hoạt hình thành bào tử nấm thực theo hướng dẫn nghiên cứu trước (Nguyen cộng sự, 2008) Tóm tắt phương pháp sau: Mẫu nấm phân lập nuôi môi trường oat meal agar (OMA) nhiệt độ 250C thời gian ngày Các sợi nấm loại bỏ cách chà sát bề mặt mơi trường ni cấy bơng gịn tiệt trùng với nước cất giữ mẫu nhiệt độ 250C hai ngày đèn UV chuyên biệt Bào tử đươc thu cách thêm nước cất vào môi trường nuôi cấy, chà sát bề mặt bơng gịn 106 KỸ THUẬT – CÔNG NGHỆ tiệt trùng lọc giấy kimwipe Việc đếm quan sát bào tử thực buồng đếm tế bào chuyên biệt kính hiển vi 2.3 Chiết xuất genomic DNA từ mẫu nấm đạo ôn mẫu lúa biểu triệu chứng bệnh đạo ôn Genomic DNA chiết xuất tinh từ mẫu nấm đạo ôn nấm gây bệnh khác lúa dùng làm đối chứng Cho khoảng 100 mg bột sợi nấm sau nghiền nitơ lỏng vào ống eppendorf 1,5 ml 700µL dung dịch lysis buffer (50mM Tris HCl + 50mM EDTA +3% SDS+ 1% βmercaptoethanol) cho vào ống, ủ qua đêm nhiệt độ 650C Ống đựng mẫu ly tâm 13,000 vòng/phút thời gian 10 phút Thu hồi phần dung dịch phía cho vào ống eppendorf 1,5 ml loại bỏ phần cặn Các tạp chất mẫu chiết xuất loại bỏ cách thêm 700 µl phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1 v/v/v), lắc ống ly tâm với vận tốc 13,000 vòng/phút thời gian 10 phút Phần dịch thu tiếp tục rửa chloroform theo tỷ lệ thể tích (1:1 v/v) ly tâm với thông số bước Lắng tủa DNA phương pháp ethanol (cho tỷ lệ 1/10 thể tích mẫu DNA dung dịch 3M sodium acetate, pH 5.2 lần thể tích mẫu DNA dung dịch 100% ethanol, sau ủ mẫu -200C tiếng đồng hồ ly tâm tốc độ 15,000 vòng/phút thời gian 20 phút) Loại bỏ dung dịch phía rửa kết tủa ethanol 70%, ly tâm mẫu tốc độ 15,000 vòng/phút thời gian phút, loại bỏ dung dịch phía trên, làm khơ cặn hịa tan DNA 100µl TE buffer Genomic DNA mẫu nấm bệnh chạy điện di kiểm tra trước thực phản ứng PCR Genomic DNA mẫu lá, cổ lúa nhiễm đạo ôn ly trích GeneJET Plant Genomic DNA purification kit (Cat#K0791, Thermo) theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.4 Khuếch đại PCR phát nấm đạo ơn Trình tự đoạn mồi nghiên cứu (Pot2-F: 5’ CGTCACACGTTCTTCAACC 3’ Pot2-R: 5’ CGTTTCACGCTTCTCCG 3’) sử dụng để khuếch đại vùng có chiều dài 687 bp Pot2 transposon (Harmon cộng sự, 2003) Phản ứng PCR thực 50µl hỗn hợp phản ứng/mẫu với DNA Taq polymerase (Cat#200403, Qiagen) genomic DNA từ mẫu nấm lá, cổ nhiễm đạo ôn thông qua máy khuếch đại DNA (Model Nexus Cycler, Eppendorf) Thành phần phản ứng PCR sau (25 µl Toptaq Master Mix; 0,2 µM cho đoạn mồi, < µg mẫu DNA điều chỉnh nước cất khử trùng RNase/DNase lên đến 50 µl) Chu trình phản ứng PCR thực sau: Bước khởi đầu: 940C phút; Bước biến tính: 940C 30 giây; Bước gắn mồi: 530C 30 giây; Bước kéo dài: 720C phút; số lần lặp lại từ bước đến bước 35; bước kéo dài cuối cùng: 720C 10 phút Dừng phản ứng giữ mẫu nhiệt độ 40C Sản phẩm PCR nhuộm thuốc nhuộm DNA (Cat# PCR-255-bl, Jena Bioscience) điện di 1% gel agarose Các vạch DNA gel quan sát đèn UV máy chụp ảnh gel chuyên dụng (UVP Biodoc-It Imaging system, Hoa Kỳ) Các vạch DNA sản phẩm PCR mong đợi tinh GeneJET Gel Extraction Kit (Cat#K0691, Thermo) gửi giải trình tự để xác định nấm gây bệnh đạo ôn nhiễm bệnh công cụ tin sinh học BLAST Kết thảo luận 3.1 Phân lập xác định nấm gây bệnh đạo ôn, M.oryzae quan sát hình thái bào tử Từ nguồn mẫu lúa biểu nhiễm bệnh đạo ơn, mẫu nấm bao gồm mẫu phân lập từ mẫu phân lập từ cổ sử dụng để tiến hành quan sát đặc điểm hình thái cấu trúc xâm nhiễm chuyên biệt nấm M.oryzae Khả hình thành cấu trúc xâm nhiễm nấm đạo ôn bao gồm số lượng bào tử, tỉ lệ nảy mầm hình thành giác bám yếu tố quan trọng đánh giá khả gây bệnh nấm đạo ơn TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ (49) 2016 trồng Trong thí nghiệm hình thái bào tử tất mẫu nấm phân lập quan sát sau cấy nấm mơi trường OMA kích thích sản sinh bào tử bước sóng khoảng 300-400 nm đèn UV chuyên biệt Kết cho thấy có nhiều hình dạng bào tử khác từ mẫu nấm phân lập (không thể kết quả) Sự đa dạng hình thái bào tử nhiễm bệnh đạo ơn khơng có diện M oryzae mà nhiều nấm gây bệnh khác có triệu chứng gây bệnh lúa giống đạo ơn Curvularia luneta, Bipolaris oryzae Tuy nhiên, hai mẫu nấm mẫu phân lập từ nhiễm Đồng Nai (LĐN) cổ nhiễm Tiền Giang (CBTG) có hình thái bào tử giống nấm đạo ơn với hình dạng bầu dục thn dài có hai vách ngăn đặc trưng (Hình 1) Để tìm hiểu khả hình thành cấu trúc xâm nhiễm, bào tử LĐN CBTG nhỏ lam kính làm bề mặt nhân tạo ủ môi trường tối, ẩm Kết sau giờ, 107 95% bào tử nảy mầm 80% số bào tử nảy mầm hình thành giác bám bề mặt nhân tạo quan sát hai mẫu nấm (Hình 2) Trong thí nghiệm chúng tơi sử dụng kính lam bề mặt nhân tạo để quan sát khả hình thành giác bám (appresoria) bào tử nấm đạo ôn nên tỉ lệ hình thành giác bám thấp so với bề mặt nhân tạo gần giống với trực tiếp nghiên cứu trước Tuy nhiên với tỉ lệ quan sát chúng tơi kết luận sức sống hai mẫu nấm khả gây bệnh cấu trúc xâm nhiễm chúng mạnh Dựa kết hình thái hai mẫu nấm LĐN CBTG kết luận chúng nấm đạo ôn, M oryzae Phát giúp ích nhiều thí nghiệm sau liên quan đến khả lây bệnh chúng trình lây bệnh trồng hay làm nguồn vật liệu cho việc nghiên cứu sâu phân tích chức gen gây bệnh mức độ tồn hệ gen nấm đạo ơn Hình Hình thái bào tử hai mẫu nấm phân lập từ cổ biểu triệu chứng bệnh đạo ơn Bào tử hai mẫu nấm có dạng bầu dục thuôn dài với hai vách ngăn đặc trưng nấm đạo ôn, Magnaporthe oryzae LĐN: mẫu nấm phân lập từ lúa nhiễm đạo ôn Đồng Nai CBTG: mẫu nấm phân lập từ cổ lúa nhiễm đạo ơn Tiền Giang Hình Sự hình thành cấu trúc xâm nhiễm mẫu nấm đạo ôn phân lập sau thời gian quan sát khác (c) bào tử, (g) nảy mầm, (a) giác bám (appressorium) 108 KỸ THUẬT – CÔNG NGHỆ 3.2 Xác định nấm gây bệnh đạo ôn lúa, M oryzae phương pháp PCR Để khẳng định thêm hai mẫu nấm phân lập có phải nấm gây bệnh đạo ôn lúa, M.oryzae hay không, phương pháp PCR sử dụng với cặp mồi Pot2 transposon nghiên cứu chủng nấm M.oryzae gây bệnh đạo ơn lồi cỏ chùm trước (Harmon cộng sự, 2003; Kachroovà cộng sự, 2000) Pot2 yếu tố nhảy đảo ngược có tính lặp lại (inverse repeat transposon) đoạn mồi dùng nghiên cứu khuếch đại đoạn DNA có chiều dài 687 bp nằm vùng từ vị trí 1055 đến 1741 tổng số 1861 bp Pot2 transposon Trình tự đoạn DNA khuếch đại khơng tìm thấy tương đồng chủng nấm khác (Harmon cộng sự, 2003) Trong nghiên cứu này, hai mẫu nấm phân lập từ nhiễm bệnh đạo ôn (LĐN) cổ nhiễm bệnh đạo ôn (CBTG) nuôi môi trường CM lỏng sau chiết suất genomic DNA làm nguồn vật liệu cho PCR trình bày phần phương pháp thí nghiệm Để đánh giá thêm khả ứng dụng PCR việc giám định nấm đạo ôn đồng ruộng, hai mẫu nhiễm bệnh bao gồm nhiễm đạo ôn (LN) cổ nhiễm đạo ôn (CBN) thu thập đồng ruộng chiết xuất genomic DNA trình bày Để đánh giá tính chuyên biệt cặp mồi Pot2 transposon việc phát M oryzae, hai mẫu nấm có hình thái bào tử khác biệt so với bào tử nấm đạo ôn (nấm 1, nấm 2) sử dụng mẫu đối chứng trình tự amplicon tranposon mô tả tương đồng cao nấm đạo ôn không cao mẫu nấm khác khả motif bắt cặp hệ gen nấm đạo ôn chuyên biệt (Harmon cộng sự, 2003) Dựa phân tích hình thái nấm nấm Curvularia lunata and Fusarium spp Kết hình cho thấy giếng tương ứng với mẫu genomic DNA từ chủng nấm đạo ôn LĐN, CBTG tham gia phản ứng PCR với cặp mồi Pot2 cho sản phẩm khuếch đại với giá trị vạch khuếch đại khoảng gần 00 bp Mẫu LN CBN (tương ứng giếng 5) nhiễm nấm đạo ôn cho sản phẩm khuếch đại PCR với kích thước tương tự hai mẫu nấm đạo ơn Điều cho thấy có diện nấm đạo ôn mẫu cổ bị nhiễm Riêng mẫu genomic DNA nấm nấm (tương ứng với giếng 7) mẫu nấm khơng phải nấm đạo ơn kết PCR khơng có sản phẩm khuếch đại dùng đoạn mồi Pot2 transposon Kết giải trình tự hai chiều DNA sản phẩm PCR cặp mồi Pot2 transposon so sánh với liệu gen NCBI công cụ BLAST nucleotide trình tự DNA sản phẩm PCR mẫu nấm phân lập từ lá, cổ lúa mẫu lá, cổ nhiễm đạo ôn Pot2 transposon M oryzae (Hình 4) Điều cho thấy tính chuyên biệt Pot2 transposon việc xác định nấm gây bệnh đạo ơn việc chẩn đốn bệnh đạo ôn đồng ruộng Độ tin cậy quy trình kiểm chứng số chủng nấm đạo ôn phân lập từ cổ lúa nhiễm miền Nam, miền Trung miền Bắc Việt Nam Sự diện sản phẩm PCR Pot2 tranposon từ mẫu nấm phân lập giúp kết luận chúng nấm gây bệnh đạo ơn lúa, M.oryzae TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ (49) 2016 109 Hình Tính chuyên biệt cặp mồi Pot2 tranposon việc xác định nấm gây bệnh đạo ôn chẩn đốn bệnh đạo ơn đồng ruộng LD1kb: HyperLadderTM kb (Bioline, Hoa Kỳ); LĐN: mẫu nấm chiết xuất từ biểu triệu chứng đạo ôn thu Đồng Nai; CBTG: mẫu nấm chiết xuất từ cổ biểu triệu chứng đạo ôn thu Tiền Giang; LN: Lá lúa biểu triệu chứng bệnh đạo ôn; CBN: Cổ lúa biểu triệu chứng bệnh đạo ôn; MN1: mẫu nấm bệnh cây1; MN2: mẫu nấm bệnh 2; -PCR: Đối chứng âm (sử dụng nước) (A) (B) Hình Kết BLAST trình tự DNA sản phẩm PCR cặp mồi Pot2 transposon mẫu nấm đạo ôn phân lập từ lúa lúa biểu triệu chứng bệnh đạo ôn sở liệu DNA NCBI (A) Kết BLAST trình tự sản phẩm PCR mẫu nấm phân lập từ lúa nhiễm bệnh Đồng Nai (LĐN) (B) Kết BLAST trình tự sản phẩm PCR mẫu lúa nhiễm bệnh đạo ôn (LN) Kết luận Việc phân lập xác định nấm gây bệnh đạo ôn phương pháp PCR có ý nghĩa lớn khơng việc phát nhanh, kịp thời bệnh đạo ôn lúa mà giúp giảm nhiều thời gian công sức việc xác định nấm đạo ôn Nếu so với phương pháp truyền thống vốn từ đến ngày để quan sát xuất bào tử M oryzae kính hiển vi phương pháp tiếng đồng hồ từ khâu chiết xuất nhanh DNA, phản ứng PCR, điện di chụp ảnh 110 KỸ THUẬT – CÔNG NGHỆ gel mà khơng cần phải giải trình tự sản phẩm vạch DNA tính chun biệt cặp mồi Pot2 transposon Việc phát nhanh sớm bệnh đạo ôn đồng ruộng giúp giảm chi phí việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có biện pháp phòng trừ bệnh kịp thời Phương pháp giảm nhiều cơng sức lao động phịng thí nghiệm tăng tính xác thí nghiệm định danh nấm bệnh đạo ôn Kết nghiên cứu khẳng định thêm PCR cơng cụ chẩn đốn tác nhân gây bệnh xác mang tính ứng dụng rộng rãi Lời cảm ơn Bài báo nghiên cứu hỗ trợ từ kinh phí đề tài sinh viên Đại học Nơng Lâm TP.Hồ Chí Minh với mã số: CS – SV13 – NL – 06 Tài liệu tham khảo Barros TSL, Davis RE, Resende RO, Dally EL (2001) Design of a polymerase chain reaction for specific detection of corn stunt spiroplasma Plant Disease, 85, 475-480 Beretta MJG, Barthe GA, Ceccardi TL, Lee RF, Derrick KS (1997) A survey for strains of Xylella fastidiosa in citrus affected by citrus variegated chlorosis and cit- rus blight in Brazil Plant Disease, 81, 1196-1198 Chiocchetti A, Bernardo I, Daboussi MJ, Garibaldi A, Gullino ML, Langin T, Migheli Q (1999) Detection of Fusarium ox- ysporum f sp dianthi in carnation tissue by PCR amplification of transposon insertions Phytopathology, 89, 1169-1175 Errampalli D, Saunders J, Cullen D (2001) A PCR-based method for detection of potato pathogen, Helminthosporium solani, in silver scurf infected tuber tissue and soils J Microbiol Methods, 44, 59-68 Hà Viết Cường, Nguyễn Văn Viên, Trần Ngọc Tiệp, Hà Giang, Trần Thị Như Hoa, Nguyễn Đức Huy (2015) Đánh giá đa dạng nấm đạo ôn lúa (Pyricularia oryzae) đồng song cửu long kỹ thuật REP-PCR Tạp chí khoa học phát triển, 13(7), 1061-1069 Harmon PF, Dunkle LD, Latin R (2003) A rapid PCR based method for the detection of Magnaporthe oryzae from infected perennial ryegrass Plant Disease, 87(9), 1072-1076 Howard RJ, Ferrari MA, Roach DH, Money NP (1991) Penetration of hard substrates by a fungus employing enormous turgor pressure Proc Natl Acad Sci USA, 88, 11281–11284 Kachroo P, Leong SA, Chattoo BB (1994) Pot2, an inverted repeat transposon from the rice blast fungus Magnaporthe grisea Mol Gen Genet, 245, 339-348 Kerkoud M, Manceau C, Paulin JP (2002) Rapid diagnosis of Pseudomonas syringae pv papulans, the causal agent of blister spot of apple, by polymerase chain reaction using specifically designed hrpL gene primers Phytopathology, 92, 1077-1083 Larsen RC, Hollingsworth CR, Vandemark GJ, Gritsenko MA, Gray FA (2002) A rapid method using PCR-based SCAR markers for the detection and identifi- cation of Phoma sclerotioides: The cause of brown root rot disease of alfalfa Plant Disease, 86, 928-932 Nguyen QB, Kadotani N, Kasahara S, Tosa Y, Mayama S, Nakayashiki H (2008) Systemic functional analysis of calcium signaling proteins in the genome of the rice blast fungus, Magnaporthe oryzae, using a highthroughput RNA silencing system Mol Microbiol, 68, 1348-1365 Oliveira AC, Vallim MA (2002) Quantification of Xylella fastidiosa from cit- rus trees by real-time polymerase chain reaction assay Phytopathology, 92, 1048-1054 Pooler MR, Hartung JS (1995) Spe- cific PCR detection and identification of Xy- lella fastidiosa strains causing citrus varie - gated chlorosis Curr Microbiol, 31, 377-381 Talbot NJ (2003) On the trail of a cereal killer: Exploring the biology of Magnaporthe grisea Annu Rev Microbiol, 57, 177–202  ... NGHỆ 3.2 Xác định nấm gây bệnh đạo ôn lúa, M oryzae phương pháp PCR Để khẳng định thêm hai mẫu nấm phân lập có phải nấm gây bệnh đạo ơn lúa, M .oryzae hay không, phương pháp PCR sử dụng với cặp... triệu chứng đạo ôn thu Tiền Giang; LN: Lá lúa biểu triệu chứng bệnh đạo ôn; CBN: Cổ lúa biểu triệu chứng bệnh đạo ôn; MN1: mẫu nấm bệnh cây1; MN2: mẫu nấm bệnh 2; -PCR: Đối chứng âm (sử dụng nước)... trình tự sản phẩm PCR mẫu lúa nhiễm bệnh đạo ôn (LN) Kết luận Việc phân lập xác định nấm gây bệnh đạo ơn phương pháp PCR có ý nghĩa lớn không việc phát nhanh, kịp thời bệnh đạo ơn lúa mà cịn