Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây mật nhân (eurycoma longifolia jack) và đánh giá khả năng tích lũy hợp chất eurycomanone, hoạt tính kháng khuẩn của chúng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG _ NGUYỄN THỊ NHƢ TÌNH NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY TẾ BÀO CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY HỢP CHẤT EURYCOMANONE, HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CHÚNG ĐÀ NẴNG – NĂM 2016 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG _ NGUYỄN THỊ NHƢ TÌNH NGHIÊN CỨU NI CẤY TẾ BÀO CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY HỢP CHẤT EURYCOMANONE, HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CHÚNG NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: TS VÕ CHÂU TUẤN ĐÀ NẴNG – NĂM 2016 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực, khách quan chưa cơng bố cơng trình khác Đà Nẵng, tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thị Như Tình LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực khố luận tốt nghiệp này, tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô môn Công nghệ sinh học, khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Võ Châu Tuấn - thầy giáo tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình tơi thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Trần Quang Dần, người giúp đỡ nhiều việc trau dồi kiến thức kĩ thực hành thí nghiệm suốt q trình tơi thực đề tài khố luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, bạn bè ln động viên, khích lệ tơi vật chất lẫn tinh thần để tơi đạt kết tốt Xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thị Như Tình MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Nuôi cấy in vitro tế bào thực vật 1.1.1 Nuôi cấy callus 1.1.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật 1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật 1.1.3.1 Môi trường nuôi cấy 1.1.3.2 Điều kiện nuôi cấy 1.1.4 Những nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật 1.1.4.1 Những nghiên cứu nước 1.1.4.2 Những nghiên cứu nước 11 1.1.5 Những nghiên cứu khả kháng khuẩn hợp chất từ thực vật 13 1.2 Giới thiệu mật nhân 15 1.2.1 Đặc điểm hình thái 15 1.2.2 Phân bố .15 1.2.3 Thành phần hóa học 15 1.2.4 Tác dụng dược lý 16 1.2.5 Các nghiên cứu đối tượng 16 Chƣơng :ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu .19 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy callus 20 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào mật nhân 21 2.2.2.1 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh trưởng tế bào mật nhân 21 2.2.2.2 Ảnh hưởng sucrose lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân .21 2.2.2.3 Ảnh hưởng chất ĐHST lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân 21 2.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng Eucorymanone tế bào mật nhân nuôi cấy in vitro 22 2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết tế bào mật nhân .22 2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 23 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh trưởng tế bào mật nhân 24 3.2 Ảnh hưởng sucrose đến khả sinh trưởng tế bào mật nhân 25 3.3 Ảnh hưởng chất ĐHST lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân nuôi cấy huyền phù 27 3.4 Hàm lượng Eurycomanone tế bào mật nhân nuôi cấy in vitro 30 3.5 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết tế bào mật nhân .33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 Kết luận 36 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO .37 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid ABA : abscisic acid BA : 6-benzyl adenine BAP : 6-benzyl amino purine cs : cộng ĐHST : điều hòa sinh trưởng GA : gibberellin acid GAE : gallic acid equivalents HPLC : high performance liquid chromatography (sắc kí cao áp) IAA : indolacetic acid IBA : indole 3-butyric acid KIN : kinetin (6-furfuryl aminopurine) L : lít LB : Lauria Betan MS : Murashige Skoog (1962) NAA : α-nathyl acetic acid NXB : Nhà xuất DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 2.1 Cây mật nhân in vitro 19 2.2 Tế bào callus tạo từ rễ mật nhân in vitro 19 2.3 Sơ đồ thí nghiệm 20 3.1 Đường cong sinh trưởng tế bào mật nhân 28 3.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào mật nhân 29 Sinh khối tươi (a) sinh khối khô (b) tế bào huyền phù 3.3 nuôi cấy môi trường MS bổ sung mg/L NAA mg/L 30 KIN 3.4 Phổ HPLC eurycomanone chuẩn (0,01 mg/ml) 32 3.5 Phổ HPLC eurycomanone sau 15ngày nuôi cấy 32 3.6 Khả kháng khuẩn dịch chiết mật nhân vi khuẩn 33 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 Tên bảng Ảnh hưởng tốc độ lắc lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân Ảnh hưởng nồng độ sucrose lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân Ảnh hưởng NAA KIN lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân Hàm lượng eurycomanone tế bào mật nhân sau 15 ngày nuôi cấy Khả kháng khuẩn dịch chiết tế bào mật nhân Trang 24 25 27 31 32 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Trải qua nhiều kỷ, người nhận thấy vai trò quan trọng thực vật đời sống Thực vật giúp cân khơng khí, cung cấp thức ăn…Đặc biệt, thực vật cịn sản xuất lượng lớn chất hữu mà có số chất khơng tham gia trực tiếp vào trình sinh trưởng phát triển cây, chất xem nguồn nguyên liệu hữu dụng y học gọi sản phẩm thứ cấp Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có đến 80% dân số giới sử dụng thảo dược làm thuốc để chữa bệnh chăm sóc sức khỏe Việc khai thác nguồn dược liệu tự nhiên từ thực vật trở thành vấn đề quan trọng mang tính tồn cầu chúng ngày thương mại hóa nhiều Tuy nhiên, vấn đề đặt nơi sống tự nhiên thuốc bị biến nhanh chóng nhiều yếu tố như: biến đổi khí hậu tồn cầu, khai thác bừa bãi người…Vì việc trồng theo phương pháp truyền thống để sản xuất hợp chất hóa học có nhiều hạn chế khó đáp ứng đủ nhu cầu dược liệu ngày tăng tương lai [78] Công nghệ nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật xem đường hữu hiệu để sản xuất hợp chất thứ cấp phục vụ cho công nghiệp dược phẩm Ưu điểm nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật sản xuất lượng sinh khối lớn thời gian ngắn, tạo nguồn nguyên liệu ổn định phục vụ chiết tách hoạt chất sinh học quy mô cơng nghiệp, góp phần giải khó khăn nguồn dược liệu tự nhiên [3] Đến nay, người ta thành công sản xuất nhiều loại hợp chất có giá trị theo phương thức quy mô lớn anthraquinone Rubia aknane, vincristine dừa cạn (Catharanthus roseus), berberin Coscinium fenustratum, diosgenin Dioscorea doryphora, ginsenoside loài thuộc chi Panax [74] Cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) dược liệu biết đến nhiều nước châu Á Nhiều nghiên cứu cho thấy, phận giàu hợp chất có hoạt tính sinh học eurycomaoside, eurycolactone, 32 Thời gian lưu (phút) Hình 3.4 Phổ HPLC eurycomanone chuẩn Thời gian lưu (phút) Hình 3.5 Phổ HPLC eurycomanone sau 15 ngày ni cấy 33 3.5 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết tế bào mật nhân Bảng 3.5 Khả kháng khuẩn dịch chiết tế bào mật nhân Đƣờng kính vịng vơ khuẩn D-d (mm) Vi khuẩn Dịch chiết tế bào huyền Dịch chiết rễ mật nhân tự phù nhiên Bacillus subtilis 30 24 Escherichia coli 0 Kết trình bày bảng 3.5 cho thấy, dịch chiết tách từ tế bào rễ mật nhân tự nhiên có khả ức chế sinh trưởng Bacillus subtilis không ức chế sinh trưởng chủng Escherichia coli.Ta thấy rằng, dịch chiết thu từ tế bào mật nhân có khả ức chế sinh trưởng chủng B.subtilis mạnh so với dịch chiết từ rễ tự nhiên Trong đó, dịch chiết tế bào gây ức chế mạnh với B.subtilis thể qua đường kính vơ khuẩn 30mm hàm lượng dịch chiết 70 µl A B Hình 3.6 Khả kháng khuẩn dịch chiết tế bào mật nhân vi khuẩn (A) Vi khuẩn Bacillus subtilis (B) Vi khuẩn Escherichia coli a: Dịch chiết tế bào nuôi cấy huyền phù bình tam giác b: Dịch chiết rễ mật nhân ngồi tự nhiên 34 Theo kết nghiên cứu, B.subtilis (vi khuẩn gram dương) nhạy cảm với hoạt tính dịch chiết mật nhân so với E.coli (vi khuẩn gram âm) Điều khác cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Gram âm Gram dương Vi khuẩn Gram âm có lớp màng bao quanh thành tế bào, lớp ngăn cản khuếch tán dịch chiết thông qua lớp chất lipopolysaccharide (LPS) Ngược lại, vi khuẩn Gram dương khơng có lớp màng nhày nên dịch chiết tiếp xúc trực tiếp với lớp LPS thành tế bào vi khuẩn, làm tăng khả thấm ion, thất thoát hợp chất nội bào làm suy yếu hệ thống enzyme vi khuẩn (Cowan, 1999; Wendakoon Sakaguchi, 1995) Trên đối tượng mật nhân, có số cơng trình nghiên cứu khả kháng khuẩn Nghiên cứu Faisal cs (2015) khả kháng khuẩn từ dịch chiết ethanol rễ mật nhân tự nhiên loài vi khuẩn gram âm vi khuẩn gram dương Nghiên cứu cho thấy, dịch chiết từ rễ mật nhân tự nhiên nồng độ 150mg/ml tác dụng ức chế với Escherichia coli có tác dụng ức chế số vi khuẩn , tác dụng ức chế mạnh Salmonella typhi (đường kính vịng vơ khuẩn 14,33 mm), Bacillus cereus (đường kính vơ khuẩn 11,67 mm), Staphylococcus aureus (đường kính vơ khuẩn 10,67 mm) [33] Farouk Benafri (2007) nghiên cứu khả kháng khuẩn từ dịch chiết methanol, ethanol, acetone nước cất từ phận khác mật nhân tự nhiên (lá, thân rễ) loài vi khuẩn gram âm vi khuẩn gram dương cho thấy, dịch chiết dung môi cồn, acetone thân có khả kháng khuẩn vi khuẩn gram dương gram âm, ngoại trừ chủng vi khuẩn gram âm (Escherichia coli Salmonella typhi); dịch chiết từ rễ khơng có khả ức chế sinh trưởng vi khuẩn gram dương gram âm; dịch chiết từ dung mơi nước cất cho thấy có hoạt tính ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus Serratia marscesens [35] Khả kháng khuẩn tìm thấy dịch chiết từ số thuốc khác Philip cs (1989) nghiên cứu khả kháng khuẩn 32 loại dịch chiết từ loài dược liệu thuốc cố truyền Malaysia nhận thấy dịch chiết củ nghệ đen ức chế sinh trưởng loài vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, S 35 aureus, Bacillus Subtilis không ức chế sinh trưởng vi khuẩn E.coli [62] Nghiên cứu Jigna Sumitra (2007) hoạt tính kháng khuẩn đinh lăng (Woodfordia fruticosa) cho thấy rằng, dịch chiết từ methanol đinh lăng ức chế số chủng vi khuẩn, hoạt tính ức chế mạnh P.pseudoalcaligenes so với vi sinh vật thử nghiệm [43] Tóm lại, kết cho thấy, dịch chiết từ tế bào rễ mật nhân ngồi tự nhiên có khả ức chế sinh trưởng B subtilis khơng có khả ức chế E.coli 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu, rút số kết luận sau: - Mơi trường MS có 3% sucrose, bổ sung 2,0 mg/L NAA 2,0 mg/L KIN, tốc độ lắc 120 vịng/phút thích hợp cho sinh trưởng tế bào mật nhân nuôi cấy huyền phù Sinh khối tươi đạt cao 32,2 g (0,89 g khô), gấp 10,74 lần so với lượng sinh khối ban đầu sau 15 ngày nuôi cấy - Có diện eurycomanone ni cấy huyến phù tế bào mật nhân Hàm lượng eurycomanone tế bào đạt 0,0125% khối lượng khô sau 15 ngày nuôi cấy - Dịch chiết từ tế bào mật nhân ni cấy huyền phù từ rễ mật nhân ngồi tự nhiên có khả ức chế sinh trưởng lồi vi khuẩn Bacillus subtilis, khơng có khả ức chế sinh trưởng loài vi khuẩn Escherichia coli Khả ức chế vi khuẩn dịch chiết tế bào mật nhân nuôi cấy huyền phù cao dịch chiết rễ mật nhân tự nhiên Đề nghị Cần tiếp tục nghiên cứu số vấn đề sau: - Nghiên cứu khả tích lũy hợp chất có hoạt tính sinh học tế bào mật nhân theo giai đoạn sinh trưởng khác - Nghiên cứu thành phần hoạt tính dịch chiết từ tế bào mật nhân nuôi cấy huyền phù - Tiến hành nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tế bào mật nhân quy mô lớn hệ lên men (Bioreactor) 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thi Muội (1997), Công nghệ sinh học cải tiến giống trồng, Nxb Nông nghiệp Hà Nội [2] Lê Hồng Giang Nguyễn Bảo Tồn (2011), “Sự hình thành mơ sẹo, phôi mỏ quạ in vitro (Dischidia rafflesiana Wall.)”, Tạp chí Khoa học, 20a, tr 61-67 [3] Phạm Thị Như Hồng (2006), Khảo sát thành phần hóa học bá bệnh Eurycoma longifolia Jack họ thất Simarubaceae, Luận văn thạc sỹ, Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Thành phố HCM [4] Huỳnh Văn Kiệt, Cao Đăng Nguyên, Nguyễn Hoàng Lộc (2005), “Ảnh hưởng số chất kích thích sinh trưởng lên tái sinh in vitro cà gai leo (Solanum hainanense)”, Báo cáo Khoa học Hội nghị toàn quốc, tr 602-605 [5] Bùi Văn Lệ Nguyễn Ngọc Hồng, 2006 “Ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào Dừa cạn (Catharanthus Roseus)”, Tạp chí phát triển Khoa học Công nghệ, 9, tr 59-66 [6] Trần Mỹ Linh, Vũ Hương Giang, Lê Quỳnh Liên, Nguyễn Tường Vân, Ninh Khắc Bản, Châu Văn Minh (2013), “Đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn kiểm định số loài thực vật ngập mặn vườn quốc gia Xuân Thủy, Nam Định”, Tạp chí sinh học, 35(3), tr 342-347 [7] Nguyễn Hồng Lộc (2006), Giáo trình Cơng nghệ tế bào, NXB Đại học Huế [8] Nguyễn Hoàng Lộc, Đồn Hữu Nhật Bình, Phan Đức Lâm, Phan Thị Á Kim, Trương Thị Bích Phượng (2008), “Nghiên cứu khả tích lũy asiaticoside mơ sẹo rau má (Centella asiatica L Urban)”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 6(4B), tr 873-881 [9] Nguyễn Hồng Lộc (2007), Nhập mơn Cơng nghệ sinh học, NXB Đại học Huế [10] Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ tế bào, NXB Đại học quốc gia TPHCM 38 [11] Trần Văn Minh (1994), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Phân viện Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh [12] Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Trịnh Đôn, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Đinh Văn Khiêm, Phan Xuân Huyên (2007), “Nuôi cấy tế bào tái tạo mô sẹo từ huyền phù tế bào thông đỏ Hymalaya (Thơng đỏ Lâm Đồng) (Taxuswallichiana Zucc), Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5(2), pp 243-253 [13] Dương Tấn Nhựt, Lâm Thị Mỹ Hằng, Bùi Thế Vinh, Phan Quốc Tâm, Nguyễn Ba Nam, Nguyễn Cửu Thành Nhân, Hoàng Xuân Chiến, Lê Nữ Minh Thùy, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Văn Bình, Vũ Quốc Luận, Trần Cơng Luận, Đồn Trọng Đức (2010), “Xác định hàm lượng saponin dư lượng số chất điều hòa sinh trưởng callus, chồi rễ sâm Ngọc Linh ni cấy in vitro”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(2), tr 189-202 [14] Quách Ngô Diễm Phương, Hoàng Thị Thanh Minh, Hoàng Thị Thu, Bùi Văn Lệ (2010), “Nuôi cấy mô sẹo dịch huyền phù tế bào Bèo đất Drosera burmani cho mục tiêu thu nhận quinine”, Tạp chí phát triển KH&CN, 13(2) [15] Huỳnh Thị Đan San, Võ Thị Bạch Mai (2009), “Tìm hiểu phát sinh phơi soma từ mơ sẹo Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb) in vitro”, Tạp chí phát triển KH&CN, 12(17) [16] Nguyễn Quang Thạch (2009), Cơ sở công nghệ sinh học - Công nghệ sinh học tế bào, NXB Giáo dục, Hà Nội [17] TS Nguyễn Kim Thanh (2005), Giáo trình sinh lý thực vật, NXB Hà Nội [18] Nguyễn Thị Thơ (2013), Nghiên cứu khả hình thành sinh trưởng callus mật nhân (Eurycoma longifolia Jack), Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng [19] Phạm Thị Mỹ Trâm, Lê Thị Thủy Tiên (2012), “Khảo sát tăng trưởng huyền phù tế bào dâu tây (Flagaria ananassa L.) có khả sinh tổng hợp antocyanin”, Tạp chí phát triển KH-CN, 15(1), tr 69 – 77 39 [20] Võ Châu Tuấn (2014), Nghiên cứu nuôi cấy tế bào nghệ đen (Cucuma zeloaria Roscoe) khảo sát khả tích lũy số hợp chất có hoạt tính sinh học chúng, Luận văn tiến sĩ, Đại học khoa học Huế [21] Nguyễn Văn Uyển (1993), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống rừng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội [22] Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nxb Giao dục, Hà Nội Tiếng Anh [23] Abe T, Futsuhara Y (1985), “Efficient plant regeneration by somatic embryogenesis from root callus tissues of Rice (Oryza sativa L.), Journal of Plant Physiology, 121(2), pp 111-118 [24] Ali M, Abbasi BH, Haq Ihsan-ul (2013), “Production of commercially important secondary metabolites and antioxidant activity in cell suspension cultures of Artemisia absinthium L”, Industrial Crops and Products, 49, pp 400-406 [25] Ang HH, Hitotsuyanagi Y, Fukaya H, Takeya K (2002), “Quassinoids from Eurycoma longifolia”, Phytochemistry, 59, pp 833-837 [26] Bhat R , Karim AA (2010), “Tongkat Ali (Eurycoma longifolia Jack): A review on its ethnobotany and pharmacological importance”, Fitoterapia, 81(7),pp 669-679 [27] Chan KL, Lee S, Sam TW, Han BH (1989), “A quassinoid glycoside from the roots of Eurycoma longifolia”, Phytochemistry, 28, pp 2857-2859 [28] Choi D.S., Andrade M.H.C., Willis L.B., Cho C., Schoenheit J., Boccazzi P.,Sambanthamurthi R., Sinskey A.J., Rha C (2008), “Effect of agitation and aeration on yield optimization of oil palm suspension culture”, Journal of Oil palm Research Special Issue on Malaysia-MIT Biotechnology Partnership Programme, 1, pp 23-34 [29] Chueh FS, Chen CC, Sagare AP, Tsay HS (2011), “Quantitative determination of secoiridoid glucosides in in vitro propagated plants of Gentiana davidii var formosana by high performance liquid 40 chromatography”, Planta Med, 67(1), pp 70-73 [30] Davey MR, Paul A (2010), Plant Cell Culture: Essential Methods, Wiley Blackwell [31] Dix PJ (1990), “Plant Cell Line Selection”, VHC verlasgesellschhft mbH, W Germany [32] Eun Jung Lee, Mohammad Mobin, Eun Joo Haln, Kee Yoeup Paek (2006), “Effects of sucrose, inoculum density, auxins, and aeration volume on cell growth of Gymnema sylvestre”, Journal of Plant Biology, 49(6), pp 427 – 431 [33] Faisal GG, Zakaria SM, Najmuldeen GF (2015), “In vitro Antibacterial activity of Eurycoma longifolia Jack (Tongkat Ali) root extract”, The International Medical Journal Malaysia, 14(1) [34] Farjaminezhad R, Zare N, Zakaria RA, Farjaminezhad M (2013), “Establishment and optimization of cell growth in suspension culture of Papaver bracteatum: a biotechnology approach for thebaine production”, Turkish Journal of Biology, 37, pp 689-697 [35] Farouk AE, Benafri A (2007), “Antibacterial activity of Eurycoma longifolia Jack A Malaysian medicinal plant”, Saudi Med J, 28(9), pp 1422-1424 [36] Flores RG, Martinez RR, Guerra PT, Licea RQ (2012), “Antibacterial activity of Oenothera rosea leaf extracts”, British Journal of Medicine & Medicinal Research, 2(3), pp 396-404 [37] Goh SH (1995), Malaysian Medicinal Plants for the Treatment of Cardiovascular Disease, Pelanduk Publication [38] Goreja WG (2004), Tongkat Ali: The Tree That Cures A Hundred Diseases, Amazing Herb Press, USA [39] Hakkim FL, Kalyani S, Essa M, Girija S, Song H (2011), “Production of rosmarinic in Ocimum sanctum cell cultures by the influence of sucrose, phenylalanine, yeast extract and methyl jasmonate”, International Journal of Biological & Medical Research, 2(4), pp 1070-1074 41 [40] Hegazi GA, Mohammed El-Lamey T (2011), “Callus Induction and Extraction of Edpherine from Edphadra alata Decne Culture”, American Eurasian J Agric & Eviron Sci., 11(1), pp 19-25 [41] Hussain A, Qarshi IA, Nazir Hand Ullah I (2012), Plant tissue culture: Current status and opportunities, Agricultural and Biological Sciences [42] Hussein S, Ibrahim R, Kiong AL, Fadzillah NM and Dauh SK (2005), “Micropropagation of Eurycoma longifolia Jack via formation of Somatic Embryogenesis” , Assian journal of Plant Sciences, 4(5), pp 472-485 [43] Jigna Parekh, Sumitra Chanda (2007), “In vitro antibacterial activity of the crude methanol extract of Woodfordia fruticosa Kurz flower (Lythraceae)”, Brazilian Journal of Microbiology, 38(2) [44] Jiwwajinda S, Santisopasri V, Murakami A, Hirai N, Ohigashi H (2001), “Quassinoids from Eurycoma longifolia as plant growth inhibitors”, Phytochemistry, 58, pp 959-962 [45] Kaisar MA, Rahman MS, Rahman MZ, Hasan CM, Rashid MA (2011), “A review on phytochemicals from some medicinal plants of Bangladesh”, Journal of Pharmacy and nutrition sciences, 1, pp 87-95 [46] Kart – Hermann Neumann, Ashwani Kumar Jafargholi Imani (2009), Plant Cell and Tissue Culture – A Tool in Biotechnology, Springer – Verlag Berlin Heidelberg [47] Kaul B., Stohs S.J Staba E.J (1969), “Dioscorea tissue cultures Influence of various factors on diosgenin production by Dioscorea deltoidea callus and suspension cultures”, Lloydia, 32, pp 347-359 [48] PC, Shi LS, Damu AG, Huang CH, Lin AJ, Bastow KF, Lee KH, (2003), “Cytotoxic and antimalarial beta-carboline alkaloids from the roots of Eurycoma longifolia”, J Nat Prod, 66, pp 1324-1327 [49] Lee Ye – Ji, Thiruvengadam M, Nagella P, Chung III - Min (2013), “Polyphenol composition and antioxidant activity from the vegetable plant Artemisia Absinthium L.”, Australian Journal of Crop Science, 7(12), pp 1921-1926 42 [50] Mitsunaga K, Koike K, Tanaka T, Ohkawa Y, Kobayashi Y, Sawaguchi T and Ohmoto T (1993), “Cathin-6one alkaloids from Eurycoma longifolia”, Phytochemistry, 35, pp 799-802 [51] Moscatiello R, Baldan B and Navazio L (2013), “Plant cell suspension cultures”, Methods in Molecular Biology, 953, pp 77-93 [52] Nagella P., Murthy H.N (2010), “Establishment of cell suspension cultures of Withania somnifera for the production of withanolide A”, Bioresour Technol, 101(17), pp 6735-9 [53] Namdeo AG, Priya R, Bhosale BB (2012), “Micropropagation and production of camptothecin form in vitro plants of Ophiorrhiza mungos”, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2(2), pp 662-666 [54] Narayanaswany S (1994), Plant cell and tissue culture, McGraw – Hill Publishing Company, New Dehli [55] Navia-Osorio A, Garden H, Cusido RM, Palazon J, Alfermann AW, Pinol MT (2002), “Taxol® and baccatin III production in suspension cultures of Taxus baccata and Taxus wallichiana in an airlift bioreactor”, Journal of Plant Physiology, 159(1), pp 97-102 [56] Nguyen Hoang Loc, Nguyen Thi Duy Nhat (2013), “Production of asiaticoside from centella (Centella asiatica L.Urban) cells in bioreactor”, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 3, pp 806-810 [57] Nguyen Trung Thanh, Ha Tuan Anh, Paek Kee Yoeup (2008), “Effects of macro elements on biomass and ginsenoside production in cell suspension culture of Ngoc Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, VNU Journal of Science Natural and Technology, 24(3), pp 248-252 [58] Nguyen Trung Thanh, Nguyen Van Ket, Paek Kee Yoeup (2007), “Effecting of medium composition on biomass and ginsenoside production in cell suspension culture of Panax vietnamensis Ha et Grushv.”, VNU Journal of Science Natural and Technology, 23(3), pp 269-274 [59] Nhut D.T., Tram N.T., Don N.T (2006), “Effect of sucrose, glucose and fructose in proliferation of Hymalaya Yew (Taxus wallichiana Zucc.) cell 43 suspension cultures-a potential source for taxol production”, Pro Int Workshop Biotechnology in Agricut, Nong Lam University, Ho Chi Minh city, Vietnam, pp 142-145 [60] Omar R, Abdullah MA, Hasan MA, Marziah M (2004), “Development of growth medium for Centenlla asiatica cell culture via response surface methodology”, American Applied Sciences, 1(3), pp 215-219 [61] Pavithra PS, Janani VS, Charumathi KH, Indumathy R, Potala S, Verma RS (2010), “Antibacterial activity of plants used in Indian herbal medicine”, International Journal of Green Pharmacy, 4(1), pp 22-28 [62] Philip K., Malek S.N.A., Sani W., Shin S.K., Kumar S.A., Lai H.S., Serm L.G., Rahman S.N.S.A (2009), “Antimicrobial activity of some medicinal plants from Malaysia”, American Journal of Applied Sciences, 6(8), pp 1613-1617 [63] Rahman MA and Bari MA (2013), “Antibacterial Activity of Cell Suspension Cultures of Castor (Ricinus communis L cv Roktima)”, European Journal of Medicinal Plants, 3(1), pp 65-77 [64] Rashid M, Kumar S, Ahmad B (2009), “Medicinal uses of Eurycoma longifolia: a review”, The Pharma Research (T Pharm Res.), pp 70-78 [65] Reibl et al.(2009), Cell and Tissue reaction engineer: Principles and Practice, Springer – Verlag Berlin Heidelberg [66] Rodrigues-Monroy M., Trejo-Espino J.L., Jimenez-Aparicio A., de la Luz M.M., Villarreal M.L., Trejo-Tapia G (2004), “Evaluation of morphological properties of Solanum chrysotrichum cell cultures in a shake flask and fermentor and rheilogical properties of broths”, Food Technol Biotechnol, 42 (3), pp 153-158 [67] Rosli N, Maziah M, Chan KL, Sreeramanan S (2009), “Factors affecting the accumulation of 9-methoxycanthin-6-one in callus cultures of Eurycoma longifolia”, Journal of Forestry Research, 20 (1), pp 54-58 [68] Ruszymah BH, Chowdhury SR, Manan NA, Fong OS, Adenan MI, Saim AB (2012), “Aqueous extract of Centella asiatica promotes corneal epithelium 44 wound healing in vitro”, Journal of Ethnopharmacology, 140 (2), pp 333338 [69] Sakato K, Misawa M (1974), “Effect of chemical and physical conditions on growth of Camptotheca acuminata cell cultures”, Agri Biol Chem, 38, pp 491-497 [70] Sheper T (2001), Advances in biochemical engineering biotechnology-plant cell (Vol 72), Spring-Verlag, Berlin Heideberg [71] Tada H, Yasuda F, Otani K, Doteuchi M, Ishihara Y, Shiro M (1991), “New antiulcer quassinoids from Eurycoma longifolia”, Eur J Medical Chemistry, 26: 345-349 [72] Tal B., Rokem J.S., Goldberg I (1983), “Factors affecting growth and product formation in plant cells grow in continuous culture”, Plant Cell Rep 2, pp 219-222 [73]Tan SH, Musa R, Ariff A, Maziah M (2010), “Effect of Plant Growth regulators on callus, cell suspension and cell line selection for flavonoid production from Pegaga (Centella asiatica L Urban)”, American Journal of Biochemistry and Biotechnology, 6(4), pp 284-299 [74] Thengane SR, Kulkarni DK, Shrikhande VA, Joshi SP, Sonawane KB, Krishnamurthy KV (2003), “Influence of medium composition on callus induction and camptothecin accumulation in Nothapodytes foetida”, Plant cell Tissue and Organ Culture, 72, pp 247-251 [75] Vanisree M., Tsay H.S (2004), “Plant cell cultures-an alternative and efficient source for the production of biologically important secondary metabolites”, Int J Appl Sci Eng, 2, pp 29-48 [76] Yusuf H, Mustofa, Wijayanti MA, Susidarti RA, Asih PBS, Suryawati, Sofia (2013), “A New Quassinoid of Four Isolated Compounds from Extract Eurycoma longifolia Jack Roots and Their In-Vitro Antimalarial Activity”, International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences, pp 2229-3701 45 [77] Zakaria Y, Rahmat A, Pihie AHL, Abdullah NR, Houghton PJ (2009), “Eurycomanone induce apoptosis in HepG2 cells via up-regulation of p53 Cancer Cell Int”, 9(16), pp [78] Zhao J., Verpoorte (2007), “Manipulating indole alkaloid production by Catharanthus roseus cell culture in bioreactors: from biochemical processing to metabolic engineering”, Phytochem Rev 6, pp, 435-437 [79] Ziv M (2000), “Bioreactor technology for plant micropropagation”, Horticultural Review, 24, pp.14-23 46 BẢNG THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG MS Stock MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 Nồng độ Nồng độ Dung tích dùng cho (mg/L) (g/1000 mL) lít mơi trƣờng KNO3 1900 95 KH2PO4 170 8,5 NH4NO3 1650 82,5 MgSO4.7H2O 370 18,5 CaCl2.2H2O 440 44 H3BO3 6,2 0,62 MnSO4.4H2O 22,3 1,69 CoCl2.6H2O 0,025 0,0025 CuSO4.5H2O 0,025 0,0025 ZnSO4.7H2O 8,6 1,06 Na2MoO4.2H2O 0,25 0,025 KI 0,83 0,083 FeSO4.7H2O 27,8 2,78 Na - EDTA 37,3 4,09 Myo - inositol 100 10 Thiamine – HCl 0,1 0,01 0,5 0,05 Nicotinic axit 0,5 0,05 Glycine 0,2 Hóa chất Pyridoxine – HCl 20 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL ... _ NGUYỄN THỊ NHƢ TÌNH NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY TẾ BÀO CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY HỢP CHẤT EURYCOMANONE, HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CHÚNG NGÀNH : CƠNG NGHỆ... nuôi cấy tế bào mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) đánh giá khả tích lũy hợp chất Eurycomanone, hoạt tính kháng khuẩn chúng? ?? Mục tiêu đề tài Xác định điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh trưởng tế. .. nghiên cứu số vấn đề sau: - Nghiên cứu khả tích lũy hợp chất có hoạt tính sinh học tế bào mật nhân theo giai đoạn sinh trưởng khác - Nghiên cứu thành phần hoạt tính dịch chiết từ tế bào mật nhân