Ngày nay, thức ăn không chỉ đảm bảo đủ calo, ngon, sạch, mà còn phải chứa các hoạt chất sinh học tự nhiên cần cho sức khoẻ và sắc đẹp, không chỉ điều khiển được các chức năng hoạt động[r]
(1)ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -
VŨ THỊ HƢƠNG QUỲNH
XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI
RAU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
(2)ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -
VŨ THỊ HƢƠNG QUỲNH
XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ
Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN XUÂN TRUNG
(3)LỜI CẢM ƠN
Lời cho phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Xuân Trung, NCS Vũ Thị Trang giao đề tài, dẫn tận tình tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình làm luận văn
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia , anh chị Khoa chất lượng phụ gia chất hỗ trợ chế biến thực phẩm - Viê ̣n Kiểm nghiê ̣m an toàn vê ̣ sinh thực phẩm Quốc gia đã quan tâm , giúp đỡ, tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu môi trường đại
Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy giảng dạy khoa Hoá, đặc biệt thầy mơn Hố Phân tích cho tơi kiến thức quý giá trình học tập thực đề tài
Cuối cùng, xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình , bạn bè bên cạnh chia sẻ khó khăn , đô ̣ng viên và giúp đỡ ho ̣c tâ ̣p cũng sống
Do thời gian thực hiê ̣n đề tài có ̣n nên không tránh những thiếu sót , rất mong nhâ ̣n được ý kiến đóng góp của thầy cô và các ba ̣n để luận văn hoàn thiện
Hà Nội, ngày 30 tháng 11 năm 2015 Học viên
(4)MỤC LỤC
MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 1.1 Giới thiệu chung anthocyanin Error! Bookmark not defined 1.1.1 Cấu trúc hóa học anthocyanin Error! Bookmark not defined 1.1.2 Tính chất anthocyanin Error! Bookmark not defined 1.1.3 Tác dụng anthocyanin Error! Bookmark not defined 1.1.4 Sự phân bố anthocyanin Error! Bookmark not defined 1.2 Một số phƣơng pháp xác định anthocyanin Error! Bookmark not defined 1.2.1 Phương pháp pH vi sai Error! Bookmark not defined 1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Error! Bookmark not defined
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 2.1 Mục tiêu Error! Bookmark not defined 2.2 Nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.3 Đối tƣợng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.4 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị Error! Bookmark not defined 2.4.1 Chất chuẩn Error! Bookmark not defined 2.4.2 Hoá chất Error! Bookmark not defined 2.4.3 Thiết bị Error! Bookmark not defined 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.6 Thẩm định phƣơng pháp Error! Bookmark not defined CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED
3.1 Tối ƣu điều kiện xác định anthocyanin hệ thống HPLC Error! Bookmark not defined
(5)3.1.4 Chọn thể tích bơm mẫu Error! Bookmark not defined 3.1.5 Khảo sát thành phần pha động Error! Bookmark not defined 3.1.6 Khảo sát nồng độ axit pha động Error! Bookmark not defined 3.1.7 Khảo sát chương trình rửa giải Error! Bookmark not defined 3.1.8 Khảo sát tốc độ pha động Error! Bookmark not defined 3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu Error! Bookmark not defined 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến trình thủy phân Error! Bookmark not defined
3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân Error! Bookmark not defined
3.2.3 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết mẫu Error! Bookmark not defined 3.3 Thẩm định phƣơng pháp phân tích Error! Bookmark not defined 3.3.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc Error! Bookmark not defined 3.3.2 Khoảng tuyến tính Error! Bookmark not defined 3.3.3 Độ lặp lại Error! Bookmark not defined 3.3.4 Độ thu hồi Error! Bookmark not defined 3.4 Ứng dụng phƣơng pháp xác định anthocyanin số rau củ Error! Bookmark not defined
(6)DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Cấu trúc chất phổ biến nhóm anthocyanin Error! Bookmark not defined
Bảng 1.2: Thông tin chung chất nghiên cứu Error! Bookmark not defined Bảng 1.3: Hàm lượng Anthocyanin tổng có số mẫu thực vật Việt Nam [7] Error! Bookmark not defined Bảng 3.1: Ảnh hưởng cột tách đến độ rộng đáy pic (W) thời gian lưu (tR) Error! Bookmark not defined Bảng 3.2: Ảnh hưởng thành phần pha động đến độ rộng đáy pic (W), thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS) del, cya, pel Error! Bookmark not defined Bảng 3.3: Rửa giải chất phân tích theo chế độ đẳng dòng Error! Bookmark not defined
Bảng 3.4: Chương trình gradient Error! Bookmark not defined Bảng 3.5: Chương trình gradient Error! Bookmark not defined Bảng 3.6: Chương trình gradient Error! Bookmark not defined Bảng 3.7: Chương trình gradient Error! Bookmark not defined Bảng 3.8: Ảnh hưởng chương trình gradient đến hệ số đối xứng pic Error! Bookmark not defined
Bảng 3.9: Ảnh hưởng tốc độ dòng đến thơi gian lưu chiều cao pic Error! Bookmark not defined
Bảng 3.10: Hàm lượng chất theo thời gian thủy phân Error! Bookmark not defined
Bảng 3.11: Hàm lượng chất nhiệt độ thủy phân khác Error! Bookmark not defined
Bảng 3.12: Hàm lượng chất tỷ lệ dung môi chiết khác Error! Bookmark not defined
Bảng 3.13: Nồng độ diện tích pic trung bình chất Error! Bookmark not defined
(7)Bảng 3.18: Độ thu hồi mẫu củ dền Error! Bookmark not defined Bảng 3.19: Giới hạn phát giới hạn định lượng chất phân tích Error! Bookmark not defined
(8)DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Cấu trúc aglycon anthocyanin Error! Bookmark not defined Hình 1.2: Sự phụ thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH Error! Bookmark not defined.
Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC Error! Bookmark not defined. Hình 3.1: Phổ hấp thụ delphinidin Error! Bookmark not defined. Hình 3.2: Phổ hấp thụ cyanidin Error! Bookmark not defined. Hình 3.3: Phổ hấp thụ pelargonidin Error! Bookmark not defined. Hình 3.4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn chất với cột sắc kí Error! Bookmark not defined.
Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn chất với cột sắc kí Error! Bookmark not defined.
Hình 3.6: Sắc ký đồ rửa giải anthocyanin với thành phần pha động nước ACN Error! Bookmark not defined. Hình 3.7: Sắc ký đồ del, cya nồng độ axit trifloaxetic khác Error! Bookmark not defined.
Hình 3.8: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient Error! Bookmark not defined. Hình 3.9: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient Error! Bookmark not defined.
Hình 3.10: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient Error! Bookmark not defined.
Hình 3.11: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient Error! Bookmark not defined.
Hình 3.12: Hàm lượng chất thủy phân thời gian khác (60, 90, 120, 150 phút) Error! Bookmark not defined. Hình 3.13: Hàm lượng chất nhiệt độ thủy phân khác Error! Bookmark not defined.
(9)Hình 3.16: Sắc ký đồ mẫu rau không chứa anthocyanin Error! Bookmark not defined.
Hình 3.17: Sắc ký đồ mẫu rau không chứa anthocyanin thêm chuẩn hỗn hợp Error! Bookmark not defined. Hình 3.18: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic nồng độ
delphinidin Error! Bookmark not defined. Hình 3.19: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic nồng độ
cyanidin Error! Bookmark not defined. Hình 3.20: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic nồng độ
pelargonidin Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt
ACN Acetonitrile Acetonitril
AOAC Association of Official Analytical Community
Hiệp hội cộng đồng phân tích thức
CYA Cyanidin Cyanidin
DEL Delphinidin Delphinidin
HPLC High performance liquid
chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao
HPTLC High performance thin layer chromatography
Sắc ký lớp mỏng hiệu cao
LC-MS/MS
Liquid chromatography tandem mass spectrometry
Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần
LOD Limit of detection Giới hạn phát
LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng
MeOH Methanol Metanol
PDA Photodiod array Detector mảng đi-ốt quang
(10)ppm Parts per million Phần triệu
R Relative coefficient Hệ số tương quan
RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối
SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn
S/N Signal to noise ratio Tỷ lệ tín hiệu chia cho
nhiễu
TFA Trifloroacetic acid Axit Trifloaxetic
(11)MỞ ĐẦU
Ngày nay, ảnh hưởng điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau gia tăng dạng oxy hoạt động Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương cho thể nguyên nhân nhiều bệnh nan y Những nghiên cứu tìm hiểu chất có khả chống oxy hóa mang lại tác dụng tốt, có lợi cho sức khỏe người ngày phát triển
Chất chống oxy hóa “chiến binh tốt” chống lại chất độc hại - gốc tự Chúng hình thành cách tự nhiên sản phẩm phụ trình sống liên quan tới oxy Các chất chống oxy hóa có khả giải phóng điện tử, chúng vơ hiệu hóa khả oxy hóa gốc tự ngăn chặn chúng cơng tế bào khỏe mạnh Để bảo vệ mình, thể ln tự sản sinh chế chống oxy hóa thiết yếu, với thời gian chúng dần trở nên hiệu theo tuổi tác Đây lý mà việc sử dụng chất chống oxy hóa thực phẩm chứa chất chống oxy hóa quan trọng [3], [11]
Ngày nay, thức ăn không đảm bảo đủ calo, ngon, sạch, mà phải chứa hoạt chất sinh học tự nhiên cần cho sức khoẻ sắc đẹp, không điều khiển chức hoạt động phận thể, tạo cho người khả miễn dịch cao, chống lão hố, tăng tuổi thọ, mà cịn giúp phịng chống số bệnh, kể ung thư Theo nghiên cứu hợp chất anthocyanin có hoạt tính tốt như: chống viêm, chống xơ vữa động mạch, ức chế đông tụ tiểu cầu, chống ung thư, thúc đẩy hình thành cytokin điều hịa phản ứng miễn dịch, có hoạt tính chống oxy hóa mạnh [21], [22], [28]
(12)phân tích xác định anthocyanin tổng phương pháp UV-VIS có độ xác khơng cao Việc phân tích riêng lẻ hợp chất nhóm anthocyanin đối tượng mẫu thực vật sở để đánh giá hoạt tính chống oxy hố chất nhóm, đề xuất nguồn ngun liệu cho chế biến thực phẩm chức Xuất phát từ thực tiễn trên, đặt vấn đề nghiên cứu đề tài:
“Xác định hàm lượng Anthocyanin số loại rau phương pháp sắc ký”
Với mục tiêu sau đây:
1 Xây dựng thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Anthocyanin trong số loại rau phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC.
(13)TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1 Trần Tử An (2007), Hóa phân tích - tập - Phân tích dụng cụ, Nhà xuất Y học, Hà Nội
2 Huỳnh Thị Kim Cúc, cộng (2004), "Xác định hàm lượng Anthocyanin số nguyên liệu rau phương pháp pH vi sai", Tạp Chí Khoa
Học Công Nghệ, Đại Học Đà Nẵng, 3(7), 47-54
3 Lại Thị Ngọc Hà Vũ Thị Thư (2009), "Stress oxy hóa chất chống oxy hóa tự nhiên", Tạp chí Khoa học Phát triển, 7(5), 667-677
4 Trần Từ Hiếu cộng (2003), Hoá học phân tích, Nhà xuất đại học quốc gia Hà Nội, Hà Nội
5 Nguyễn Thị Hiển, Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Thị Loan (2012), “Nghiên cứu chiết tách Anthocyanin từ đài hoa Hibiscus sabdariffa” - Ứng dụng để sản xuất giấy thị phát nhanh hàn the thực phẩm, Tạp chí Khoa học
phát triển 2012, 10(5), 738-746
6 Nguyễn Thị Lan Lê Thị Lạc Quyên (2006), "Nghiên cứu ảnh hưởng hệ dung môi đến khả chiết tách chất màu Anthocyanin có độ màu cao từ dâu Hội An", Tạp Chí Khoa Học Cơng Nghệ, Đại Học Đà Nẵng, 44, 71-76 Phạm Thị Thanh Nhàn, Nguyễn Hữu Cường Lê Trần Bình (2011), "Tách
chiết phân tích hàm lượng Anthocyanin mẫu thực vật khác nhau",
Tạp chí Sinh Học, 33(4), 79-85
8 Nguyễn Văn Ri (2009), Các phương pháp tách, Bài giảng Đại học Khoa học Tự Nhiên – ĐHQGHN
9 Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học & vi
sinh vật, Nxb Khoa Học Kỹ Thuật
Tiếng Anh
(14)11 Betteridge D J (February, 2000), "What is oxidative stress?", Metabolism, 49(2), 3-8
12 Bhornchai Harakotr., et al (2014), "Anthocyanins and antioxidant acitivity in coloured waxy corn at different maturation stages", Journal of functional foods,
9, 109-118
13 Bridle P and Timberlake C.F (1996), "Anthocyanins as natural food colors-selected aspects", Food Chemistry, 58, 103-109
14 Cheynier V., Gómez C and Ageorges A (2012), "Flavonoids: Anthocyanins", In Fidel Toldra Leo M.L Nollet, editor, Handbook of Analysis of Active
Compounds in Functional Foods, 379-397
15 Cretu G.C and Morlock G.E (1 March 2014), "Analysis of Anthocyanins in powdered berry extracts by planar chromatography linked with bioassay and mass spectrometry", Food Chemistry, 146, 104-112
16 Korte G Dreiseitel A., Schreier P., et al (2009), "Berry Anthocyanins and their aglycons inhibit monoamine oxidases A and B", Pharmacol Res, 59(5), 306-311 17 Durst R.W and Wrolstad R.E (2001), "Separation and Characterization of
Anthocyanins by HPLC", Current Protocols in Food Analytical Chemistry, F1.3.1-F1.3.13
18 Francesca Leri., et al, (2012), "Simultaneous determination of Anthocyanins, coumarins and phenolicaxits in fruits, kernels and liqueur of Prunus mahaleb L", Food Chemistry, 135, 2157-2162
19 Fossen T and Andersen M (2000), "Anthocyanins from tubers and shoots of the purple potato, Solanum tuberosum", J Ilort Sci Biotech, 75, 360-363
20 Hybertson B.M., et al (2011), "Oxidative stress in health and disease: The therapeutic potential of Nrf2 activation", Molecular Aspects of Medicine, 32, 234–246
21 Lakshmi S.V.V., Padmaja G and Kutala V K., Kuppusamy P (December, 2009), "Oxidative Stress in Cardiovascular Disease", Indian Journal of
(15)22 Lila M.A (2004), "Anthocyanins and Human Health: An In Vitro Investigative Approach", Journal of Biomedicine and Biotechnology, 5, 306-313
23 Longo L and Vasapollo G (2006), "Extraction and identification of Anthocyanins from Smilax aspera L berries", Food Chemistry, 94, 226-231 24 Marco P.H and Scarminio I.S (2007), "Q-mode curve resolution of UV–vis
spectra for structural transformation studies of Anthocyanins inaxitic solutions", Analytica Chimica Acta, 583, 138-146
25 Meng L Lozano Y., Bombarda I., Gaydou E and Li B (2006), "Anthocyanin and flavonoid production from Perilla frutescens: Pilot plant scale processing including cross-flow microfiltration and reverse osmosis", J Agric Food Chem, 54, 4297-4303
26 Merken H.M and G.R Beecher (2000), "Liquid chromatographic method for the separation and quantification of prominent flavonoid aglycones", Journal of
Chromatography A, 897, 177-184
27 Miguel M G (2011), "Anthocyanins: Antioxidant and/or anti-inflammatory activities", Journal of Applied Pharmaceutical Science, 01(06), 07-15
28 Nantz M.P Percival S.S., Rowe C.A and Nieves Jr C (2006), "Immunity and Antioxidant Capacity in Humans Is Enhanced by Consumption of a Dried, Encapsulated Fruit and Vegetable Juice Concentrate", The Journal of Nutrition, 136, 2606-2610
29 Nafiz Oncu Can., et al (2012), "Rapid determination of free Anthocyanins in foodstuff using high performance liquid chromatography" Food Chemistry, 130, 1082-1089
30 Ovando A.C., et al (2009), "Chemical studies of Anthocyanins: A review",
Food Chemistry, 113, 859 - 871
(16)incana Cultivars (Brassicaceae)", J Japan Soc Hort Sci, 81(1), 91-100
33 Timberlake C F and Bridle P (1982), "Distribution of Anthocyanins in Food Plants", In Pericles Markakis, editor, Anthocyanins as Food Colors, Academic Press
34 Truong V.D Deighton N., Thompson R.T., et al (2010), "Characterization of Anthocyanins and Anthocyanidins in Purple-Fleshed Sweetpotatoes by HPLC-DAD/ESI-MS/MS", J Agric Food Chem, 58, 404-410
35 Wu X (2005), "Identification and characterization of Anthocyanins by HPLC-ESI-MS/MS in common foods in the United States: Vegetables, nuts, and grains", J Agric Food Chem, 53(8), 3101-3113
36 Xu Z and Howard L.R (2012), "Analysis Methods of Anthocyanins", Analysis of
Antioxidant-RichPhytochemicals, 5, 945-978
37 Yafang Shao., et al (2014), "Phenolicaxits, Anthocyanins, and antioxidant capacity in rice (Oryzasativa L.) grains at four stages of development after flowering", Food Chemistry, 143, 90–96
38 Zhang Z et al (2004), "Comparison of HPLC Methods for Determination of Anthocyanins and Anthocyanidins in Bilberry Extracts", J Agric Food Chem,