Xây dựng quy trình định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin i trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ (lc ms ms)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN THỊ MỸ DUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METRONIDAZOL VÀ SPIRAMYCIN I TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Hướng dẫn khoa học: TS CHƯƠNG NGỌC NÃI PGS.TS NGUYỄN ĐỨC TUẤN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Trần Thị Mỹ Dung MỤC LỤC Trang TRANG BÌA PHỤ LỜI CAM ĐOAN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ viii MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan metronidazol (MET) 1.2 Tổng quan spiramycin I (SPY I) 1.3 Tổng quan chất dùng làm chất chuẩn nội 1.4 Tổng quan sắc ký lỏng ghép khối phổ 1.5 Xử lý mẫu huyết tương 14 1.6 Thẩm định quy trình định lượng thuốc dịch sinh học theo US- 17 FDA EMA 1.7 Một số cơng trình nghiên cứu định lượng metronidazol spiramycin 24 huyết tương người kỹ thuật sắc ký lỏng Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.2 Địa điểm nghiên cứu 27 2.3 Nguyên vật liệu 27 2.4 Phương pháp nghiên cứu 28 2.4.1 Chuẩn bị mẫu 28 2.4.2 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời MET SPY I huyết 29 tương người phương pháp LC-MS/MS 2.4.3 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời MET VÀ SPY I, IS 31 huyết tương người phương pháp LC-MS/MS theo hướng dẫn USFDA EMA Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 3.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 35 3.2 Khảo sát chuẩn nội 37 3.3 Khảo sát điều kiện sắc ký 38 3.4 Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương 45 3.5 Xác định khoảng nồng độ định lượng MET SPY I huyết tương 47 người 3.6 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời MET SPY I huyết 47 tương người phương pháp LC-MS/MS 3.7 Dự thảo quy trình định lượng đồng thời MET SPY I huyết 57 tương người kỹ thuật LC-MS/MS Chương BÀN LUẬN 60 4.1 Lựa chọn kỹ thuật phân tích để định lượng đồng thời MET SPY I 60 4.2 Điều kiện sắc ký, thời gian phân tích lượng mẫu thử 60 4.3 Khảo sát thành phần pha động 62 4.4 Lựa chọn chất chuẩn nội 63 4.5 Quy trình xử lý mẫu, hiệu suất chiết ảnh hưởng mẫu 64 4.6 Độ nhạy tính đặc hiệu phương pháp 65 4.7 Độ ổn định chất phân tích 65 4.8 Ảnh hưởng lượng mẫu tồn dư 66 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 5.1 Kết luận 67 5.2 Kiến nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Từ nguyên chữ viết tắt ACN Acetonitrile AUC Area under cover (Diện tích đường cong) APCI Atmospheric pressure chemical ionization (Ion hóa hóa học áp suất khí quyển) AS Analytical Substance (Chất phân tích) CE Collision cell (Buồng va chạm) FAB Fast atom bombardment (Bắn phá nhanh nguyên tử) CI Chemical Ionization (Ion hóa hóa học) Cmax Nồng độ đỉnh CV Coefficient of variation (Hệ số phân tán) ECD Electron capture detection (Đầu dò cộng kết điện tử) ESI Electrospray Ionization (Ion hóa cách phun điện) FDA Food and Drug Administration (Cơ quan Quản lý thuốc Thực phẩm) FI Field Ionization (ion hóa trường) EMA European Medicines Agency (Cơ quan Quản lý thuốc Châu Âu) HQC High Quality Control (Mẫu kiểm tra nồng độ cao) HT Huyết tương IS Internal standard (Chuẩn nội) IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry (Hiệp hội Quốc tế Hóa học túy ứng dụng) LC Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng) LC-MS/MS Liquid Chromatography- Mass Spectrometry/Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng – Khối phổ/Khối phổ) LLE Liquid-liquid extraction (Chiết lỏng-lỏng) LLOQ Lower Limit of Quantification (Giới hạn định lượng dưới) LQC Low Quality Control (Mẫu kiểm tra nồng độ thấp) MIC Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MQC Medium Quality Control (Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình) MS Mass Spectrometry (Khối phổ) MRM Multiple reacting monitoring (Kỹ thuật ghi phổ MRM) MeOH Methanol MF Matrix effect (Ảnh hưởng mẫu) MET Metronidazole ROX Roxithromycin PPT Protein precipitation (Tủa protein) CV Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) SIM Selected Ion Monitoring (Kỹ thuật ghi phổ SIM) SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn) SPE Solid phase extraction (Chiết pha rắn) SRM Selected Reaction Monitoring (Kỹ thuật ghi phổ SRM) SPY I Spiramycin I TB Trung bình TIN Tinidazole Tmax Thời gian đạt nồng độ đỉnh t1/2 Thời gian bán thải ULOQ Upper Limit of Quantification (Giới hạn định lượng trên) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các thông số dược động học thuốc đối chứng thuốc thử Bảng 1.2 Các thông số dược động học spiramycin Bảng 1.3 Tóm tắt quy triǹ h xử lý mẫu huyế t tương 16 Bảng 1.4 So sánh hướng dẫn US-FDA 2018 EMA 2015 23 Bảng 2.1 Chất chuẩn đối chiếu chuẩn nội sử dụng nghiên cứu 27 Bảng 2.2 Dung mơi hóa chất sử dụng nghiên cứu 27 Bảng 2.3 Nồng độ lý thuyết dung dịch chuẩn dung dịch kiểm tra (QC) 29 Bảng 3.1 Tóm tắt thơng tin khảo sát nội chuẩn 37 Bảng 3.2 So sánh tỷ lệ thu hồi với dung môi tủa protein mức nồng độ MQC 47 Bảng 3.3 Nồng độ lý thuyết thuốc huyết tương 47 Bảng 3.4 Kết kiểm tra tính phù hợp hệ thống (n = 6) 48 Bảng 3.5 Kết xác định tính đặc hiệu phương pháp 49 Bảng 3.6 Kết khảo sát khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn 50 Bảng 3.7 Kết khảo sát tính tương thích phương trình hồi quy 50 ý nghĩa hệ số phương trình hồi quy Bảng 3.8 Kết thẩm định độ độ xác phương pháp 51 (với MET) Bảng 3.9 Kết thẩm định độ độ xác phương pháp 52 (với SPY I) Bảng 3.10 Hiệu suất chiết MET, SPY I ROX (n = 6) 52 Bảng 3.11 Độ ổn định MET SPY I dung dịch chuẩn gốc (n = 6) 53 Bảng 3.12 Độ ổn định MET SPY I huyết tương (n = 6) 54 Bảng 3.13 Kết đánh giá ảnh hưởng mẫu phân tích MET 55 SPY I Bảng 3.14 Kết đánh giá ảnh hưởng mẫu tồn dư MET, SPY I 56 ROX Bảng 3.15 Kết đánh giá độ pha loãng MET, SPY I huyết tương 58 DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Cấu trúc hóa học metronidazol Hình 1.2 Cấu trúc hóa học spiramycin Hình 1.3 Cấu trúc hóa học roxithromycin Hình 1.4 Cấu trúc hóa học tinidazol Hình 1.5 Cấu trúc hóa học carbamazepin Hình 1.6 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC Hình 1.7 Sơ đờ ta ̣o thành ion dương kỹ thuật ESI 10 Hình 1.8 Sơ đồ khối đầu dò khối phổ hai lần tứ cực 11 Hình 1.9 Các chế độ làm việc MS/MS 12 Hình 1.10 Bộ phận phân tích khối phổ thiết bị LC-MS/MS 8040 14 Shimadzu Hình 3.1 Phổ khối SPY I (A), MET (B), ROX (C) TIN (D) 36 Hình 3.2 Sắc ký đồ dung dịch MQC với hệ pha động acid formic 0,1% - 37 MeOH (43:57), cột Gemini NX-C18 (100 x mm; µm), nhiệt độ cột 40 oC, thể tích tiêm mẫu µl Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch MQC với pha động (A đến C) pha động 38 (D) Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch MQC với pha động (A), (B), (C) 39 (D), (E) (F) Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch MQC với pha động có pH 2,5 (A), 40 pH (B), pH 7,5 (C) pH 8,0 (D) Hình 3.6 Sắc ký đồ dung dịch MQC với cột sắc ký khác (nhiệt độ cột 40 oC) (A) Cột Nucleosil C18 (150 x 4,6 mm; µm) (B) Cột Nucleosil C8 (150 x 4,6 mm; µm) (C) Cột Gemini NX-C18 (100 x 3,0 mm; µm) (D) Cột Gemini C18 (100 x 4,6 mm; µm) (E) Cột Zorbax C18 (250 x 4,6 mm; µm) Hệ pha động ACN - amoni format mM pH 7,4 (80:20) Thể tích tiêm mẫu µl 42 Hình 3.7 Sắc ký đồ dung dịch MQC với nhiệt độ cột khác 43 (A) 30 oC, (B) 35 oC, (C) 40 oC Hệ pha động amoni format mM pH 7,4 ACN (20:80) Thể tích tiêm mẫu µl Hình 3.8 Sắc ký đồ dung dịch MQC với tốc độ dòng khác 44 (A) 0,3 ml/phút, (B) 0,4 ml/phút, (C) 0,5 ml/phút Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dịch MET, SPY I ROX mức nồng độ 45 MQC Hình 3.10 Sắc ký đồ dung dịch MQC với dung môi tủa protein 45 khác (A) tủa ACN, (B) tủa MeOH Hình 3.11 Sắc ký đồ dung dịch MQC với dung môi tủa protein khác 46 (A) tủa ACN dung dịch NaOH 0,01 N; (B) (C) tủa ACN dung dịch NaOH 0,1 N; (D) tủa ACN dung dịch NaOH N; (E) tủa ACN dung dịch acid formic 1%; (F) tủa MeOH dung dịch acid formic 1% Hệ pha động amoni format mM pH 7,4 -ACN (20:80) Nhiệt độ cột 40 oC Thể tích tiêm mẫu µl Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng (A) mẫu huyết tương tự tạo 49 có chứa chuẩn nồng độ LLOQ (B) Hình 4.1 Cơng thức cấu tạo spiramycin I gồm có phân tử đường 61 MỞ ĐẦU Hiện dạng thuốc phối hợp metronidazol spiramycin với liều cố định sử dụng phổ biến nha khoa để điều trị nhiễm khuẩn miệng cấp tính, mạn tính dự phòng nhiễm khuẩn chỗ sau phẫu thuật nha khoa Việt Nam Ngoài việc sử dụng thuốc kháng viêm giảm đau điều trị nhiễm trùng miệng, kháng sinh có vai trị quan trọng việc diệt vi khuẩn gây bệnh vùng miệng nướu răng, lợi…Các vi khuẩn gây bệnh vùng miệng đa dạng, thường bao gồm hai loại kỵ khí hiếu khí nên phối hợp kháng sinh để điều trị cần thiết Việc phối hợp metronidazol spiramycin nhằm tăng tác dụng điều trị, mở rộng phổ kháng khuẩn, tạo nên tác dụng hiệp đồng ức chế số chủng vi khuẩn nhạy cảm, giảm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 30 lần metronidazol giảm MIC 10 lần spiramycin [31], giảm tác dụng không mong muốn Spiramycin kháng sinh thuộc nhóm macrolid phân lập từ Streptomyces ambofaciensand, hỗn hợp tự nhiên gồm ba thành phần spiramycin I, II III, hàm lượng spiramycin I 85%, spiramycin II spiramycin III không 5% 10% [27],[32] Spiramycin I có hoạt tính sinh học cao số ba đồng phân [25] Vì vậy, spiramycin I thường chọn chất đại diện để định lượng spiramycin [5],[9],[32] Trên giới có nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng để định lượng metronidazol dịch sinh học [11],[17],[21],[24],[29],[32],[34],[35],[36] spiramycin I [5],[9],[23],[32] Tuy nhiên, việc nghiên cứu định lượng đồng thời metronidazol spiramycin I mẫu huyết tương người kỹ thuật LC-MS/MS có cơng trình cơng bố thời điểm [32] Trong nước, chưa có cơng trình cơng bố phương pháp định lượng đồng thời metronidazol spiramycin I huyết tương người Thị trường Việt Nam lưu hành dạng bào chế phối hợp metronidazol spiramycin với nhiều tên biệt dược khác nhau, sản xuất nước với giá thành rẻ so với thuốc ngoại nhập hàm lượng Tuy nhiên, chế phẩm chưa đánh giá tương đương sinh học so với thuốc gốc Để đảm bảo chất lượng thuốc sản xuất nước, thuốc generic cần chứng minh tính hiệu an toàn điều trị qua thử nghiệm tương đương sinh học với thuốc gốc Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-15 Phụ lục Sắc ký đồ liệu thô khảo sát độ ổn định mẫu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-16 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-17 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-18 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-19 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-20 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-21 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-22 Phụ lục Sắc ký đồ liệu thô khảo sát ảnh hưởng mẫu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-23 Phụ lục 10 Sắc ký đồ liệu thô khảo sát ảnh hưởng lượng mẫu tồn dư Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-24 Phụ lục 11 Sắc ký đồ liệu thô khảo sát ảnh hưởng độ pha loãng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-25 Phụ lục 12 Chứng nhận phân tích chất chuẩn Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-26 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-27 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-28 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-29 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... SẮC KÝ LỎNG GHÉP KH? ?I PHỔ (LC – MS/ MS)? ?? thực v? ?i mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình định lượng đồng th? ?i metronidazol spiramycin I huyết tương ngư? ?i kỹ thuật LC – MS/ MS - Thẩm định quy trình định. .. -15.0 150000 1 :Spiramycin II TIC(+) 2:Tinidazol TIC(+) 3:Roxithromycin TIC(+) 4 :Spiramycin TIC(+) 5 :Metronidazol TIC(+) 6 :Spiramycin III TIC(+) 7 :Spiramycin II TIC(+) 1 :Spiramycin II 443.30>174.10(+)... nghiệm tương đương sinh học v? ?i thuốc gốc 2 Xuất phát từ lý trên, đề t? ?i: “XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG TH? ?I METRONIDAZOL VÀ SPIRAMYCIN I TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯ? ?I NGƯ? ?I BẰNG KỸ THUẬT SẮC