bảo quản ở -20o C để sử dụng cho các bước sau này... Kết quả điện di sản phẩm PCR của các mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng lá thu thập được. A ) PCR với cặp mồi chung đặc hiệu DNA-A của be[r]
(1)BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
Đề tài:
Đề tài: “
“Xác định virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminiviridae) Xác định virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminiviridae) cây cà chua khác khu vực Hà Nội vùng phụ cận
cây cà chua khác khu vực Hà Nội vùng phụ cận ””
ơ
ơ
Giảng viên hướng dẫn: TS.Hà Viết CườngGiảng viên hướng dẫn: TS.Hà Viết Cường
Bộ môn: Bệnh - khoa Nông họcBộ môn: Bệnh - khoa Nông học
Sinh viên thực hiện: Lê Văn HảiSinh viên thực hiện: Lê Văn Hải
(2)(3)1.1 Đặt vấn đề.
1.1 Đặt vấn đề.
Họ Geminiviridae họ thực vật lớn (289 loài) Họ Họ Geminiviridae họ thực vật lớn (289 lồi) Họ
virus có chi chi
virus có chi chi Begomovirus Begomovirus là chi quan trọng số là chi quan trọng số lượng loài (185 loài) (Fauquet
lượng loài (185 loài) (Fauquet et al.,et al., 2008), bệnh mà chúng 2008), bệnh mà chúng gây trồng.
gây trồng.
Nhiều bệnh nghiêm trọng trồng xác định Nhiều bệnh nghiêm trọng trồng xác định
begomovirus gây ra.
begomovirus gây ra.
Begomovirus gây bệnh tạo triệu chứng giống trồng, Begomovirus gây bệnh tạo triệu chứng giống trồng,
danh tính chúng xác định dựa phân tích phân tử.
danh tính chúng xác định dựa phân tích phân tử.
Begomovirus virus có gien DNA sợi vịng đơn, kích thước Begomovirus virus có gien DNA sợi vịng đơn, kích thước
khoảng 2.6 – 2.8 kb Begomovirus có gien đơn (gồm phân
khoảng 2.6 – 2.8 kb Begomovirus có gien đơn (gồm phân
tử DNA-A) có gen kép (gồm hai phân tử DNA-A DNA-B).
(4)Triệu chứng bệnh xoăn vàng cà chua
Triệu chứng bệnh xoăn vàng cà chua
vector truyền bệnh
vector truyền bệnh
Hình Triệu chứng bệnh xoăn vàng cà chua (msucares.com)
(5)Hình 3: triệu chứng begomovirus gây số đối tượng trồng cây dại (1) Cotton leaf curl virus (www.padil.gov.au), (2) Ludwigia yellow vein Vietnam virus & Ludwigia yellow vein; (3) African cassava mosaic virus (eastafrica.usaid.gov); (4) Siegesbeckia yellow vein Guangxi virus (www.bspp.org.uk); (5) Dolichos yellow mosaic virus (www.bspp.org.uk); (6) Okra yellow crinkle Mali virus (www.bspp.org.uk).
1 2 3
6 5
(6)Hình Tổ chức gen phân tử DNA-A begomovirus
Hình Tổ chức gen phân tử DNA-A begomovirus
CR = common region
DNA-A 2.6-2.8kb AC4 AC2 (TrAP) AC1 (Rep) AV1 (CP) AC3 (REn) AV2 CR
• Tái bản
• Tương tác với protein ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào
• Tăng cường tái bản
• Tương tác với protein ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào
• Hoạt hóa phiên mã
• Ức chế phản ứng phịng thủ cây.
• Cảm ứng triệu chứng
• Di chuyển hệ thống
• Tích lũy DNA virus
• Cảm ứng triệu chứng
• Di chuyển hệ thống
• Vỏ protein
• Lan truyền qua vector
(7) Trên giới có 50 loài begomovirus xác định gây hại cà Trên giới có 50 lồi begomovirus xác định gây hại cà
chua.
chua.
Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng xem bệnh virus quan trọng Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng xem bệnh virus quan trọng
trên cà chua Có begomovirus phát gây bệnh xoăn vàng
trên cà chua Có begomovirus phát gây bệnh xoăn vàng
cà chua Việt Nam gồm tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus
cà chua Việt Nam gồm tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus
(TYLCKaV) virus phát miền Bắc tomato leaf curl
(TYLCKaV) virus phát miền Bắc tomato leaf curl
Vietnam virus (ToLCVV), tomato yellow leaf curl Vietnam virus
Vietnam virus (ToLCVV), tomato yellow leaf curl Vietnam virus
(TYLCVNV).
(TYLCVNV).
Việt Nam dường trung tâm đa dạng begomovirus Nhưng Việt Nam dường trung tâm đa dạng begomovirus Nhưng
tại số lượng begomovirus phát 19 lồi, chủ yếu
tại số lượng begomovirus phát 19 loài, chủ yếu
các lồi dại Điều gợi ý có nhiều lồi begomovirus gây
các lồi dại Điều gợi ý có nhiều lồi begomovirus gây
hại cà chua khác Việt nam cần phải xác định
hại cà chua khác Việt nam cần phải xác định
Chính chúng tơi tiến hành đề tài:
Chính tiến hành đề tài:
““Xác định virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminiviridae) Xác định virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminiviridae) cây cà chua khác khu vực Hà Nội vùng phụ cận”
(8)(9)(10)1.2 Mục đích yêu cầu
1.2 Mục đích yêu cầu
1.2.1 Mục đích
1.2.1 Mục đích
Xác định virus thuộc chi Begomovirus cà chua khác khu vực Hà Nội Xác định virus thuộc chi Begomovirus cà chua khác khu vực Hà Nội và vùng phụ cận
và vùng phụ cận
1.2.2 Yêu cầu
1.2.2 Yêu cầu
1.
1. Điều tra, thu mẫu xử lý mẫu, bệnh virus với triệu chứng điển hình nhóm Điều tra, thu mẫu xử lý mẫu, bệnh virus với triệu chứng điển hình nhóm begomovirus gây cà chua khác
begomovirus gây cà chua khác
2.
2. Xác định có mặt begomovirus PCR dùng mồi chung DNA-A BegoAFor1 Xác định có mặt begomovirus PCR dùng mồi chung DNA-A BegoAFor1 & BegoAReV1
& BegoAReV1
3.
3. Xác định thành phần lồi tìm miền Bắc Việt Nam sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu Xác định thành phần lồi tìm miền Bắc Việt Nam sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu ToLCVV (ToLCVV-sp-F2 & ToLCVV-sp-R2) TYLCVNV(TYLCVNV-sp-F1 &
ToLCVV (ToLCVV-sp-F2 & ToLCVV-sp-R2) TYLCVNV(TYLCVNV-sp-F1 &
TYLCVNV-sp-R1).
TYLCVNV-sp-R1).
4.
4. Xác định có mặt vệ tinh DNA-β virus cặp mồi đặc hiệu BetaFor2 & BetaRev2.Xác định có mặt vệ tinh DNA-β virus cặp mồi đặc hiệu BetaFor2 & BetaRev2.
5.
5. Giải trình tự sản phẩm PCR - mẫu cà chua.Giải trình tự sản phẩm PCR - mẫu cà chua.
6.
6. Giải trình tự sản phẩm khác.Giải trình tự sản phẩm khác.
7.
(11)Phần II: Vật liệu phương pháp
Phần II: Vật liệu phương pháp
nghiên cứu
(12)2.1 Vật liệu nghiên cứu
2.1 Vật liệu nghiên cứu
Các mẫu cà chua, mẫu khác có triệu chứng nhiễm Các mẫu cà chua, mẫu khác có triệu chứng nhiễm
bệnh xoăn vàng thu thập khu vực Hà Nội vùng phụ
bệnh xoăn vàng thu thập khu vực Hà Nội vùng phụ
cận.
cận.
Các thiết bị hóa chất cần thiết.Các thiết bị hóa chất cần thiết.
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho begomovirusbegomovirus, , tomato tomato
yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV)
yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV), , tomato leaf tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) (Bảng 1).
curl Vietnam virus (ToLCVV) (Bảng 1).
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu DNA-βSử dụng cặp mồi đặc hiệu DNA- BetaFor2 & BetaRev2 .
(13)Bảng 1: Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu (trên phân tử DNA-A)
Bảng 1: Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu (trên phân tử DNA-A)
Mồi
Mồi Trình tự (5’ – 3’)Trình tự (5’ – 3’) Vị tríVị trí Kích thước Kích thước (bp)
(bp) Tham khảoTham khảo
TYLCVNV-Sp-F1
TYLCVNV-Sp-F1 TGTGTTACATATTCTGTGTTTTCC TGTGTTACATATTCTGTGTTTTCC 1094-1117 1094-1117 1386 1386 Mã Genebank Mã Genebank
DQ641697
DQ641697
TYLCVNV-Sp-R1
TYLCVNV-Sp-R1 AAATACATCAAAATCTGCAGAGAGC AAATACATCAAAATCTGCAGAGAGC 2456-2480 2456-2480
ToLCVV-Sp-F2
ToLCVV-Sp-F2 GACCAGTCTGAAGGTGTGAGTTC GACCAGTCTGAAGGTGTGAGTTC 1254-1276 1254-1276 454 454 Mã Genebank Mã Genebank
DQ641705
DQ641705
ToLCVV-Sp-R2
ToLCVV-Sp-R2 ACTCAAGCTATAAAGAATACCTAGAC ACTCAAGCTATAAAGAATACCTAGAC 1683-1708 1683-1708
BegoAFor1
BegoAFor1 TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC* TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC* Xem hình 4Xem hình 4 ~1200 ~1200 Ha Ha et alet al., 2006 ., 2006 BegoARev1
BegoARev1 ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC* ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC*
(CEGPCKVQS) (IPT/A/SIF/VLCNP) AV1 AV2 AC 3 AC 2 AC 1 AC 4
BegoAFor1 ~ 1.2 kb BegoARev1
DNA-A
Hình Sơ đồ tổ chức gien DNA-A (biểu diễn dạng mạch thẳng) begomovirus vị trí tương đối cặp mồi BegoAFor1 BegoARev1 Mũi tên dạng hộp biểu diễn vị trí và hướng ORF Dãy chữ ngoặc kép là chuỗi axit amin bảo thủ tương ứng với mồi BegoAFor1 và BegoARev1
(14)2.2 Phương pháp nghiên cứu.
2.2 Phương pháp nghiên cứu.
1. Thu mẫu xử lý mẫu.
2. Chiết tách DNA tổng số từ mô cà chua phương pháp NaOH (Wang et al., 1993), Phương pháp chiết dùng CTAB (Doyle & Doyle (1987))
3. Tiến hành kiểm tra PCR mẫu cà chua khác thu thập được, sử dụng cặp mồi bảng 1, cặp mồi đặc hiệu DNA-β điện di sản phẩm PCR.
DNA-4. Tinh chiết sản phẩm PCR từ gel Agarose (Invitrogen)
5. Định lượng sản phẩm tinh chiết.
6. Giải trình tự gen.
(15)Phần III Kết nghiên cứu
(16)3.1 Kết điều tra thu mẫu
3.1 Kết điều tra thu mẫu
3.1.1 Kết điều tra bệnh cà chua3.1.1 Kết điều tra bệnh cà chua
Bảng 2: Kết điều tra tỉ lệ bệnh xoăn vàng cà chuaBảng 2: Kết điều tra tỉ lệ bệnh xoăn vàng cà chua
TT Thời gian Địa điểm sinh trưởngGiai đoạn Tỉ lệ bệnh 1 18/09/2008 Nam Hồng – Đông Anh – Hà Nội Ra non 1.00% 2 21/09/2008 Cổ Bi – Gia Lâm – Hà Nội Ra hoa đợt 1 3.96% 3 24/09/2008 Tiên Sơn – Bắc Ninh Ra hoa đợt 1 0.52% 4 27/09/2008 Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội Ra hoa đợt 1 0.77%
5 30/09/2008 Yên Phú – Yên Mỹ – Hưng Yên Ra hoa đợt 1 4.00%
6 05/10/2008 Duyên Hà – Thanh Trì – Hà Nội Ra hoa đợt 1 0.50%
7 05/10/2008 Yên Mỹ – Thanh Trì – Hà Nội Ra hoa đợt 1 1.30%
(17)Hình 8: triệu chứng điển hình cà chua mắc bệnh xoăn vàng thu thập được
Cổ Bi – Gia Lâm – Hà Nội Tiên Sơn – Bắc Ninh ĐHNN HN
Thanh Trì – Hà Nội Yên Mỹ - Hưng Yên
Thanh Trì – Hà Nội
(18)3.1.2 Kết thu thập xử lý mẫu
3.1.2 Kết thu thập xử lý mẫu
Đối với cà chua: Đối với cà chua:
Thu 50 mẫu thông tin đầy đủ mẫu trình bày (phụ Thu 50 mẫu thơng tin đầy đủ mẫu trình bày (phụ
lục 1).
lục 1).
Đối với khác: Đối với khác:
Thu 64 mẫu có triệu chứng điển hình bệnh begomovirus Thu 64 mẫu có triệu chứng điển hình bệnh begomovirus
gây ra.
gây ra.
Đặc biệt chúng tơi thu mẫu đu đủ có triệu chứng lá, cuống Đặc biệt thu mẫu đu đủ có triệu chứng lá, cuống
xoắn vặn.
xoắn vặn.
Tất mẫu thu thập được bảo quản cẩn thận Các mẫu Tất mẫu thu thập được bảo quản cẩn thận Các mẫu này sau chiết tách DNA tổng số hai phương pháp
này sau chiết tách DNA tổng số hai phương pháp
bảo quản -20o C để sử dụng cho bước sau này.
(19)Hình 9:Triệu chứng xoăn mẫu đu đủ ((Yên Phú – Yên Mỹ - Hưng Yên(1, 2, 3)) triệu chứng đu dủ nhiễm begomovirus Trung Quốc (4)
1
3 4
(20)3.2 Kết kiểm tra PCR mẫu dại đu đủ
3.2 Kết kiểm tra PCR mẫu dại đu đủ Sử dụng cặp mồi Sử dụng cặp mồi BegoAFor1 & BegoAReV1BegoAFor1 & BegoAReV1 để phát có mặt để phát có mặt
begomovirus nhiễm mẫu đu đủ dại.
begomovirus nhiễm mẫu đu đủ dại.
1200bp
M 4
Hình 10: : Kết điện di sản phẩm PCR đu đủ mẫu dại thu được M: Là thang DNA (GeneRuler kb, Fermentas) 1: Đu đủ; 2: rau mương; 3: Lữ Đằng; 4: Ké hoa vàng.
Các mẫu kiểm tra nhiễm begomovirus virus nhiễm
mẫu rau mương, lữ đằng, ké hoa vàng phát Việt Nam (Cuong Ha et al., 2008)
Đặc biệt begomovirus nhiễm mẫu đu đủ lần phát Việt
Nam giải trình tự để làm rõ nguồn gốc phân loại virus này.
(21)1200 bp
454 bp
1386 bp
A
B
C M 10 11 13 15 16 17 18 19
Hình 11 Kết điện di sản phẩm PCR mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng thu thập được A) PCR với cặp mồi chung đặc hiệu DNA-A begomovirus B) PCR với cặp mồi đặc hiệu DNA-A ToLCVV C) PCR với cặp mồi đặc hiệu DNA-A TYLCVNV M thang DNA (GeneRuler kb, Fermentas) Các số từ đến 19 mẫu cà chua (danh tính mẫu được trình bày bảng 3) Kích thước sản phẩm PCR rõ.
3.3 Kết kiểm tra PCR mẫu cà chua
3.3 Kết kiểm tra PCR mẫu cà chua
(22)Bảng 3: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR
TT* Mã mẫu Địa điểm thu mẫu PCR đặc hiệu
Begomovirus ToLCVV TYLCVNV
1 CC1 Nam Hồng – Đông Anh – Hà Nội. + – +
2 CC2 Nam Hồng – Đông Anh – Hà Nội. + + –
3 CC 3 Cổ Bi – Gia Lâm – Hà Nội. + + –
4 CC 4 Cổ Bi – Gia Lâm – Hà Nội. + + –
5 CC 5 Cổ Bi – Gia Lâm – Hà Nội. + + –
6 CC 6 Từ Sơn – Bắc Ninh. + + –
7 CC 7 Từ Sơn – Bắc Ninh. + + –
8 CC 8 Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội + + –
9 CC 9 Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội + – –
10 CC 10 Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội + + –
11 CC 11 Duyên Hà – Thanh Trì – Hà Nội. + – +
12 CC 12 Yên Mỹ – Thanh Trì – Hà Nội. + + +
13 CC 13 Yên Mỹ – Thanh Trì – Hà Nội. + – +
14 CC 14 Yên Mỹ – Thanh Trì – Hà Nội + – –
15 CC 15 Yên Phú – Yên Mỹ – Hưng Yên. + – +
16 CC 16 Yên Phú – Yên Mỹ – Hưng Yên. + – +
17 CC 17 Yên Phú – Yên Mỹ – Hưng Yên. + – +
18 CC 18 Ngô Xuyên – Như Quỳnh – Hưng Yên + + –
19 CC 19 Đại học Nông nghiệp Hà Nội + - +
(23)1.
1. Cặp mồi chung begomovirus phát 19 mẫu nhiễm Cặp mồi chung begomovirus phát 19 mẫu nhiễm
begomovirus.
begomovirus.
2.
2. Cặp mồi đặc hiệu ToLCVV phát 10/19 mẫu nhiễm Cặp mồi đặc hiệu ToLCVV phát 10/19 mẫu nhiễm
ToLCVV.
ToLCVV.
3.
3. Cặp mồi đặc hiệu TYLCVNV Phát 8/19 nhiễm Cặp mồi đặc hiệu TYLCVNV Phát 8/19 nhiễm
TYLCVNV.
TYLCVNV.
4.
4. Mẫu số 12 nhiễm virus ToLCVV TYLCVNVMẫu số 12 nhiễm virus ToLCVV TYLCVNV
5.
5. Tìm mẫu mẫu số mẫu số 14 Khơng nhiễm hai Tìm mẫu mẫu số mẫu số 14 Không nhiễm hai
virus ToLCVV TYLCVNV.
virus ToLCVV TYLCVNV. Tuy nhiên danh tính Tuy nhiên danh tính virus xác định dựa phân tích trình
virus xác định dựa phân tích trình
tự chuỗi gen c
(24)Hình 12: Kết điện di sản phẩm PCR cặp mồi DNA-β
M: Maker; Giếng số đến giếng số 19 tương ứng mẫu từ mẫu số đến mẫu số 19
Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi BetaFor2 & BetaRev2 tạo
sản phẩm có kích thước xấp xỉ 1375 bp 6/19 mẫu nhiễm begomovirus.
Kết khẳng định kết luận chung vai trò DNA-β
đối với tính gây bệnh begomovirus hồn tồn xác
M 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
(25)3.4 Kết tinh sản phẩm PCR từ gel agarose
3.4 Kết tinh sản phẩm PCR từ gel agarose
Hình 13: Ước lượng hàm lượng sản phẩm PCR tinh chiết 3 giếng maker là giếng M1: 12 µl, giếng M2: µl, giếng M3: µl giếng 1, 2, là DNA Mẫu số 9, Mẫu số 14, và Đu đủ (2 µl mẫu).
M1 M2 M3
1200 bp
Dựa vào độ sáng băng điện di, ước lượng
(26)Mẫu số (Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội) 5’CACAGGATTTTGGTCAGGTGTTTAACATGTATGATAACGAGCCAAGTACAGCCACAGTGAAGAACGATAACAGAGATCGCTTTCAAGTTCTACGGC GTTTTCAGGCGACTGTTACTGGTGGTCAGTATGCAAGTAAGGAGCAAGCAATAGTTAGGAAGTTTATGAAGGTGAACAACCATGTGACGTATAATCAT CAAGAAGCTGCGAAGTATGACAATCACACAGAGAATGCTCTTTTGTTGTATATGGCATGTACTCATGCTAGTAATCCTGTGTATGCTACTTTGAAAAT CAGAATCTATTTCTATGATTCTGTTCAGAATTAATAAAGATTGAATTTTATTATATTTGAATGTGTTACATATTCTGTCTTTTCCAATACATCCCATA ATACATGATCACATGCTCTAATTACATTGTTAATACTAATTACACCCAAATTATCTAAATATTTCATACATTGAACCCTAAATACTCTTAAGAAACGC CAAGTCTGAGGACGTAAACGAGTCCAGATTTGGAATATTAGAAAACATTGGTGTATTCCCAACGCTTTCCTCAGGTTGTAATTGAATTGGACTTGTAT TGTGATGATGTCGTTGTTCATCAGAAATGGTCTCTCGTCGTGGCTGATTATCTTGAAATATAGGGGATTTTTGACCGTCCAGATATATACGCCACTCT CTGCTTGAGCTGCAGTGATAGCTTCCCCTGTGCGAGAATCCATGATTGTGACAGCCTAGTGCAATGAAGTATGAACAGCCACAAGGAAGATCAACTCT CCGTCTCCTCGTTGCTTTCTTGGCGTTGCGGTGTTGC 3’
Mẫu số 14 (Yên Mỹ - Thanh Trì – Hà Nội)
5’CCCAGGATTTTGGCCAGGTGTTTAACATGTATGATAATGAGCCGAGTACAGCTACTGTGAAGAATGACAACAGGGATCGTTTTCAAGTTCTCCGCC GTTTTCAAGCCACTGTTACTGGTGGCCAGTATGCAAGTAAGGAGCAAGCAATAGTCAGGAAATTCATGAAGGTGAATAACCATGTAACTTATAACCAT CAAGAGGCTGCGAAGTATGATAACCACACAGAAAATGCTTTGTTATTGTATATGGCATGTACTCATGCTAGTAATCCAGTGTATGCTACTTTGAAGAT CAGGATCTATTTCTACGATTCTGTTCAGAATTAATAAAGATTAAATTTTATTATACTTGAATCTTCTGTATCAATTGTGCCTTCTAATACATTGTACA ATACATGAGACATTGCTCTAATTACATTATTGATGCTAATAACTCCTAAATTGTCTAAATACTTAATACATTGATATTTAAATACTCTTAAGAAACGC GAGGTCTGAGGATGTAAACGAGTCCAAACTCGGCAGATTAGAAAACATTGGTGTATCCCCAATGCTTTCCTCAGGTTGTAATTGAATTGGACTTGTAT TGTGATGATGTCGTGGTTCGTCAGAAATGGTCTCTCGTCGTGGCTGGTTATCTTGAAATATAGGGGATTTTTGACCGTCCAGATATATACGCCACTCT CTGCTTGAGCTGCAGTGATAGCTTCCCCTGTGCGAGAATCCATGATTGTGACAGCCTAGTGCAATGAAGTATGAACATCCACAAGGGAGATCAACTCT CCGTCTCCTCGTAGCTTTCTTGGCGTTGCGGTGTTGC 3’
Đu đủ (Yên Phú – Yên Mỹ - Hưng Yên)
5’CACAGGATTTTGGTCAGGTGTTTAACATGTATGATAACGAGCCAAGTACAGCCACTGTGAAGAACGACAACAGAGATCGCTTTCAAGTTCTACGGC GTTTCCAGGCGACTGTTACTGGTGGTCAGTATGCAAGTAAGGAGCAAGCAATAGTTAGGAAGTTTATGAAGGTGAACAACCATGTGACGTATAATCAT CAAGAAGCTGCGAAGTATGACAATCACACAGAGAATGCTCTTTTGTTGTATATGGCATGTACTCATGCTAGTAATCCTGTGTATGCTACTTTGAAAAT CAGAATCTATTTCTATGATTCTGTTCAGAATTAATAAAGATTGAATTTTATTATATTTGAATGTGTTACATATTCTGTTTTTTCCAATACATCCCATA ATACATGATCACATGCTCTAATTACATTGTTAATACTAATTACACCCAAATTATCTAAATATTTCATACATTGAACCCTAAATACTCTTAAGAAACGC CAAGTCTGAGGACGTAAACGAGTCCAGATCTGGAAGATTAGAAAACATTGGTGTATTCCCAACGCTTTCCTCAGGTTGTAATTGAATTGGACTTGTAT TGTGATGATGTCGTGGTTCATCAGAAATGGTCTCTCGTCGTGGTTGGTTATCTTGAAATATAGGGGATTTTTGACCGTCCAGATATATACGCCACTCT CTGCTTGAGTTGCAGTGATAGCTTCCCCTGTGCGAGAATCCATAATTGTGACAGCCTAGTGCAATGAAGTATGAACAGCCACAAGGGAGATCAACTCT CCGTCTCCTCGTTGCTTTCTTGGCGTTGCGGTGTTGC 3’
3.5 Kết giải trình tự mẫu PCR
Hình 14 Trình tự nucleotide sản phẩm PCR dùng mồi BegoAFor1/BegoARev1.
(27)3.6 Kết tìm kiếm trình tự tương đồng.
3.6 Kết tìm kiếm trình tự tương đồng.
Tên
mẫu GenbankMã số Tên virus
Max score * Query Coverage † Max Identity ‡
Mẫu số 9
AM691554 Papaya leaf curl China virus isolate FQ1 1137 96% 91% AM691552 Papaya leaf curl China virus isolate F25 1137 96% 91% EU874386 Papaya leaf curl China virus isolate ZM1 1132 96% 91% AJ558123 Papaya leaf curl China virus - [G2] 1132 96% 91% AJ558117 Papaya leaf curl China virus - [G30] 1132 96% 91%
Đu đủ
DQ641697 Tomato yellow leaf curl Vietnam virus 1110 96% 91% AM691554 Papaya leaf curl China virus, isolate FQ1 1110 96% 91% AM691552 Papaya leaf curl China virus isolate F25 1110 96% 91% EU874386 Papaya leaf curl China virus isolate ZM1 1101 96% 91% AJ558123 Papaya leaf curl China virus - [G2] 1101 96% 91%
Mẫu số 14
AJ851005 Ageratum leaf curl virus -[G52] 1370 99% 97% DQ641698 Erectites yellow mosaic virus 982 99% 86% AY602166 Tomato yellow leaf curl Guangdong virus [G3] 975 95% 87% AY602165 Tomato leaf curl Guangdong virus isolate [G2] 942 96% 86% DQ641700 Papaya leaf curl China virus 935 96% 86%
Bảng 4: : Kết tìm kiếm trình tự tương đồng dựa trình tự 819 nucleotide kết giải trình tự.
(28)Bảng 5: Kết tìm kiếm trình tự tương đồng dựa trình tự gen AC3
Bảng 5: Kết tìm kiếm trình tự tương đồng dựa trình tự gen AC3
của kết giải trình tự
của kết giải trình tự
Tên mẫu
Tên mẫu Mã Genbank Tên Max score* CoverageQuery
†
Max Identity
‡
AC3 Mẫu số 9
AJ558117 Papaya leaf curl China virus - [G30] 600 100% 93% EU874386 Papaya leaf curl China virus isolate ZM1 594 100% 92% AM691554 Papaya leaf curl China virus, isolate FQ1 590 100% 92% AM691552 Papaya leaf curl China virus, isolate F25 590 100% 92% AM691553 Papaya leaf curl China virus, isolate LC1-2 585 100% 92%
AC3 Đu đủ
AJ558117 Papaya leaf curl China virus - [G30] 567 100% 91% EU874386 Papaya leaf curl China virus isolate ZM1 563 100% 91% AM691554 Papaya leaf curl China virus FQ1 563 100% 91% AM691552 Papaya leaf curl China virus F 25 563 100% 91% AM691553 Papaya leaf curl China virus LC1-2 558 100% 90%
AC3 Mẫu số 14
AJ851005 Ageratum leaf curl virus -[G52] 681 100% 97% EU365686 Tomato yellow leaf curl China virus-Dali198, 515 100% 89% AM260703 Tomato yellow leaf curl China virus Y295 502 100% 88% AJ319674 Tomato yellow leaf curl China virus-Tb[Y5], isolate Y5 500 100% 88% EF011559 Tomato yellow leaf curl China virus-[YN72], 499 91% 90%
(29)3.7 Kết phân tích trình tự nucleotide
Bảng 6: Mức tương đồng nucleotide dựa so sánh đoạn 819 nts mẫu begomovirus từ nghiên cứu này với đoạn tương ứng 41 chuỗi virus GenBank
Stt Mã GenBank Tên virus Ký hiệu Nguồn gốc Mẫu 9 Mẫu 14 Đu đủ
1 AM691554 Papaya leaf curl China virus [FQ1] PaLCuCNV-FQ1 Trung Quốc 0.897 0.833 0.903
2 AM691552 Papaya leaf curl China virus [F25] PaLCuCNV-F25 Trung Quốc 0.897 0.833 0.903
3 EU874386 Papaya leaf curl China virus [ ZM1] PaLCuCNV-ZM1 Trung Quốc 0.894 0.833 0.902 4 AJ558123 Papaya leaf curl China virus [G2] PaLCuCNV-G2 Trung Quốc 0.894 0.829 0.902 5 AJ558117 Papaya leaf curl China virus [G30] PaLCuCNV-G30 Trung Quốc 0.894 0.833 0.902 6 AJ811914 Papaya leaf curl China virus [G4] PaLCuCNV-G4 Trung Quốc 0.894 0.829 0.900 7 AM691553 Papaya leaf curl China virus [LC1-2] PaLCuCNV-LC1-2 Trung Quốc 0.892 0.830 0.899 8 AJ704604 Papaya leaf curl China virus [G22] PaLCuCNV-G22 Trung Quốc 0.888 0.827 0.895 9 AJ558125 Papaya leaf curl China virus [G10] PaLCuCNV-G10 Trung Quốc 0.883 0.835 0.890
10 AJ558124 Papaya leaf curl China virus [G8] PaLCuCNV-G8 Trung Quốc 0.879 0.840 0.888 11 DQ641700 Papaya leaf curl China virus [VN] PaLCuCNV-VN Việt Nam 0.879 0.847 0.885 12 DQ641697 Tomato yellow leaf curl Vietnam virus TYLCVNV Việt Nam 0.897 0.826 0.901
(30)Tiếp Bảng 6
21 AJ314739 Indian cassava mosaic virus ICMV Ấn Độ 0.712 0.701 0.712 22 AF126406 Mungbean yellow mosaic India virus MYMIV Ấn Độ 0.625 0.629 0.623 23 AF509739 Luffa yellow mosaic virus LYMV Việt Nam 0.677 0.670 0.676 24 D14703 Mungbean yellow mosaic virus MYMV Thái Lan 0.630 0.621 0.628 25 AF314531 Pepper leaf curl Bangladesh virus PepLCBV Bangladesh 0.760 0.745 0.767 26 AB050781 Soybean crinkle leaf virus SCLV Nhật Bản 0.817 0.774 0.824 27 AF509743 Squash leaf curl China virus SLCCNV Việt Nam 0.690 0.689 0.687 28 AJ566744 Tobacco leaf curl Yunnan virus TbLCuYNV Trung Quốc 0.800 0.756 0.810 29 AF195782 Tomato leaf curl Lao virus ToLCLV Lào 0.805 0.816 0.807 30 AF264063 Tomato leaf curl Vietnam virus ToLCVNV Việt Nam 0.813 0.782 0.816 31 AF189018 Tomato yellow leaf curl Indonesia virus ToLCInV Indonesia 0.734 0.723 0.731 32 AY514630 Tomato yellow leaf curl Thailand virus TYLCTHV Thái Lan 0.785 0.802 0.797 33 AF327436 Tomato leaf curl Malaysia virus TLCMaLV Malaysia 0.785 0.791 0.791 34 AF414287 Pepper leaf curl virus PepLCV Malaysia 0.829 0.841 0.838 35 EU487040 Tomato leaf curl Philippines virus ToLCPV Philippin 0.802 0.805 0.799 36 DQ641701 Lindernia anagallis yellow vein virus LaYVV Việt Nam 0.703 0.700 0.709 37 AM050736 Alternanthera yellow vein virus AlYVV Trung Quốc 0.737 0.723 0.739
38 AF104036 Sweet potato leaf curl virus SPLCV Mỹ 0.523 0.508 0.519
(31)Bảng 7: Mức tương đồng nucleotide dựa so sánh đoạn trình tự gen AC3 mẫu begomovirus từ nghiên cứu với đoạn tương ứng 41 chuỗi virus Genbank
Stt Mã GenBank Tên virus Ký hiệu Nguồn gốc Mẫu số 9 Mẫu số 14 Đu đủ 1 AM691554 Papaya leaf curl China virus-[FQ1] PaLCuCNV [FQ1] Trung quốc 0.903 0.809 0.918 2 AM691552 Papaya leaf curl China virus-[F25] PaLCuCNV [F25] Trung quốc 0.903 0.809 0.918 3 AJ811914 Papaya leaf curl China virus-[G4] PaLCuCNV [G4] Trung quốc 0.898 0.804 0.913 4 AM691553 Papaya leaf curl China virus-[LC1-2] PaLCuCNV [LC1-2] Trung quốc 0.901 0.812 0.916 5 AJ558123 Papaya leaf curl China virus-[G2] PaLCuCNV [G2] Trung quốc 0.898 0.802 0.916
6 AJ558117 Papaya leaf curl China virus-[G30] PaLCuCNV [G30] Trung quốc 0.906 0.804 0.923
7 EU874386 Papaya leaf curl China virus isolate ZM1 PaLCuCNV [ZM1] Trung quốc 0.903 0.802 0.920 8 DQ641697 Tomato yellow leaf curl Vietnam virus TYLCVNV Việt Nam 0.898 0.800 0.913 9 AJ558125 Papaya leaf curl China virus - [G10] PaLCuCNV [G10] Trung quốc 0.886 0.800 0.901 10 AJ876548 Papaya leaf curl China virus -[G43] PaLCuCNV [G43] Trung quốc 0.891 0.797 0.903 11 AJ849937 Papaya leaf curl China virus -[47] PaLCuCNV [G47] Trung quốc 0.888 0.800 0.901 12 AJ849938S Papaya leaf curl China virus -[G48] PaLCuCNV [G48] Trung quốc 0.891 0.797 0.903 13 AJ849916 Ageratum yellow vein China virus - [G68] AgYLVCNV Trung quốc 0.893 0.797 0.908 14 NC_005321 Papaya leaf curl China virus - [G8] PaLCuCNV [G8] Trung quốc 0.881 0.792 0.898 15 DQ641700 Papaya leaf curl China virus PaLCuCNV Việt Nam 0.888 0.795 0.901 16 AB100304 Tomato leaf curl Java virus TLCJV Indonesia 0.874 0.780 0.883 17 AJ704604 Papaya leaf curl China virus, isolate G22 PaLCuCNV [G22] Trung quốc 0.891 0.802 0.906 18 AB050781 Soybean crinkle leaf virus SCLV Nhật Bản 0.866 0.782 0.883 19 DQ641695 Mimosa yellow leaf curl virus MYLCV Việt Nam 0.891 0.809 0.896 20 AJ965539 Ludwigia yellow vein virus, isolate G37 LYViV Trung quốc 0.782 0.804 0.797
(32)Tiếp Bảng 7
21 DQ641699 Ludwigia yellow vein Vietnam virus LYViVNV Việt Nam 0.790 0.817 0.804 22 NC009547 Sida yellow vein Vietnam virus SiYViVNV Việt Nam 0.807 0.837 0.817 23 AF195782 Tomato leaf curl Lao virus TLCLV Lào 0.802 0.841 0.812 24 EU487040 Tomato leaf curl Philippines virus isolate P118 TLCPV.P118 Philippin 0.800 0.812 0.804 25 AF327436 Tomato leaf curl Malaysia virus TYLCMV Malaysia 0.787 0.829 0.797 26 AJ420319 Squash leaf curl Yunnan virus, isolate Y23 SLCYV.Y23 Trung quốc 0.676 0.706 0.683 27 AY514630 Tomato yellow leaf curl Thailand virus strainChiang Mai TYLCTLV.CM Thái Lan 0.802 0.844 0.809 28 AY514632 Tomato yellow leaf curl Thailand virus strainSakon Nakhon TYLCTLV.SK Thái Lan 0.802 0.844 0.809 29 EF577266 Tomato yellow leaf curl Thailand virus LY3 TYLCTLV.LY3 Thái Lan 0.785 0.839 0.797 30 AF414287 Pepper leaf curl virus PeLCV Malaysia 0.809 0.851 0.814 31 DQ641698 Erectites yellow mosaic virus EYMV Việt Nam 0.832 0.866 0.837 32 DQ866128 Tomato leaf curl Taiwan virus isolate LJC14-2 TLCTV.LJC14-2 Đài Loan 0.780 0.827 0.787
33 AJ851005 Ageratum leaf curl virus -[G52] ALCV.G52 Trung quốc 0.856 0.967 0.864 34 AY602166 Tomato yellow leaf curl Guangdong virus G3 TYLVGDV.G3 Trung quốc 0.824 0.861 0.832 35 AF511529 Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus TYLCKaV Thái Lan 0.753 0.718 0.748 36 DQ641706 Sida leaf curl virus isolate 61 SiLCV Việt Nam 0.735 0.745 0.740 37 DQ641692 Clerodendrum golden mosaic virus CGMV Việt Nam 0.688 0.696 0.693 38 AY795900 Lindernia anagallis yellow vein virus LAYViV Trung quốc 0.708 0.699 0.711 39 AY727903 Corchorus yellow vein Vietnam virus CYViVNV Việt Nam 0.592 0.570 0.595 40 EU636712 Corchorus golden mosaic virus CGMV Ấn Độ 0.597 0.597 0.600
(33)Isolate 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PaLCuCNV.FQ1.TQ [1] ID
PaLCuCNV.F25.TQ [2] 1.000 ID
PaLCuCNV.LC1-2.TQ[3] 0.995 0.995 ID
PaLCuCNV.G4.TQ [4] 0.996 0.996 0.991 ID
PaLCuCNV.G22.TQ [5] 0.979 0.979 0.974 0.975 ID
PaLCuCNV.G2.TQ [6] 0.992 0.992 0.987 0.989 0.976 ID
PaLCuCNV.ZM1.TQ [7] 0.969 0.969 0.964 0.965 0.963 0.969 ID
PaLCuCNV.G30.TQ [8] 0.969 0.969 0.964 0.965 0.963 0.969 0.997 ID
PaLCuCNV.VietNam [9] 0.942 0.942 0.937 0.939 0.953 0.942 0.952 0.952 ID
PaLCuCNV.G8.TQ [10] 0.953 0.953 0.948 0.950 0.962 0.953 0.952 0.952 0.972 ID PaLCuCNV.G10.TQ [11] 0.946 0.946 0.941 0.942 0.954 0.944 0.946 0.946 0.962 0.958 Ghi chú: Số thứ tự từ đến 10 hàng tương ứng với số thứ tự isolate (số ngoặc vuông) cột isolate ID identical (giá trị tương đồng isolate với ln 1)
Bảng 8: Mức tương đồng nucleotide 11 isolate PaLCuCNV (dựa đoạn 819 nts)
(34)(35)(36)Phần IV: Kết luận kiến nghị
(37)1 Điều tra tỉ lệ bệnh.
Kết điều tra cho thấy cà chua nhiễm bệnh vụ thu
đông không cao vùng có sử dụng giống kháng có tỉ lệ bệnh thấp so với vùng không sử dụng giống kháng.
2.Tính đặc hiệu cặp mồi chung cho phân tử DNA-A begomovirus
Cặp mồi chung BegoAFor1 & BegoAReV1 chứng minh có
khả phát begomovirus cà chua các khác.
3.Tính đặc hiệu cặp mồi đặc hiệu ToLCVV TYLCVV
Cả cặp mồi đặc hiệu chứng tỏ khả phát
và phân biệt virus ToLCVV TYLCVNV
(38)4 Lần phát có mặt Ageratum leaf curl virus (ALCV) cà chua Việt Nam.
Dựa kết phân tích mức độ tương đồng phả hệ
chúng phát thấy virus nhiễm mấu số 14 thuộc lồi Ageratum leaf curl virus (ALCV) Tuy nhiên, kết luận chỉ khẳng định giải mã đầy đủ trình tự gen của virus này.
5 Đã phát begomovirus cà chua đu đủ.
Dựa kết so sánh mức độ tương đồng (Bảng 10
Bảng 12) kết phân tích phả hệ (Hình 17, Hình 18) chúng tơi phát begomovirus Dựa vào triệu chứng điển hình nhiễm virus địa điểm thu thập mẫu, theo hướng dẫn cách đặt tên virus thuộc họ
Geminiviridae của ICTV (Fauquet & Stanley (2005)),
(39)4.2 Kiến nghị
1. Tiếp tục giải mã toàn gien AGLV
ToLCGLV đồng thời nghiên cứu đặc điểm sinh học tính gây bệnh, khả lan truyền, phổ ký chủ điều tra để xác định mức độ phổ biến của virus này.
2. Tiếp tục điều tra, thu thập phát
(40)