Nghiên cứu đánh giá đa dạng vi sinh vật, sàng lọc, thu nhận và xác định tính chất của cellulase suối nước nóng bình châu bằng kỹ thuật metagenomics TT

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRẦN THANH THỦY NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG VI SINH VẬT, SÀNG LỌC, THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CỦA CELLULASE SUỐI NƯỚC NĨNG BÌNH CHÂU, VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS Chun ngành: Vi sinh vật học Mã số: 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2021 Cơng trình hồn thành Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Kim Thoa Viện Công nghệ sinh học PGS TS Trần Đình Mấn Viện Cơng nghệ sinh học Phản biện 1: PGS TS Trương Quốc Phong Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Phản biện 2: PGS TS Nguyễn Xuân Cảnh Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 3: PGS TS Bùi Thị Việt Hà Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Luận án bảo vệ Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ Viện Công nghệ sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi …… giờ, ngày … tháng … năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Viện Công nghệ sinh học Webside: http://luanvan.moet.gov.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cellulase nhóm enzyme thủy phân liên kết β-1,4-glucoside phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide số chất tương tự khác Cellulase tổng hợp cổ khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc, động vật nguyên sinh, thực vật động vật Enzyme ứng dụng rộng rãi công nghiệp thực phẩm, lên men rượu, thức ăn gia súc, dệt may, giặt ủi, ngành công nghiệp giấy bột giấy, Khi nguồn nguyên liệu hóa thạch dần cạn kiệt nhu cầu sử dụng nguồn lượng thay thế, tái tạo thân thiện với môi trường ngày tăng Một nguồn lượng thay quan tâm nhiên liệu sinh học từ sinh khối lignocellulose Q trình chuyển hóa lignocellulose thành sản phẩm có giá trị nhiên liệu sinh học, nhựa sinh học, axit hữu cụm hóa chất kiến tạo khác thường thực điều kiện đặc biệt nhiệt độ cao, tiền xử lý kiềm axit dung môi hữu cơ… Do địi hỏi nhà khoa học phải nghiên cứu tìm kiếm cellulase mang đặc tính (như bền với nhiệt độ cao, chịu áp suất cao, chịu pH axit/kiềm, dung môi …) để đáp ứng yêu cầu trình chuyển hóa lignocellulose hạ giá thành sản xuất Một nguồn địa nhiệt thu nhận cellulase bền nhiệt nhóm vi sinh vật ưa nhiệt suối nước nóng Tuy nhiên, sử dụng phương pháp phân lập, nuôi cấy vi sinh vật truyền thống khai thác hết tiềm vật liệu di truyền hệ sinh thái có tới 99% lồi vi sinh vật sống mơi trường lồi khơng ni cấy Hơn nữa, đặc tính riêng hệ sinh thái suối nước nóng có mật độ vi sinh vật thấp nhiều so với mơi trường bình thường khác, việc thu nhận loài vi sinh vật để khai thác nguồn gen chúng phương pháp ni cấy thơng thường gặp nhiều khó khăn Ngày nay, nhờ tiến cơng nghệ giải trình tự gen hệ mới, việc tách dòng gen thực cách tiếp cận sở liệu metagenome kết hợp với phần mềm tin sinh để dự đốn tính chất protein tiềm trước biểu nghiên cứu đặc tính enzyme tái tổ hợp Thơng qua cách tiếp cận này, nhà nghiên cứu không đánh giá mức độ đa dạng vi sinh vật hệ sinh thái mà bảo tồn khai thác gen protein có tính chất đặc biệt từ vi sinh vật Với mong muốn đánh giá đa dạng vi sinh vật, đồng thời tiếp cận khai thác nguồn cellulase bền nhiệt từ suối nước nóng Bình Châu suối nước nóng có nhiệt độ cao thứ hai Việt Nam không thông qua nuôi cấy, tiến hành nghiên cứu, thực đề tài: “Nghiên cứu đánh giá đa dạng vi sinh vật, sàng lọc, thu nhận xác định tính chất cellulase suối nước nóng Bình Châu, Việt Nam kỹ thuật Metagenomics” Mục tiêu nghiên cứu Thơng qua kết giải trình tự DNA metagenome vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu hệ thống giải trình tự gen hệ mới, (i) Đánh giá nguồn đa dạng vi sinh vật ưa nhiệt xây dựng liệu gen mã hóa cho cellulase; ii) Biểu cellulase tái tổ hợp đồng thời (iii) Tinh xác định tính chất cellulase tái tổ hợp Nội dung nghiên cứu - Khai thác liệu giải trình tự DNA metagenome vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu, đánh giá đa dạng vi sinh vật xây dựng liệu gen mã hóa cellulase - Biểu gen mã hóa cho cellulase (endoglucanase β-glucosidase) chịu nhiệt tiềm lựa chọn từ liệu DNA metagenome - Tinh xác định tính chất cellulase tái tổ hợp Những đóng góp luận án - Đã xây dựng liệu DNA metagenome vi khuẩn cổ khuẩn suối nước nóng Bình Châu với kích thước 9,4 Gb độ bao phủ 60% Qua phân tích xác định đa dạng vi sinh vật gen mã hóa enzyme thủy phân cellulose, lựa chọn hai gen (có độ tương đồng thấp 50,35% 53,94%) mã hóa cho hai enzyme tương ứng endoglucanase β-glucosidase - Đã biểu hiện, tinh nghiên cứu tính chất sinh học endoglucanase β-glucosidase Đã xác định Vmax Km hai enzyme Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Về khoa học: - Kết nghiên cứu luận án làm phong phú thêm liệu nhằm bảo tồn nguồn vi sinh vật nguồn gen chúng suối nước nóng Bình Châu Việt Nam - Bổ sung thêm minh chứng hiệu kỹ thuật metagenomics để khai thác đa dạng vi sinh vật gen từ vi sinh vật hệ sinh thái đặc biệt Cụ thể xây dựng liệu đa dạng vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu Bổ sung hai trình tự gen [denovogenes]_18736 mã hóa cho endoglucanase [denovogenes]_32768 mã hóa cho β-glucosidase so với gen cơng bố ngân hàng liệu NCBI giới Hai gen khơng trình tự (mức độ tương đồng < 55%) mà đặc tính (bền nhiệt, bền kiềm) mà phương pháp ni cấy thơng thường khó thu nhận Về ý nghĩa thực tiễn: - Luận án có ý nghĩa thực tiễn Hai enzyme tái tổ hợp thu nhận enzyme quan trọng cocktail enzyme thủy phân sinh khối lignocellulose Hai enzyme có mức độ tương đồng tính chất (cùng có nhiệt độ tối ưu 55ºC, hoạt động dải pH rộng), phối hợp với enzyme khác cocktail để nâng cao hiệu chuyển hóa sinh khối lignocellulose làm nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu sinh học hóa chất kiến tạo khác Bố cục luận án Luận án gồm 144 trang Cụ thể: Mở đầu (2 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (32 trang, bảng, hình); Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (17 trang, hình); Chương 3: Kết nghiên cứu (43 trang, 11 bảng, 34 hình); Chương 4: Bàn luận kết nghiên cứu (16 trang); Kết luận kiến nghị (2 trang); Danh mục cơng trình cơng bố (1 trang); Tóm tắt luận án tiếng Anh (8 trang); Tài liệu tham khảo (23 trang gồm 15 tài liệu tiếng Việt, 185 tài liệu tiếng Anh trang web); Phụ lục (23 trang) CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hiện nay, suối nước nóng nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu lẽ nơi sống vi sinh vật ưa nhiệt (thermophilic) siêu ưa nhiệt (hyperthermophilic) với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu tương ứng 55°C 80°C Enzyme nói chung cellulase nói riêng vi sinh vật sống suối nước nóng có tiềm ứng dụng rộng rãi số quy trình sản xuất cơng nghiệp công nghệ sinh học Tuy nhiên, việc nghiên cứu khu hệ vi sinh vật sống suối nước nóng enzyme chúng phương pháp truyền thống thông qua nuôi cấy khai thác hết tiềm vốn có lẽ có đến 99% vi sinh vật sống suối nước nóng vi sinh vật khơng ni cấy Vì vậy, metagenomics trở thành cơng cụ hữu ích để nghiên cứu vi sinh vật khám phá cellulase từ DNA vi sinh vật suối nước nóng Mặc dù số lượng lớn dịng cellulase phân lập từ thư viện metagenomic số chúng xác định đặc điểm mức độ protein tỷ lệ dịng biểu có hoạt tính thấp Bằng cách giải trình tự metagenomic, vấn đề đưa giải Đồng thời, với phát triển cơng nghệ giải trình tự hệ mới, giải trình tự metagenome trở thành cơng cụ mạnh để nghiên cứu trực tiếp vi sinh vật không nuôi cấy khai thác gen cellulase Ở Việt Nam, tiếp cận metagenome suối nước nóng để khám phá đa dạng vi sinh vật khai thác gen mã hóa cho cellulase chưa cơng bố Với mong muốn tiếp cận đánh giá đa dạng vi sinh vật suối nước nóng tìm kiếm nguồn cellulase có khả bền nhiệt bền điều kiện pH axit/kiềm trình tiền xử lý lignocellulose, nghiên cứu này, suối nước nóng Bình Châu - suối nước nóng có nhiệt độ cao thứ hai Việt Nam chọn làm nguồn thu nhận DNA metagenome để khám phá đa dạng vi sinh vật khai thác gen cellulase CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu - Mẫu nghiên cứu: Mẫu nước mẫu bùn thu thập từ suối nước nóng Bình Châu ngày 14 tháng năm 2015 Mẫu nước lấy trực tiếp từ miệng giếng phun (10º36’03.9’’ Bắc 107º33’30.0’’ Đông) với nhiệt độ 82°C, pH = 7,5 Bùn thu thập vị trí bên ngồi miệng giếng phun, dọc theo dịng chảy (10o37’03.9” Bắc 107o32’30.0” Đơng) với nhiệt độ dao động từ 45 đến 65ºC, pH 7,7 - - Chủng vi khuẩn sử dụng: Escherichia coli TOP10F' (Thermo Fisher Scientific), E coli JM109 (DE3) (Promega) E coli C43 (DE3) (Lucigen) - Gen [denovogenes] _18736 mã hóa cho endoglucanase [denovogenes] _32768 mã hóa cho β-glucosidase - Các vector hóa chất sử dụng: Vectors pJET1.2_18736 pJET1.2_32768 (PhuSa Biochem); Vector pET17b (Novagen); Enzyme cắt giới hạn NdeI HindIII (NEB) T4 DNA ligase (Thermo Fisher Scientific); Các kit tách chiết: Kit PowerWater® DNA Isolation (MO BIO), Kit PowerMax® Soil DNA Isolation (MO BIO), kit tinh PCR (GeneJet PCR purification kit Thermo Fisher Scientific), kit tách chiết plasmid (GeneJet Plasmid Miniprep Kit - Thermo Fisher Scientific); Các hóa chất dùng cho phân tích: Carboxymethyl cellulose (low viscosity, Sigma: C5678), DNSA, glucose, p-nitrophenyl-β-glucopyranoside (pNPG) (Sigma Aldrich), IPTG; hóa chất dùng cho sinh học phân tử, hóa sinh ni cấy vi sinh vật 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tách chiết DNA metagenome giải trình tự: DNA metagenome mẫu nước mẫu bùn suối nước nóng Bình Châu tách chiết Kit theo hướng dẫn nhà sản xuất Sau hai mẫu trộn lại với (theo tỉ lệ 1:1) để tạo thành mẫu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu trước gửi đọc trình tự Công ty BGI Co., Ltd (HongKong) thiết bị giải trình tự Illumina HiSeqTM platform 2.2.2 Các công cụ tin sinh sử dụng xử lý, phân tích liệu giải trình tự DNA metagenome sàng lọc gen mã hóa enzyme thủy phân cellulose tiềm 2.2.3 Thiết kế vector biểu hiện: gen denovogenes_18736 mã hóa cho endoglucanase denovogenes_32768 mã hóa cho β-glucosidase chọn từ liệu DNA metagenome vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu để biểu Hai gen gắn thêm đuôi His - tag đầu C gen tổng hợp, lưu giữ vector tách dịng pJET1.2 Cơng ty Sinh hóa Phù Sa (PhuSa Biochem Co., Ltd) Vector pET-17b chọn làm vector biểu để biểu gen chủng chủ E coli Top10F’ Các plasmid mang gen tạo thành có tên pET17b_18736 pET17b_32768 2.2.4 Lựa chọn số điều kiện biểu gen: Các điều kiện: chủng chủ, mơi trường ni cấy, độ thống khí, nồng độ IPTG nghiên cứu để nâng cao hiệu biểu endoglucanase mã hóa gen denovogenes_18736 β-glucosidase mã hóa denovogenes_32768 Dưới điều kiện lựa chọn, xác định động thái sinh trưởng biểu endoglucanase βglucosidase chủng tái tổ hợp 2.2.5 Xác định hoạt tính enzyme: - Hoạt tính endoglucanase xác định theo phương pháp Ghose (1987), sử dụng CMC làm chất phản ứng Một đơn vị enzyme định nghĩa lượng enzyme cần thiết để tạo μmol glucose phút điều kiện phản ứng - Hoạt tính β-glucosidase xác định theo phương pháp Shi cs (2017), sử dụng p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (p-NPG) làm chất phản ứng Một đơn vị hoạt tính enzyme định nghĩa lượng enzyme cần thiết xúc tác phản ứng để giải phóng mol p- nitrophenyl (p-NP) từ p-NPG thời gian phút điều kiện phản ứng 2.2.6 Tinh sạch, kiểm tra kích thước protein (SDS – PAGE) xác định hoạt tính enzyme (Zymogram): sử dụng cột IMAC – Ni2+ để tinh endoglucanase_18736 β-glucosidase_32768 tái tổ hợp Nồng độ protein xác định theo phương pháp Bradford (1976) Khối lượng phân tử enzyme xác định tương đối SDS-PAGE theo phương pháp Laemmli (1970) Zymogram endoglucanase tiến hành gel polyacrylamide có bổ sung CMC theo phương pháp Sharma Guptasarma (2017) cải tiến Zymogram β-glucosidase tiến hành theo phương pháp Neddersen Elleuche (2015) cải tiến 2.2.7 Nghiên cứu số đặc tính enzyme tái tổ hợp: Một số đặc tính enzyme endoglucanase_18736 β-glucosidase_32768 tái tổ hợp xác định: nhiệt độ, pH tối ưu cho hoạt động enzyme; ảnh hưởng nồng độ ion kim loại lên hoạt tính enzyme; độ bền nhiệt, kiềm enzyme; tính đặc hiệu chất thông số động học enzyme 2.2.8 Xử lý thống kê: Sử dụng Microsoft excel 2016 để xử lý liệu Các kết hiểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn mẫu Giá trị p < 0,05 coi có ý nghĩa thống kê liệu CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Khai thác liệu giải trình tự DNA metagenome vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu, đánh giá đa dạng vi sinh vật xây dựng liệu gen mã hóa cellulase 3.1.1 Tách chiết tinh DNA metagenome vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu Mẫu nước mẫu bùn thu thập từ suối nước nóng Bình Châu sử dụng làm nguyên liệu tách DNA metagenome Kết tách chiết DNA metagenome mẫu nước bùn suối nước nóng Bình Châu cho thấy DNA metagenome mẫu nước mẫu bùn suối nước nóng Bình Châu có chất lượng tốt, DNA khơng bị đứt gãy (Hình 3.1) Hình 3.1 DNA metagenome mẫu nước bùn suối nước nóng Bình Châu Chú thích: M: thang DNA chuẩn kb; 3: DNA metagenome mẫu nước thu lần 2; 4: DNA metagenome mẫu bùn thu lần Kết đo nồng độ DNA metagenome mẫu sau tách chiết máy quang phổ Nano Drop 1000 cho thấy hai mẫu DNA thu có độ tinh cao, tỷ lệ A 260/A280, A260/A230 lớn Lượng DNA metagenome mẫu nước đạt 63,75 ng/µl mẫu bùn đạt 120,9 ng/µl Mẫu DNA thu đảm bảo đủ điều kiện đáp ứng số lượng chất lượng để gửi giải trình tự gen hệ DNA metagenome mẫu nước mẫu bùn trộn lại với theo tỷ lệ 1:1 (v/v) để tạo thành mẫu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu 3.1.2 Khai thác liệu DNA metagenome, đánh giá đa dạng vi sinh vật, xác định tổng hợp gen mã hóa cho enzyme thủy phân cellulose (enzyme chịu kiềm, chịu axit chịu nhiệt) 3.1.2.1 Giải trình tự tiền xử lý liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu gửi đọc trình tự công ty BGI Co., Ltd (HongKong) thiết bị giải trình tự hệ IlluminaHiSeqTM platform Kết giải trình tự thu 10.4 Gb liệu thơ Sử dụng phần mềm Trimmomatic để tinh liệu (loại bỏ trình tự chất lượng kém), kết trình bày Bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết tinh liệu giải trình tự DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu Dữ liệu tinh Q20 (%) Q30 (%) (G) 9,4 94,98 87,97 Số lượng N50 Tỉ lệ lắp contig (bp) ráp (%) 51.346 9.791 65,12 3.1.2.2 Lắp ráp de novo metagenome Dữ liệu DNA metagenome khu hệ vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu lắp ráp phần mềm SOAPdenovo2 để tạo thành contig sử dụng công cụ Quast để đánh giá chất lượng lắp ráp Kết trình bày Bảng 3.2 12 Đầy đủ Thiếu đầu N (5’) Thiếu đầu C (3’) Thiếu < 50 50 - 65 65 - 85 > 85 < 50 50 - 65 65 - 85 < 50 50 - 65 65 - 85 65 - 85 0 1 0 0 0 1 12 4 22 15 5 32 47 82 đầu: N (5’) C (3’) Tổng Ghi chú: a so với sở liệu non-redundant (nr) protein NCBI Trong 47 trình tự ORF hồn thiện có 15 ORF mã hóa cho endoglucanase, ORF mã hóa cho exoglucanase 31 ORF mã hóa cho β-glucosidase Các trình tự chủ yếu trình tự chưa có giải nguồn gốc tiến hóa (NANo Annotation), chưa phân loại dựa vào sở liệu NCBI Đồng thời, phát sinh chủng loại ORF cho thấy trình tự mã hóa cho endoglucanase chủ yếu thuộc họ GH5, GH6 GH8 Các trình tự mã hóa cho β-glucosidase chủ yếu thuộc họ GH1 GH3 Đây hai họ GH phổ biến cho enzyme thủy phân cellulose Xét đặc điểm tiến hóa, ORF mã hóa cho cellulase đa dạng nguồn gốc tiến hóa 3.1.2.6 Phân tích số tính chất enzyme mã hóa từ gen liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu để lựa chọn gen tiềm cho trình biểu Với mục tiêu tiếp cận để khai thác enzyme có tính chất bền nhiệt (có số Tm cao), có khả chịu kiềm chịu axit, công cụ tin sinh sử dụng để dự đốn tính bền nhiệt tính chịu kiềm, chịu axit protein Kết trình bày hình 3.4 13 A B Hình 3.4 Dự đốn tính chất protein tham gia vào trình thủy phân cellulose mã hóa gen liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu A) Dự đốn Tm enzyme; B) Dự đốn tính kiềm/ axit enzyme Với mục tiêu tiếp cận nguồn gen từ vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu mã hóa cho cellulase có tính chất đặc biệt, kết hợp với sở phân tích trên, gen đích lựa chọn để phân lập tổng hợp phải thỏa mãn đồng thời tiêu chí sau: - Là ORF hồn chỉnh có độ dài khoảng 1200 – 1600 bp liệu gen mã hóa cho enzyme thủy phân cellulose - Là ORF mã hóa cho enzyme có độ tương đồng nằm khoảng từ 50 đến 70% so với enzyme cellulase sở liệu NCBI - Là ORF có số dự đoán Tm ≥ 55C - Là ORF dự đốn có tính chất kiềm axit tính Bộ liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu gồm 47 ORF hồn chỉnh mã hóa cho cellulase, có ORF đáp ứng tiêu chí lựa chọn Tuy nhiên, chọn ORF có mã số: [denovogenes]_18736 mã hóa cho endoglucanase [denovogenes]_32768 mã hóa cho β-glucosidase để tổng hợp nhân tạo vector tách dịng pJET1.2 (pJET1.2_18736 pJET1.2_32768) cơng ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa (Việt Nam) lý sau: i) suối 14 nước nóng Bình Châu suối nước nóng kiềm endoglucanase mã hóa [denovogenes]_18736 lại dự đốn với tính chất axit Hơn nữa, endoglucanase ORF thuộc họ GH6 có khoảng cách di truyền tiến hóa cách xa so với trình tự cịn lại, có nhiệt độ nóng chảy theo tính tốn lý thuyết ≥ 65ºC, có tính chất chưa khai thác ii) số ORF mã hóa cho β-glucosidase, ORF có mã số [denovogenes]_32768 có tính chất kiềm độ hịa tan cao nhất, ORF [denovogenes]_31089 có tính axit yếu cịn ORF [denovogenes]_23970 có tính kiềm mức độ hịa tan thấp Hai gen chọn có đặc điểm mơ tả bảng 3.4 Trình tự nucleotide gen [denovogenes]_18736 [denovogenes]_32768 đăng ký Ngân hàng Gen với mã số QAU55420.1 QAU55422.1 Bảng 3.4 Đặc điểm ORF có mã số [denovogenes]_18736 ORF có mã số [denovogenes]_32768 chọn Mã số gen Chiều Độ tương đồng Dự Dự đốn Chỉ số hịa % dài gen (%) đốn tính chất tan GC Tm Kiềm/ Axit protein Axit 0,99 0,429 56,4 Kiềm 0,83 0,242 54 (bp) 50,35% với endoglucanase [bacterium JGI [denovogenes 053], mã số ]_18736 Mã hóa cho 1.506 endoglucanas SOD03652.1; ≥ 49,31% với 65ºC endoglucanase e [Polyangium fumosum], mã số WP_136936398.1 [denovogenes 53,94% với Beta- 55ºC ]_32768 1.224 glucosidase A ~ Mã hóa cho [nhóm vi khuẩn 65ºC β-glucosidase Parcubacteria], mã số 15 KKT80126.1 3.1.2.7 Phân tích mơ hình cấu trúc [denovogenes]_18736 [denovogenes]_32768 Gen denovogenes_18736 dự đốn có tâm hoạt động nằm vị trí axit amin D299 gen denovogenes_32768 khơng xác định vị trí tâm hoạt động Đồng thời, hai gen dự đốn khơng có trình tự đoạn peptide tín hiệu Gen denovogenes_18736 dự đốn có domain domain xúc tác thuộc họ GH6 nằm vị trí axit amin Q236-G483 Mơ hình cấu trúc 3D denovogenes_18736 xây dựng dựa khuôn cellulase Cel6 (mã số 1up3.1.A) với đặc trưng tâm hoạt động hình khe hở, trạng thái monomer - A, khơng có phối tử (Hình 3.5a Hình 3.5b) Tương tự, gen denovogenes_32768 dự đốn có domain domain xúc tác domain lại thuộc họ GH1 nằm vị trí axit amin E2-E407 Mơ hình cấu trúc 3D denovogenes_32768 xây dựng dựa khuôn β-glucosidase (mã số 1vff.1.A) với đặc trưng tâm hoạt động hình túi, trạng thái monomer, khơng có Ligands (Hình 3.5c Hình 3.5d) a b c d Hình 3.5 Mơ hình cấu trúc protein 3D xây dựng phần mềm Swissmodel ExPASy a) Cấu trúc endoglucanase_18736 dựa theo khn mơ hình cấu trúc cellulase Cel6 giả định (1up3.1.A); b) Cấu trúc khuôn cellulase Cel6 giả định (1up3.1.A); c) Cấu trúc βglucosidase_32768 dựa theo khuôn mơ hình cấu trúc β-glucosidase (1vff.1.A); d) Cấu trúc β-glucosidase khuôn (1vff.1.A) 16 3.1.2.8 Truy cứu nguồn gốc gen denovogenes_18736 denovogenes_32768 Sử dụng công cụ Blast – Explorer địa http://www.phylogeny.fr/ (để xác định nguồn gốc gen [denovogenes]_18736 [denovogenes]_32768 Kết cho thấy hai gen gen mới, không xác định nguồn gốc Đồng thời, kết phù hợp với kết phân loại: hai gen gen chưa phân loại khơng có sở liệu phù hợp để so sánh 3.2 Biểu gen [denovogenes]_18736 [denovogenes]_32768 3.2.1 Thiết kế vector biểu gen [denovogenes]_18736 [denovogenes]_32768 E coli Vector pET17b (Novagen) lựa chọn làm vector biểu gen [denovogenes]_18736 [denovogenes]_32768 Sau khuếch đại ORF xử lý với HindIII NdeI, ORF lại ghép nối vào vector pET17b mở vịng vị trí enzyme giới hạn tương ứng Sản phẩm ghép nối biến nạp vào E coli TOP10F’ để nhân dòng trước kiểm tra lại cách cắt vector tái tổ hợp HindIII NdeI Kết điện di đồ sản phẩm cắt cho thấy gắn thành công gen [denovogenes]_18736 [denovogenes]_32768 vào vector pET17b (Hình 3.6) Các dịng plasmid sau gửi đọc trình tự để đảm bảo codon dịch mã từ promoter đến mã khởi đầu 17 Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pET17b mang đoạn gen ngoại lai hai enzyme giới hạn HindIII NdeI Chú thích: 1) gen [denovogenes]_18736 có kích thước 1506 bp; M) Marker DNA 1kb 2) gen [denovogenes]_32768 có kích thước 1224 bp Vector pET17b có kích thước 3306 bp 3.2.2 Lựa chọn số điều kiện biểu gen [denovogenes]_18736 [denovogenes]_32768 E coli Các plasmid pET17b mang đoạn gen ngoại lai [denovogenes]_18736 mã hóa cho endoglucanase [denovogenes]_32768 mã hóa cho β-glucosidase biểu tốt chủng chủ E coli C43(DE3) (Lucigen) Enzyme tái tổ hợp biểu tốt môi trường TB với thể tích dịch ni cấy chiếm 20% so với thể tích bình nồng độ IPTG cảm ứng 0,25mM (Hình 3.7, 3.8, 3.9) Hình 3.7 Ảnh hưởng chủng chủ lên trình sinh trưởng biểu enzyme tái tổ hợp A Endoglucanase; B β-glucosidase Hình 3.8 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng hoạt tính enzyme chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp A Endoglucanase; B β-glucosidase 18 A B Hình 3.9 Ảnh hưởng nồng độ IPTG lên sinh trưởng hoạt tính enzyme chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp A Endoglucanase; B β-glucosidase 3.2.3 Động thái sinh trưởng biểu endoglucanase β-glucosidase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp Dưới điều kiện nuôi cấy lựa chọn trên, trình sinh trưởng, biểu endoglucanase β-glucosidase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp vào pha cân sau 42-48 nuôi cấy, sinh tổng hợp endoglucanase đạt 1,92-1,98 U/ml (Hình 3.10A), sinh tổng hợp β-glucosidase đạt 0,33-0,34 U/mL (Hình 3.10B) 19 A B Hình 3.10 Động thái sinh trưởng sinh enzyme chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp A) Endoglucanase; B) β-glucosidase 3.3 Tinh xác định tính chất cellulase tái tổ hợp 3.3.1 Tinh enzyme tái tổ hợp Dịch enzyme tái tổ hợp thơ có gắn His-tag tinh cột sắc ký IMAC-Ni2+ Enzyme endoglucanase_18736 β-glucosidase_32768 tái tổ hợp sau tinh xuất băng có kích thước tương ứng khoảng 55 kDa (Hình 3.11A hình 3.11B) 50 kDa (Hình 3.11C hình 3.11D) Hiệu suất tinh endoglucanase_18736 β-glucosidase_32768 đạt 80%, mức độ tinh tăng từ 5,2-5,6 lần so với dịch enzyme thơ (Bảng 3.5) Hình 3.11 Điện di đồ SDS-PAGE Chú thích: (A) Endoglucanse tái tổ hợp: 1) Vector O ; M: protein ladder (10-250 kDa); 2) Dịch phá tế bào trước cảm ứng; 3) Dịch sau ly tâm dịch lên men; 4) Dịch enzyme thô; 5) enzyme tinh cột IMAC-Ni2+; (B) Zymogram endoglucanase tái tổ hợp; (C) β-glucosidase tái tổ hợp: M) thang protein chuẩn (10-250 20 kDa); 1) Dịch enzyme thô; 2) protein sau tinh cột IMAC-Ni2+; (D) Zymogram β-glucosidase tái tổ hợp Bảng 3.5 Kết tinh endoglucanase_18736 β-glucosidase_32768 tái tổ hợp cột IMAC-Ni 2+ Chú thích: Egl: Endoglucanase tái tổ hợp; Bgl: β-glucosidase tái tổ hợp 3.3.2 N g h i ê n c ứ u m ộ t s ố đ ặ c t í n h c ủ a e n d o g l u c a n a s e _ β-glucosidase_32768 tái tổ hợp 3.3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính enzyme tái tổ hợp Cả endoglucanase_18736 β-glucosidase_32768 hoạt động tối ưu nhiệt độ 55C endoglucanase có xu hướng hoạt động tốt khoảng nhiệt độ từ 55 - 60C; β-glucosidase lại hoạt động tốt khoảng nhiệt độ thấp từ 50 - 55C 3.3.2.2 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính enzyme tái tổ hợp Cả hai enzyme tái tổ hợp có khả hoạt động dải pH rộng từ axit đến kiềm Tuy nhiên, endoglucanase tái tổ hợp có phổ pH rộng βglucosidase tái tổ hợp Endoglucanase_18736 hoạt động tốt dải pH 3-10 Trong β-glucosidase_32768 hoạt động tốt dải pH 4-9 Endoglucanase_18736 hoạt động tốt phản ứng môi trường đệm Tris 0,1 M, pH 10 (Hình 3.12A); cịn β-glucosidase_32768 hoạt động tốt phản ứng môi trường đệm Tris 0,05 M, pH 8,5 (Hình 3.12B) 21 Hình 3.12 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính endoglucanse_18736 (A) β-glucosidase_32768 (B) Chú thích: pH: 3-6 (đệm citrate); pH: 7-10 (đệm tris); pH: 11-12 (đệm Na2HPO4) 3.3.2.3 Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính enzyme tái tổ hợp Endoglucanase_18736 β-glucosidase_32768 bị ảnh hưởng ion kim loại Ở nồng độ mM ion kim loại, mức độ ảnh hưởng cụ thể: Đối với endoglucanase_18736: Ca 2+ Na+ có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme Các ion cịn lại làm giảm (K +, Mn2+, Fe2+, Li+, Co2+, Zn2+, Mg2+, Fe3+) làm hồn tồn hoạt tính enzyme (Ag +, Cu2+) Thứ tự ảnh hưởng ion kim loại theo chiều hướng làm tăng hoạt tính enzyme biểu diễn sau: Ag+< Cu2+< Zn2+< Co2+< Mn2+< Fe3+< Fe2+< Mg2+< Li+< K+< Na+< Ca2+ (Hình 3.13A) Đối với β-glucosidase tái tổ hợp: K+, Mn2+, Fe2+, Li+, Mg2+, Fe3+, Ca2+ Na+ có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme; Cu2+, Zn2+ Co2+ lại làm giảm hoạt tính mạnh đến mức gần làm hoàn toàn hoạt tính enzyme Thứ tự ảnh hưởng ion kim loại theo chiều hướng làm tăng hoạt tính enzyme biểu diễn sau: Cu2+< Co2+