Nghiên cứu đánh giá đa dạng vi sinh vật, sàng lọc, thu nhận và xác định tính chất của cellulase suối nước nóng bình châu bằng kỹ thuật metagenomics

viện hàn lâm khoa học công nghệ việt nam viƯn c«ng nghƯ sinh häc TRẦN THANH THỦY NGHI£N CøU đánh giá đa dạng vi sinh vật, SàNG LọC, THU NHậN Và XáC ĐịNH TíNH CHấT CủA CELLULASE SUốI NƯớC NóNG bình châu, VIệT NAM kỹ thuật metagenomicS luận ¸n tiÕn sÜ sinh häc Hµ néi - 2021 viƯn hàn lâm khoa học công nghệ việt nam viện công nghệ sinh học TRN THANH THY NGHIÊN CứU đánh giá đa dạng vi sinh vật, SàNG LọC, THU NHậN Và XáC ĐịNH TíNH CHấT CủA CELLULASE SUốI NƯớC NóNG bình châu, VIệT NAM kỹ thuật metagenomicS Chuyên ngành : Vi sinh vËt häc M· sè : 42 01 07 luËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Kim Thoa Viện Công nghệ sinh học PGS TS Trần Đình Mấn Viện Cơng nghệ sinh học Hµ néi - 2021 LỜI CẢM ƠN Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Kim Thoa PGS TS Trần Đình Mấn, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam – người thầy tận tình bảo, hướng dẫn, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Cơng nghệ sinh học, phịng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen, phịng Cơng nghệ Vật liệu sinh học, cán sở đào tạo thuộc Viện Cơng nghệ sinh học, phịng Hệ gen học chức thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất, máy móc, trang thiết bị thủ tục cần thiết để tơi hồn thành luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn tới đồng nghiệp tham gia đề tài ĐTĐLCN.15/14, chú, anh, chị, em cán phịng Cơng nghệ Vật liệu sinh học giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình thực luận án Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, người thân ln bên cạnh chia sẻ, động viên, khích lệ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi mặt để tơi tập trung, n tâm học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả Trần Thanh Thủy i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chun ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày … tháng … năm 2021 Tác giả Trần Thanh Thủy ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG x DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ xi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khu hệ vi sinh vật suối nước nóng 1.2 Cellulase .6 1.2.1 Phân loại 1.2.2 Đặc điểm hóa sinh 1.2.3 Ứng dụng công nghệ sinh học cellulase ưa nhiệt 21 1.3 Metagenomics nghiên cứu đa dạng vi sinh vật khai thác gen 21 1.3.1 Các phương pháp khai thác gen kỹ thuật Metagenomics .22 1.3.2 Phương pháp đánh giá đa dạng vi sinh vật từ liệu giải trình tự DNA metagenome 26 1.3.3 Ứng dụng kỹ thuật Metagenomics để đánh giá đa dạng vi sinh vật khai thác gen mã hóa cho enzyme 28 1.3.4 Tình hình ứng dụng metagenomics vào nghiên cứu đa dạng vi sinh vật khai thác gen mã hóa cho cellulase Việt Nam 32 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .35 2.1 Vật liệu 35 2.1.1 Vi sinh vật 35 iii 2.1.2 Vector 35 2.1.3 Cặp mồi sử dụng 35 2.1.4 Gen nghiên cứu 36 2.1.5 Các hóa chất sử dụng 36 2.1.6 Môi trường nuôi cấy .36 2.2 Máy móc thiết bị 36 2.3 Phương pháp nghiên cứu 36 2.3.1 Tách chiết DNA metagenome mẫu suối nước nóng Bình Châu 36 2.3.2 Giải trình tự DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu .37 2.3.3 Các phương pháp tin sinh 38 2.3.4 Khuếch đại gen endoglucanase_18736 β-glucosidase_32768 40 2.3.5 Tạo vector biểu pET-17b gắn đoạn gen endoglucanase_18736/ β-glucosidase_32768 41 2.3.6 Biến nạp vector biểu pET-17b chứa đoạn gen endoglucanase_18736/ β-glucosidase_32768 vào E coli TOP10F’ phương pháp xung điện 42 2.3.7 Chọn lọc dòng E coli mang vector pET17b-18736/ pET17b-32768 43 2.3.8 Tạo chủng E coli tái tổ hợp mang vector pET-17b_18736 pET-17b_32768 43 2.3.9 Biểu gen denovogenes_18736 denovogenes_32768 .44 2.3.10 Xác định trọng lượng sinh khối khô .44 2.3.11 Phương pháp thu nhận enzyme thô 44 2.3.12 Phương pháp xác định hoạt tính endoglucanase 45 2.3.13 Phương pháp xác định hoạt tính -glucosidase 45 iv 2.3.14 Ảnh hưởng số yếu tố lên mức độ biểu endoglucanase_18736 β-glucanase_32768 46 2.3.15 Động thái sinh trưởng sinh endoglucanase, β-glucosidase tái tổ hợp .47 2.3.16 Tinh endoglucanase β-glucosidase tái tổ hợp 47 2.3.17 Định lượng protein tổng số 48 2.3.18 Điện di protein SDS-PAGE 48 2.3.19 Kiểm tra hoạt tính endoglucanase Zymogram (Điện di protein gel polyacrylamide có chứa chất CMC) 49 2.3.20 Kiểm tra hoạt tính β-glucosidase Zymogram 50 2.3.21 Nghiên cứu số đặc tính enzyme tái tổ hợp .50 2.3.22 Xử lý thống kê .51 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 52 3.1 Khai thác liệu giải trình tự DNA metagenome vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu, đánh giá đa dạng vi sinh vật xây dựng liệu gen mã hóa cho cellulase 52 3.1.1 Tách chiết tinh DNA metagenome vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu 52 3.1.2 Khai thác liệu DNA metagenome, đánh giá đa dạng vi sinh vật, xác định tổng hợp gen mã hóa cho enzyme thủy phân cellulose (enzyme chịu kiềm, chịu axit chịu nhiệt) 54 3.2 Biểu gen [denovogenes]_18736 [denovogenes]_32768 .74 3.2.1 Thiết kế vector biểu gen [denovogenes]_18736 [denovogenes]_32768 E coli .74 3.2.2 Lựa chọn số điều kiện biểu gen [denovogenes]_18736 [denovogenes]_32768 E coli .75 v 3.2.3 Động thái sinh trưởng biểu endoglucanase β-glucosidase chủng E coli C43(DE3) tái tổ hợp 82 3.3 Tinh xác định tính chất cellulase tái tổ hợp 83 3.3.1 Tinh enzyme tái tổ hợp 83 3.3.2 N g h i ê n c ứ u mộ t s ố đ ặ c t í n h c ủ a e n g l u c a n a s e _ v β - g l u c o s i d a s e _ 27 t i t ổ h ợ p 85 CHƯƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 95 4.1 Đa dạng vi sinh vật tiềm khai thác gen mã hóa cho cellulase suối nước nóng Bình Châu thơng qua cách tiếp cận không phụ thuộc vào nuôi cấy 95 4.1.1 Đa dạng vi sinh vật .95 4.1.2 Tiềm khai thác gen mã hóa cho cellulase 99 4.2 Mối liên hệ mô hình cấu trúc với đặc điểm endoglucanase_18736 β-glucosidase_32768 104 4.2.1 Phân tích main ch ức c endoglucana se_18 736 β-glucos idase _3 2768 .104 4.2.2 Mơ hình cấu trúc 3D endoglucanase_18736 β-glucosidase_32768 tái tổ hợp 104 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 111 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 113 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO 122 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt APS Ammonium persulfate Ammonium persulfate BGI Beijing Genomics Institute Viện nghiên cứu hệ gen Bắc Kinh BLAST Basic Local Alignment Công cụ tìm kiếm trình tự tương Search Tool đồng trực tuyến NCBI Bp Base pair Cặp base BSA Bovine serum albumin Albumin huyết bò CAZy Carbohydrate – Active Enzyme thủy phân carbohydrate enzymes CBMs hay Carbohydrate Binding Module/Vùng liên kết với CBD modules/Domains carbohydrate CD Catalytic domain Vùng xúc tác CEs Carbohydrate esterases Carbohydrate esterases CMC Carboxymethyl cellulose Carboxymethyl cellulose Cơ sở liệu CSDL dH2O Deionized water Nước deion DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic DNSA 3,5-Dinitrosalicylic acid Axit 3,5-Dinitrosalicylic dNTP 2’ – deoxyribonucleoside 2’ – deoxyribonucleoside 5’ - 5’ – triphosphate triphosphate 1,2-bis 1,2-bis (diphenylphosphino) ethylene DPPE (diphenylphosphino) ethylene EBI European Bioinformatics Viện nghiên cứu tin sinh Châu Âu Institute EDTA Ethylene diamine tetra Axit ethylene diamine tetra acetic acetic acid vii EMBL ExPASY European Molecular Phòng thí nghiệm sinh học phân tử Biology Laboratory Châu Âu Expert Protein Analysis Hệ thống chuyên phân tích protein System GH Glycoside hydrolase Họ enzyme thủy phân glycoside GTs Glycosyl transferases Glycosyl transferases HTS High throughput Giải trình tự thơng lượng cao Sequencing IPTG Kb Isopropyl β- D-1- Isopropyl β- D-1- thiogalactopyranoside thiogalactopyranoside Kilo base Đơn vị đo kích thước axit nucleic KDa Kilo Dalton Đơn vị đo kích thước protein KEGG Kyoto Encyclopedia of Cơ sở liệu gen hệ gen Genes and Genomes Kyoto Km Michaelis constants Hằng số Michaelis LB Luria-Bertani Môi trường Luria-Bertani (LB) MEGAN MEtaGenomic ANalyser Phần mềm phân tích trình tự đa hệ gen NB Nutrient broth Môi trường Nutrient broth (NB) NCBI National Center for Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh Biotechnology Information học quốc gia (Mỹ) Next Generation Giải trình tự gen hệ NGS Sequencing NR Non - Redundant Cơ sở liệu chứa trình tự không dư thừa NCBI ORF Open Reading Frame Khung đọc mở PBS Phosphate – Buffered Đệm muối phosphate saline PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng trùng hợp chuỗi viii Phụ lục 10 Chỉ tiêu hóa lý mẫu nước thu nhận từ suối nước nóng Bình Châu TT Chỉ tiêu phân tích Ký hiệu Đơn vị tính Kết phân tích Độ đục SiO2 mg/L 1,45 Mùi Cặn không tan Cặn sấy khô M Độ pH pH Độ cứng CaO mg/L 259 Clorua Cl- mg/L 1,885 Nitrate NO3- mg/L 0,4 Nitrite NO2- mg/L 0,001 10 Amoni NH4+ mg/L 0,01 11 Hydrosulfua H2 S mg/L 0,37 13 Asen As mg/L 0,001 14 Đồng Cu mg/L 0,05 15 Kẽm Zn mg/L 0,04 16 Sắt Fe mg/L 0,05 17 Fluor F mg/L 2,84 18 Iodine I mg/L 0,061 19 Phosphate PO43- mg/L - 20 Sulphate SO42- mg/L 368 21 Mangan Mn mg/L 0,09 22 Magie Mg Thối, mặn mg/L 3,8 mg/L 2,18 7,5 7,59 Phụ lục 11 Kết dự đoán tâm hoạt động denovogenes_18736 10 Phụ lục 12 So sánh trình tự axit amin domain xúc tác gen denovogenes_18736 với trình tự axit amin mơ hình domain xúc tác 1up3.1.A Phụ lục 13 Kích thước axit amin mơ hình cấu trúc protein denovogenes_18736 Chú thích: axit amin có màu xanh nhạt → đỏ: axit amin có kích thước bé → lớn 11 Phụ lục 14 Đánh giá tính kỵ nước axit amin cấu trúc bậc bậc denovogenes_18736 Chú thích: axit amin có màu xanh lam→ đỏ: kỵ nước → kỵ nước Phụ lục 15 Vị trí axit amin phân cực (màu xanh tím) cấu trúc protein denovogenes_18736 12 Phụ lục 16 Vị trí axit amin Cystein cấu trúc bậc bậc (màu vàng) denovogenes_18736 Phụ lục 17 Vị trí proline cấu trúc bậc bậc (màu xanh tím) denovogenes_18736 13 Phụ lục 18 Vị trí axit amin deletions mơ hình (màu xanh tím) cấu trúc protein denovogenes_18736 Phụ lục 19 Vị trí khả tích điện -, + axit amin cấu trúc protein denovogenes_18736 Chú thích: ED màu hồng: tích điện âm; HKR màu xanh tím: tích điện dương 14 Phụ lục 20 Vị trí aliphatic (màu xanh tím) cấu trúc protein denovogenes_18736 Phụ lục 21 Vị trí aromatic (màu xanh tím) cấu trúc protein denovogenes_18736 15 Phụ lục 22 Kết dự đoán cầu disulfide Cys cấu trúc denovogenes_18736 10 20 30 40 50 60 70 AA MLPQVAEAATRTESANNTVLVAGQTGSIVDDRLNVWTIVNGVVKKNGANAGYSARVIQLAYVNDVVWQENADHLWWSWN DB_state DB_conf 80 90 100 .110 .120 .130 .140 .150 AA GSSWDGGWGIPTSPLPQNVSSPSNNTSLTESANNSVLLAGQTGSLVDRQKDVWTIVNGVVKKNNVSAGYSARVIQLAYV DB_state DB_conf 160 .170 .180 .190 .200 .210 .220 .230 AA NGVIWQENADHLWWSWNGSSWDGGWGIPTSPLSTAVTAPAPQPQPEPEPAPAPAPTNSSNPFAGQTLYRSSWSNALNQA DB_state DB_conf + -| 240 .250 .260 .270 .280 .290 .300 .310 AA NAWRSTRPDDAAKMDYLAAQPTARWFGDWNANIQSDVSAYVGEAAAANALPVLVLYNIPFRDCGSYSAGGAGSASGYHD DB_state DB_conf + | 320 .330 .340 .350 .360 .370 .380 .390 AA WIVKVAEGIGTRKAMIVLEPDATSLDCFDDTRAAMLADAVNVLEAKPNVAVYIDAGHPDWVPAATMATRLQKSGIQNAQ DB_state DB_conf + -| 400 .410 .420 .430 .440 .450 .460 .470 AA GMALNVSNFYSTDSNMAYGNDLSSRLGGKHYIIDTARNHNGWQGEWCNPQGAGIGKAPTTNTGSALFDAGLWIKPPGES DB_state DB_conf -+ | .480 .490 .500 AA DGPCNGGPGAGSWWADYALKLYNQGTH 16 DB_state DB_conf DB_bond bond(300,343) DB_bond bond(442,478) Conn_conf 0.913818 Chú thích: AA: Trình tự axit amin; DB_state: dự đoán trạng thái liên kết disulfide (1 = liên kết disulfide, = khơng có liên kết disulfide); DB_conf: độ tin cậy dự đoán trạng thái liên kết disulfide (0 = thấp đến = cao); DB_bond: vị trí theo trình tự cặp cystein dự đoán tạo thành cầu nối disulfide; Conn_conf: độ tin cậy việc gán kết nối đưa trạng thái liên kết disulfide dự đoán (giá trị thực [0,1]) Phụ lục 23 Vị trí Ser/Thr (màu xanh tím) cấu trúc protein denovogenes_18736 17 Phụ lục 24 Kích thước axit amin mơ hình cấu trúc denovogenes_32768 Chú thích: axit amin có màu xanh nhạt → đỏ: axit amin có kích thước bé → lớn Phụ lục 25 Đánh giá tính kỵ nước axit amin cấu trúc bậc bậc denovogenes_32768 Chú thích: axit amin có màu xanh lam→ đỏ: kỵ nước → kỵ nước 18 Phụ lục 26 Vị trí axit amin phân cực (màu xanh tím) cấu trúc denovogenes_32768 Phụ lục 27 Vị trí axit amin Cystein cấu trúc bậc bậc (màu vàng) denovogenes_32768 19 Phụ lục 28 Vị trí Ser/Thr cấu trúc (màu xanh tím) denovogenes_32768 Phụ lục 29 Vị trí proline (màu xanh tím) cấu trúc bậc bậc denovogenes_32768 20 Phụ lục 30 Vị trí axit amin deletions (màu xanh tím) mơ hình cấu trúc denovogenes_32768 Phụ lục 31 Vị trí khả tích điện -, + axit amin cấu trúc denovogenes_32768 Chú thích: ED màu hồng: tích điện âm; HKR màu xanh tím: tích điện dương 21 Phụ lục 32 Vị trí aliphatic (màu xanh tím) cấu trúc denovogenes_32768 Phụ lục 33 Vị trí aromatic (màu xanh tím) cấu trúc denovogenes_32768 22 Phụ lục 34 So sánh trình tự axit amin domain xúc tác gen denovogenes_32768 với trình tự axit amin mơ hình domain xúc tác 1vff.1.A Phụ lục 35 Sự khác biệt trình tự axit amin denovogenes_32768 (query 23187) Cen502 (query 23189) Query_23187 MEKK FPEGFYWGAXIT AMIN TSSFQTEGGIENI -DWAKGAREGRVPPIGNACDFYNRYESDFDIAIELG -HNCHRI 68 Query_23189 MKKLCLLAGVYMWGTATAXIT AMIN LQIEGAKKLCLLVPGGWKTVLDLGDVCPKACVCVQRRQRQCSLRQLSSLPSRYGVHLPTRL 80 Query_23187 69 SI EWARIEPEEGKFDEKEIEHYLQVLAXIT AMIN MRKRHI-KPFITIWHFSLPQWFADKGGFEHRDSPEIFARY 135 Query_23189 81 SYISFRGLLATYIPTWCTWSQSRG IGRIIIVKLI CLNDNIGLPFSTLYDRVLPQPLQLAVGWGNPPRIQAFVQF Query_23187 136 CGYVAQKLGNDCRHFATINEALP YTTNGWIRGSWPPFKEVPGLGWSLSHIPGHMPITMDTRWKNVLLYFRVRKNLARA 213 Query_23189 155 AETMFREFHGKIQHWHSFNEPWCTIAFVIQYVNGSCPGSDLSPDCDC -CRTSSWLA 209 Query_23187 214 HNLAYDEIKKHAFGAEVGIVHQIILFHANSNPLNQALAGCMNWFWTHSFI 263 Query_23189 210 HGLSVRRFRVLGTSGDSGIAPNVSWAVPYWHSEVDKAXIT AMIN CARTISLHSGLFLQPIFQGTIPQFLVDWFALQGGTVPIQDGD Query_23187 264 -RRVYQKCDSIGINYYLHKKFGDTAT YRKTDMNWDFYPEGICGALLMMKRYGR-PLWVAEAGIADEDD 329 Query_23189 290 MEYIGEPIDMIGINYYSMSVNRFNPVAPFLQSEEINMPLPLTDIGWPLVARAVYEVLHYLQKYGNIDIYFTENGACYNHE 369 Query_23187 330 -DQRAEYITKLIHGMWTAIQSGVDLRGYMYWSLLDNYELAHGYTKRFGLVEVNFETQERNIRPSAYVYKRII 400 Query_23189 370 VVKRAKVQVDRRISKLQQHFQLVQRTIHDRLHVKGYMACSLLDNFLRAEGYKMTFGMIVVDFRTQVRTGLESYYWYGNVL 449 Query_23187 401 ENNGLVE - 407 Query_23189 450 SNNWLETRPQSFELLG 465 23 154 289 .. .vi? ??n hàn lâm khoa học công nghệ vi? ??t nam vi? ?n c«ng nghƯ sinh häc TRẦN THANH THỦY NGHI£N CøU đánh giá đa dạng vi sinh vật, SàNG LọC, THU NHậN Và XáC ĐịNH TíNH CHấT CủA CELLULASE SUốI NƯớC NóNG. .. dạng vi sinh vật, sàng lọc, thu nhận xác định tính chất cellulase suối nước nóng Bình Châu, Vi? ??t Nam kỹ thu? ??t Metagenomics? ?? MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Thơng qua kết giải trình tự DNA metagenome vi sinh. .. này, nhà nghiên cứu không đánh giá mức độ đa dạng vi sinh vật hệ sinh thái mà bảo tồn khai thác gen protein có tính chất đặc biệt từ vi sinh vật Với mong muốn đánh giá đa dạng vi sinh vật, đồng