Luận án tiến sĩ nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây chóc máu (salasia chinensis l )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - TRẦN THỊ MINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT NGÀNH : HÓA HỮU CƠ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY CHÓC MÁU (SALACIA CHINENSIS L.) HỌ DÂY GỐI (CELASTRACEAE) VÀ CÂY NGỌC NỮ BIỂN (CLERODENDRUM INERME GAERTN.) HỌ CỎ ROI NGỰA (VERBENACEAE) LÊ THỊ HỒNG MINH Người hướng dẫn khoa học: GS.TSKH Trần Văn Sung PGS TS Vũ Đào Thắng HÀ NỘI - 2010 MỤC LỤC ðẶT VẤN ðỀ Chương I: TỔNG QUAN 1.1 Cây Chóc máu (Salacia chinensis L.) 1.1.1 ðặc ñiểm thực vật 1.1.2 Hoạt tính sinh học ứng dụng y học cổ truyền 1.1.3 Vài nét tình hình nghiên cứu Chóc máu (Salacia chinensis L.) 1.1.4 Các hợp chất triterpen 10 1.1.4.1 Triterpen mạch thẳng 11 1.1.4.2 Triterpen khung hopan 12 1.1.4.3 Triterpen khung lupan 13 1.1.4.4 Triterpen khung friedelan 15 1.1.4.5 Triterpen khung taraxeran (friedooleanan) 17 1.1.4.6 Sinh tổng hợp triterpen 18 1.1.4.7 Hoạt tính sinh học triterpen 20 1.2 Cây Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme Gaertn.) 22 1.2.1 ðặc ñiểm thực vật 22 1.2.2 Hoạt tính sinh học ứng dụng y học cổ truyền 23 1.2.3 Tình hình nghiên cứu Ngọc nữ biển 24 1.2.3.1 Các iridoid glycosid 24 1.2.3.2 Các diterpenoid 26 1.2.3.3 Các steroid 27 1.2.3.4 Các flavonoid 29 Chương II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Các phương pháp sắc ký ñể phân lập chất từ dịch chiết 30 2.2 Các phương pháp xác ñịnh cấu trúc chất phân lập ñược 30 2.3 Các phương pháp thử hoạt tính 30 2.3.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 30 2.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào 31 Chương III: THỰC NGHIỆM 33 3.1 Mẫu thực vật, thiết bị hóa chất 33 3.1.1 Mẫu thực vật 33 3.1.2 Dụng cụ thiết bị 33 3.1.3 Hóa chất hệ dung môi chạy mỏng 34 3.2 Chiết tách, tinh chế xác ñịnh cấu trúc hợp chất 35 3.2.1 Cây Chóc máu (Salacia chinensis L.) thu Thừa Thiên 35 Huế (mẫu SC-01) 3.2.1.1 Chiết mẫu thực vật 35 3.2.1.2 Phân lập tinh chế chất từ dịch chiết n-hexan cành 35 3.2.1.3 Phân lập tinh chế chất từ dịch chiết ethyl axetat cành 39 3.2.2 Cây Chóc máu (Salacia chinensis L.) thu Quảng Bình 40 (mẫu SC-02) 3.2.2.1 Chiết mẫu thực vật 40 3.2.2.2 Phân lập tinh chế chất từ dịch chiết n-hexan cành 40 3.2.2.3 Phân lập tinh chế chất từ dịch chiết ethyl axetat cành 43 3.2.2.4 Phân lập tinh chế chất từ dịch chiết n-hexan 46 3.2.2.5 Phân lập tinh chế chất từ dịch chiết ethyl axetat 49 3.2.2.6 Chiết tách mangiferin từ Chóc máu thu Quảng Bình 50 3.2.3 Cây Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme Gaertn.) 51 3.2.3.1 Chiết mẫu thực vật 51 3.2.3.2 Phân lập tinh chế chất từ Ngọc nữ biển 51 3.3 Thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết 54 chất phân lập ñược 3.3.1 Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 3.3.1.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh dịch chiết từ 55 Chóc máu 54 3.3.1.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh dịch chiết từ 55 Ngọc nữ biển 3.3.2 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào chất phân lập ñược 55 Chương IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56 4.1 Cây Chóc máu thu Thừa Thiên Huế (mẫu SC-01) 56 4.1.1 Mẫu thực vật 56 4.1.2 Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết n-hexan cành 56 Chóc máu 4.1.2.1 Chất S5 (120): Axit 28-hydroxy-3-oxo-30-lupanoic 56 4.1.2.2 Chất S1 (119): 3-oxo-30-lupanal 63 4.1.2.3 Chất S3 (22): 20(29)-lupen-3,28-diol hay betulin 64 4.1.2.4 Chất S2 (59): 29-nor-21α-H-hopan-3,22-dion 65 4.1.2.5 Chất S4 (60): 21α-H-22(29)-hopen-3β,30-diol 66 4.1.3 Daucosterol từ dịch chiết ethyl axetat cành Chóc máu 68 4.2 Cây Chóc máu thu Quảng Bình (mẫu SC-02) 69 4.2.1 Mẫu thực vật 69 4.2.2 Thành phần hóa học dịch chiết n-hexan từ cành Chóc máu 69 4.2.3 Thành phần hóa học dịch chiết ethyl axetat cành Chóc máu 72 4.2.3.1 Chất SCE1 (124): 7α,21α-dihydroxyfriedelan-3-on 73 4.2.3.2 Chất SCE3 (123): 7α,29-dihydroxyfriedelan-3-on 82 4.2.3.3 Chất SCE2 (125): 21α,30-dihydroxyfriedelan-3-on 90 4.2.4 Các chất từ dịch chiết n-hexan Chóc máu 92 4.2.4.1 Chất S6 (28): friedelan-3-on 92 4.2.4.2 Chất S7 (76): friedelan-3β-ol 93 4.2.4.3 Chất S8 (83): 14-taraxeren-3β-ol 94 4.2.4.4 Chất S9 (78): axit 3,4-secofriedelan-3-oic 95 4.2.5 Quercitrin (SF1) từ dịch chiết ethyl axetat Chóc máu 97 4.2.6 Mangiferin (SF2) từ Chóc máu thu Quảng Bình 98 4.3 Cây Ngọc nữ biển 101 4.3.1 Mẫu thực vật 101 4.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 101 4.3.2.1 Chất CE1 (127): lup-20(29)-en-3β-O-yl hexacosanoat 101 4.3.2.2 Chất CE2 (128): stigmast-5-en-3β-ol 103 4.3.2.3 Các flavon: acacetin (CE3) apigenin (CE4) 104 4.3.2.4 Diterpen: andrographolid (CE5) 107 4.4 Hoạt tính sinh học 110 4.4.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 110 4.4.1.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định dịch chiết từ 110 Chóc máu 4.4.1.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định dịch chiết từ 110 Ngọc nữ biển 4.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào 111 4.5 Tổng kết hợp chất ñã phân lập 114 KẾT LUẬN 118 TÀI LIỆU THAM KHẢO 120 PHỤ LỤC 131 KÍ HIỆU MỘT SỐ CHỮ VIẾT TẮT • 1H-NMR (MHz, dung mơi đo): phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton • 13C-NMR (MHz, dung mơi đo): phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C • DEPT: Distortionless enhancement by polarization transfer • HSQC (heteronuclear singlet quantum coherence): phổ cố kết đa lượng tử dị hạt nhân • HMBC (heteronuclear multiple bond correlation): phổ tương quan ña liên kết dị hạt nhân • NOESY (nuclear Overhauser effect spectroscopy): phổ hiệu ứng NOE • 1H-1H-COSY (1H-1H correlation spectroscopy): phổ tương quan proton-proton • s : singlet • d : doublet • t : triplet • q : quartet • m : multiplet • dd: double doublet • dq: double quartet • J : số tương tác (Hz) • δ : độ chuyển dịch hóa học (ppm) • TMS: tetramethylsilan Si(CH3)4 • EI-MS: phổ khối va chạm electron • ESI-MS: phổ khối phun mù điện tử • HR-MS (high-resolution mass spectrometry): phổ khối phân giải cao • IR (KBr) νmax (cm-1): phổ hồng ngoại • SKC, silicagel: sắc ký cột sử dụng silicagel • SKLM: sắc ký lớp mỏng • Pð: phân đoạn • HS (%): hiệu suất so với trọng lượng mẫu khơ (tính theo %) • đ.n.c: điểm nóng chảy • MeOH: methanol • EtOAc: ethyl axetat • EtOH: ethanol LỜI CAM ðOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Ký tên Trần Thị Minh LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc ñến GS TSKH Trần Văn Sung PGS TS Vũ ðào Thắng người ñã tạo điều kiện hướng dẫn tơi bước suốt q trình thực luận án Tơi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Hoàng Anh bảo sâu sát nhiệt tình q trình thực nghiệm ý kiến q báu lĩnh vực phổ cộng hưởng từ hạt nhân phổ khối, TS J Schmidt - Viện Sinh hóa thực vật Halle – Cộng hòa Liên bang ðức việc ño phổ khối phân giải cao Luận án hồn thành với giúp đỡ, cộng tác vơ tư nhiệt tình thầy cơ, anh chị bạn đồng nghiệp Bộ mơn Hóa Hữu – Khoa Cơng nghệ Hóa học – Trường ðại học Bách khoa Hà Nội Phòng Tổng hợp Hữu – Viện Hóa học – Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Ký tên Trần Thị Minh PHỤ LỤC CÁC BẢNG BIỂU VÀ SƠ ðỒ Tên bảng biểu sơ ñồ STT Trang Bảng 4.1 Số liệu phổ 13C-NMR chất S1-S5 67 Bảng 4.2 Số liệu phổ 13C-NMR SPA1, SPA1-TP, SPA2 72 Bảng 4.3 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR, HSQC, 1H-1H COSY, HMBC SCE1 81 13 Bảng 4.4 Số liệu phổ H-, C-NMR, HSQC, H-H COSY, HMBC SCE3 89 Bảng 4.5 Dữ liệu phổ 13C-NMR SCE2 SCE2a 91 Bảng 4.6 Dữ liệu phổ 13C-NMR S6-S9 96 Bảng 4.7 Số liệu phổ 13C-NMR chất CE1 103 13 Bảng 4.8 Dữ liệu phổ H-, C- NMR CE3 CE4 106 Bảng 4.9 Dữ liệu phổ 1H-, 13C – NMR, HMBC H-H COSY CE5 109 Bảng 4.10 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định dịch chiết từ 110 Chóc máu Bảng 4.11 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định dịch chiết từ 111 Ngọc nữ biển Bảng 4.12 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào 112 Sơ đồ 1.1 Sự hình thành triterpen từ squalen 19 Sơ đồ 3.2 Quy trình chiết mẫu thực vật 35 Sơ ñồ 3.3 Phân lập chất từ cặn chiết n-hexan cành Chóc máu 36 thu Thừa Thiên Huế Sơ ñồ3 Phân lập chất từ cặn chiết ethyl axetat cành Chóc 43 máu thu Quảng Bình Sơ đồ 3.5 Phân lập chất từ cặn chiết n-hexan Chóc máu thu 47 Quảng Bình Sơ đồ 3.6 Phân lập chất từ cặn chiết ethyl axetat Ngọc nữ 51 biển Sơ ñồ 4.7 Sự phân mảnh SCE1 phổ EI-MS 76 172 Phổ 1H-NMR mangiferin (SF2, 52) Phổ 13C-NMR, DEPT mangiferin (SF2, 52) 173 Phụ lục 15: Các phổ chất CE1 (127): 20(29)-lupen-3β-O-yl hexacosanoat Phổ IR 20(29)-lupen-3β-O-yl hexacosanoat (CE1, 127) Phổ ESI-MS 20(29)-lupen-3β-O-yl hexacosanoat (CE1, 127) 174 29 26' 30 20 17 13 11 25 O 28 14 16 10 3' 22 18 26 21 19 12 15 27 1' O 23 24 Phổ 1H-NMR 20(29)-lupen-3β-O-yl hexacosanoat (CE1, 127) Phổ 13C-NMR, DEPT 20(29)-lupen-3β-O-yl hexacosanoat (CE1, 127) 175 Phụ lục 16: Các phổ chất CE2 (128): Stigmast-5-en-3β-ol 29 28 21 22 26 20 11 16 14 Phổ IR stigmast-5-en-3β-ol (CE2, 128) EI-MS stigmast-5-en-3β-ol (CE2, 128) 24 25 17 HO 23 19 10 12 18 13 15 27 176 29 28 21 20 18 13 12 11 16 HO 25 27 15 14 24 17 26 23 19 10 22 Phổ 1H-NMR stigmast-5-en-3β-ol (CE2, 128) Phổ 13C-NMR, DEPT stigmast-5-en-3β-ol (CE2, 128) 177 Phụ lục 17: Các phổ chất CE3 (116): Acacetin Phổ IR acacetin (CE3 CE3, 116) Phổ ESI-MS acacetin (CE3, 116) 178 Phổ 1H-NMR acacetin (CE3, 116) Phổ 13C-NMR, DEPT acacetin (CE3, 116) 179 Phụ lục 18: Các phổ chất CE4 (129): Apigenin Phổ IR apigenin (CE4, 129) Phổ EI-MS apigenin (CE4, 129) 180 Phổ 1H-NMR apigenin (CE4, 129) Phổ 13C-NMR, DEPT apigenin (CE4, 129) 181 Phụ lục 19: Các phổ chất CE5 (130): Andrographolid Phổ IR andrographolid (CE5, 130) Phổ ESI-MS andrographolid (CE5, 130) 182 Phổ 1H-NMR andrographolid (CE5, 130) Phổ 13C-NMR, DEPT andrographolid (CE5, 130) 183 Phổ 1H-1H COSY andrographolid (CE5, 130) 184 Phổ HSQC andrographolid (CE5, 130) 185 Phổ HMBC andrographolid (CE5, 130) 186 Phụ lục 20: Một số hình ảnh thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư TB ung thư dòng Hep-G2 TB Hep-G2-CE5 TB Hep-G2-SCE1 TB ung thư dòng LU TB LU- CE5 TB LU-SCE1 TB ung thư dòng KB TB KB- CE5 TB KB-SCE1 TB ung thư dòng MCF7 TB MCF7-CE5 ... vụ luận án tiến hành thu thập mẫu, xác ñịnh tên khoa học, nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học của hai l? ??i chưa nghiên cứu Việt Nam ñó l? ?: 1- Cây Chóc máu (Salacia chinensis L. ), thuộc chi Salacia... betulin (2 2), 20(2 9)- lupen-3-on-28-ol (2 3), axit betulinic (2 4), 20(2 9)- lupen-3β,30-diol (2 5), 30-hydroxy-20(2 9)- lupen-3-on (2 6), 3β,20dihydroxylupan (2 7), friedelin (2 8), 4-epifriedelin (2 9), ... Foliasalaciosid E3 (4 3) Foliasalaciosid H (4 6) Foliasalaciosid F (4 4) Foliasalaciosid I (4 7) Foliasalaciosid G (4 5) Myrsinionosid D (4 8) 1-[5- (8-hydroxy-1,5- Loliolide-β-Dglucopyranosid (49)