Khảo sát quy trình đánh giá tác động ức chế enzym hmg coa reductase trên dịch đồng thể in vitro, in vivo và trên dòng tế bào hepg2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - BỘ Y TẾ Trần Thị Thiên Thanh KHẢO SÁT QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ ENZYM HMG-COA REDUCTASE TRÊN DỊCH ĐỒNG THỂ IN VITRO, IN VIVO VÀ TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEPG2 Luận văn Thạc sĩ Dược học Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ Y TẾ Trần Thị Thiên Thanh KHẢO SÁT QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ ENZYM HMG-COA REDUCTASE TRÊN DỊCH ĐỒNG THỂ IN VITRO, IN VIVO VÀ TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEPG2 Ngành: Dược lý – Dược lâm sàng Mã số: 8720205 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS TRẦN MẠNH HÙNG Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình Tác giả TRẦN THỊ THIÊN THANH Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học Luận văn Thạc sĩ Dược học – Khoá: 2016-2018 Chuyên ngành: Dược lý – Dược lâm sàng – Mã số: 8720205 KHẢO SÁT QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ ENZYM HMGCOA REDUCTASE TRÊN DỊCH ĐỒNG THỂ IN VITRO, IN VIVO VÀ TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEPG2 Học viên: Trần Thị Thiên Thanh Hướng dẫn khoa học: PGS TS Trần Mạnh Hùng Mục tiêu: Khảo sát thiết lập mơ hình đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase in vitro, in vivo dịng tế bào HepG2 Vật liệu phương pháp: Ở mô hình in vitro, khảo sát hoạt tính HMG-CoA reductase theo nồng độ NADPH, số lượng gan chuột nhắt so sánh hoạt tính enzym dịch đồng thể với KIT Sigma thông qua tác động ức chế enzym atorvastatin Ở mơ hình in vivo, chuột gây tăng lipid huyết tăng hoạt tính HMG-CoA reductase triton WR-1339 (tyloxapol) liều 250 mg/kg Định lượng lipid huyết hoạt tính HMG-CoA reductase sau 24 tiêm tyloxapol Tế bào HepG2 ủ với acid oleic (50 µM tới mM) 24 giờ, xác định tỷ lệ sống, nồng độ lipid hoạt tính HMG-CoA reductase Kết bàn luận: Trong quy trình định lượng HMG-CoA reductase, nồng độ NADPH tối ưu 20 µM, dịch đồng thể từ gan trở lên để đảm bảo hoạt tính enzym IC50 atorvastatin enzym dịch đồng thể KIT 11,68 14,51 ng/ml Tiêm tyloxapol liều 250 mg/kg 24 làm tăng nồng độ lipid huyết tăng 1,5 lần hoạt tính HMG-CoA reductase Tế bào HepG2 ủ với acid oleic mM có tỷ lệ sống giảm 30% nồng độ cholesterol tăng 3,4 lần với nhóm chứng Atorvastatin sử dụng thuốc đối chứng mơ hình in vivo dịng tế bào HepG2 Kết quả: Mơ hình đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase in vitro, in vivo dòng tế bào HepG2 phù hợp để nghiên cứu, khảo sát dược chất có tiềm điều trị RLLH iii Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học Final Essay for the Master of Pharmacy Degree– Course: 2016-2018 Specialization: Pharmacology – Clinical Pharmacy – Code: 8720205 INVESTIGATION OF HMG-COA REDUCTASE INHIBITORY ACTIVITY ASSAY IN VITRO, IN VIVO AND IN HEPG2 CELLS LINE Student: Tran Thi Thien Thanh Supervisor: Assoc Prof Dr Tran Manh Hung Purpose: The thesis is aimed at investigating and establishing a model of HMG-CoA reductase inhibitory activity in vitro, in vivo and in HepG2 cell line Materials and Methods: In in vitro model, HMG-CoA reductase activity was examined with respect to various concentrations of NADPH and number of mice’s livers using Sigma KIT, which relies on the inhibitory activity of atorvastatin In in vivo setting, hyperlipidemia was induced by single intravenous injection of triton WR-1339 (tyloxapol) at the dose of 250 mg/kg After 24 hours of tyloxapol injection, lipid concentrations and HMG-CoA reductase activity were identified HepG2 cells were exposed to oleic acid (from 50 µM to mM) in 24 hours, cell viability together with lipid concentration and HMG-CoA reductase activity were examined Results: In the quantification procedure of HMG-CoA reductase, the optimal NADPH concentration was 20 µM and the homogeneous enzyme was made from at least mice’s livers IC50 values of atorvastatin against enzyme from homogeneous enzyme and Sigma KIT were 11,68 and 14,51 ng/ml, respectively Intravenous injection of 250 mg/kg tyloxapol within 24 hours increased lipid concentration and led to a 1.5-fold rise of HMG-CoA reductase activity HepG2 after exposure to mM oleic acid in 24 hours exhibited 30% decrease in cell viability, but its cholesterol level elevated 3,4-fold higher than the control group These effects were compared to those of the positive control atorvastatin Conclusion: The model of HMG-CoA reductase inhibitory activity in vitro, in vivo and in HepG2 Cells were suitable for studies of inhibitory effects of potential bioactive compounds against HMG-CoA reductase iv Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học MỤC LỤC CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 RỐI LOẠN LIPID HUYẾT .3 1.1.1 Chu trình tổng hợp cholesterol 1.1.2 Lipoprotein vận chuyển lipid 1.1.3 Nguyên nhân gây RLLH 1.2 HMG-CoA REDUCTASE .9 1.2.1 Cấu trúc .9 1.2.2 Vai trò HMG-CoA reductase 11 1.3 TỔNG QUAN VỀ DÒNG TẾ BÀO HEPG2 11 1.4 GIỚI THIỆU VỀ BỘ KIT HMG-COA REDUCTASE 13 1.4.1 Thành phần KIT 13 1.4.2 Nguyên tắc hoạt động .13 1.4.3 Tính tốn kết .14 1.5 MƠ HÌNH TĂNG LIPID HUYẾT BẰNG TYLOXAPOL 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .16 2.1.1 Động vật thử nghiệm 16 2.1.2 Dòng tế bào thử nghiệm 16 2.1.3 Hóa chất thuốc thử nghiệm 16 2.1.4 Trang thiết bị nghiên cứu 17 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.2.1 Quy trình thu hỗn dịch enzym từ gan chuột nhắt 18 2.2.2 Phương pháp định lượng hoạt tính HMG-CoA reductase 20 v Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học 2.2.3 Khảo sát định lượng hoạt tính HMG-CoA reductase dịch đồng thể 23 2.2.4 So sánh tác động ức chế HMG-CoA reductase atorvastatin enzym dịch đồng thể KIT Sigma 24 2.2.5 Xây dựng mơ hình đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase tăng lipid cấp tính in vivo 28 2.2.6 Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase tác động tăng tổng hợp cholesterol dòng tế bào HepG2 30 2.3 PHÂN TÍCH SỐ LIỆU THỐNG KÊ .32 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33 3.1 KHẢO SÁT QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH HMG-COA REDUCTASE IN VITRO 33 3.1.1 Ảnh hưởng nồng độ NADPH lên hoạt tính HMG-CoA reductase 33 3.1.2 Ảnh hưởng số lượng gan chuột lên hoạt tính HMG-CoA reductase 34 3.2 SO SÁNH TÁC ĐỘNG CỦA HMG-COA REDUCTASE TRONG DỊCH ĐỒNG THỂ VÀ TRONG BỘ KIT THƯƠNG MẠI 35 3.2.1 Khảo sát tác động ức chế atorvastatin với HMG-CoA reductase dịch đồng thể .35 3.2.2 Khảo sát tác động ức chế HMG-CoA reductase KIT enzym atorvastatin 37 3.3 MƠ HÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH HMG-COA REDUCTASE IN VIVO 39 3.3.1 Khảo sát tác động tyloxapol lipid huyết 39 3.3.2 Mơ hình đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase tác dụng tăng lipid huyết cấp tính in vivo tyloxapol 40 3.4 MƠ HÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH HMG-COA REDUCTASE VÀ TĂNG TỔNG HỢP CHOLESTEROL TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEPG2 42 vi Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học 3.4.1 Ảnh hưởng acid béo lên tỷ lệ sống tế bào HepG2 42 3.4.2 Ảnh hưởng acid béo lên nồng độ cholesterol, triglycerid dòng tế bào HepG2 43 3.4.3 Ảnh hưởng acid béo lên hoạt tính HMG-CoA reductase 44 3.4.4 Mơ hình tăng tổng hợp cholesterol dòng tế bào HepG2 acid béo 44 CHƯƠNG BÀN LUẬN 46 4.1 KHẢO SÁT QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH HMG-COA REDUCTASE IN VITRO 46 4.2 SO SÁNH HOẠT TÍNH HMG-COA REDUCTASE CỦA DỊCH ĐỒNG THỂ VỚI BỘ KIT THƯƠNG MẠI 47 4.3 QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH HMG-COA REDUCTASE IN VIVO .47 4.4 MƠ HÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH HMG-COA REDUCTASE VÀ TĂNG TỔNG HỢP CHOLESTEROL TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEPG2 49 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 5.1 KẾT LUẬN 51 5.2 ĐỀ NGHỊ .52 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………….53 PHỤ LỤC………………………………………………………………………… 61 vii Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Giới hạn thành phần lipid máu Bảng 1.2 Khuyến cáo điều trị tăng cholesterol máu thuốc .7 Bảng 1.3 Cấu trúc loại HMG-CoA reductase .10 Bảng 1.4 Thành phần KIT HMG-CoA reductase .13 Bảng 2.1 Danh mục hoá chất thuốc thử sử dụng đề tài .16 Bảng 2.2 Thành phần định lượng protein toàn phần KIT Biuret .20 Bảng 2.3 Thành phần thể tích phản ứng mẫu cuvet 1ml 21 Bảng 2.4 Thể tích phản ứng định lượng hoạt tính HMG-CoA reductase KIT Sigma 22 Bảng 2.5 Hỗn hợp phản ứng khảo sát ảnh hưởng NADPH lên hoạt tính HMGCoA reductase 23 Bảng 2.6 Hỗn hợp phản ứng khảo sát ảnh hưởng số lượng gan lên hoạt tính HMG-CoA reductase 24 Bảng 2.7 Hỗn hợp phản ứng đánh giá tác động ức chế atorvastatin với HMGCoA reductase dịch đồng thể 26 Bảng 2.8 Hỗn hợp phản ứng đánh giá tác động ức chế atorvastatin với HMGCoA reductase KIT Sigma 27 Bảng 3.1 Sự thay đổi độ hấp thu nồng độ NADPH khác 33 Bảng 3.2 Sự thay đổi độ hấp thu mẫu có số lượng gan khác 34 Bảng 3.3 Tác động ức chế atorvastatin với HMG-CoA reductase dịch đồng thể 35 Bảng 3.4 Tác động ức chế atorvastatin với HMG-CoA reductase KIT Sigma 37 Bảng 3.5 Nồng độ cholesterol triglycerid theo thời gian 39 Bảng 3.6 Các số lipid huyết lô 40 Bảng 3.7 Sự thay đổi độ hấp thu lô 41 viii Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học Bảng 3.8 Mật độ quang đo mẫu có nồng độ acid béo khác 42 Bảng 3.9 Ảnh hưởng acid béo lên nồng độ lipid dòng tế bào HepG2 .43 Bảng 3.10 Hoạt tính HMG-CoA reductase nồng độ acid béo khác .44 Bảng 3.11 Nồng độ lipid lô .44 Bảng 3.12 Hoạt tính HMG-CoA reductase lô 45 ix Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học 48 Kawabata Y W K., Nakatani M, Yamada S, Onoue S (2011), "Formulation design for poorly water-soluble drugs based on biopharmaceutics classification system: Basic approaches and practical applications", Int J Pharm 420, pp 1-10 49 Kersten S., B Desvergne and W Wahli (2000), “Roles of PPARs in health and disease”, Nature, 405(6785), pp.421-424 50 Kim JH, Kang SI, Shin HS, Yoon SA, Kang SW, Ko HC, Kim SJ (2013), “Sasa quelpaertensis and p-coumaric acid attenuate oleic acid-induced lipid accumulation in HepG2 cells”, Biosci Biotechnol Biochem, 77(7), pp1595-8 51 Kim K T et al (2008), "Inhibitory effects of naringenin, kaempherol, and apigenin on cholesterol biosynthesis in HepG2 and MCF-7 cells", Food Science and Biotechnology, 17(6), pp.1361-1364 52 Kohjima M et al (2009), "The effects of unsaturated fatty acids on lipid metabolism in HepG2 cells", In vitro Cellular & Developmental BiologyAnimal, 45(1-2), 6-9 53 Koletzko L., Hellerbrand C (2012), "Ebtablishment of an in vitro model in which HBV promotes hepatocellular steatosis and lipotoxicity", Gastroenterology, 50, 4-33 54 Kuroda M K., Tanzawa Y Tsujita, and Endo A (1977), “Mechanism for elevation of hepatic cholesterol synthesis and serum cholesterol levels in Triton WR- 1339-induced hyperlipidemia”, Biochim Biophys Acta., 489, pp.119-125 55 Lee MS, Kim JS, Cho SM, Lee SO, Kim SH, Lee HJ (2015), “Fermented Rhus verniciflua Stokes Extract Exerts an antihepatic Lipogenic effect in Oleic-Acid-Induced HepG2 cells via upregulation of AMP-Activated Protein kinase”, J Agric Food Chem 63(32), pp.7270-7276 56 Levine S, Saltzman A (2007), “A procedure for inducing sustained hyperlipemia in rats by administration of a surfactant.”, J Pharmacol Toxicol Methods, 55(2), pp.224-226 57 Liscum L et al (1985), "Domain structure of 3-hydroxy-3methylglutaryl coenzym A reductase, a glycoprotein of the endoplasmic reticulum", J Biol Chem 260 (1), pp.522-530 58 Matteo Ricchi (2009), Maria Rosaria Odoardi, Lucia Carulli, Paola Loria, “ Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes”, Journal of Gastroenterology and Hepatology, 24 (5), pp.830-40 59 Meex Steven J R., Andreo Ursula, Sparks Janet D , Fisher Edward A (2011), "Huh-7 or HepG2 cells: which is the better model for studying 57 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học human apolipoprotein-B100 assembly and secretion?", Journal of lipid research, 52(1), pp.152-158 60 Micheli Stefani Zarzecki, Stifani M Araujo,, Vandreza C Bortolotto, Mariane Trindade de Paula, Cristiano Ricardo Jesse, Marina Prigol (2014), “Hypolipidemic action of chrysin on Triton WR-1339-induced hyperlipidemia in female C57BL/6 mice”, Toxicology Reports, 1, pp.200208 61 Mi Ja Chung, Kuen Woo Park, Kyoung Heon Kim, Cheong-Tae Kim, Jun Pill Back, Kyong-Hwan Bang, Young-Mi Choi, Sung-Joon Lee (2008), “Asian plantain (Plantago asiatica) essential oils suppress 3-hydroxy-3methyl-glutaryl-co-enzyme A reductase expression in vitro and in vivo and show hypocholesterolaemic properties in mice”, Bristish Journal of Nutrition 99, pp.67-75 62 Myung-A Jung, Sun Young Lee, Seul Hee Han (2015), “Hypocholesterolemic effects of Curcuma longa L with Nelumbo nucifera leaf in an in vitro model and a high cholesterol diet-induced hypercholesterolemic mouse model”, Korean Society for Integrative Biology, 19(2), pp.133-143 63 Nagata Y and Zilversmit D B (1987), “Blockade of intestinal lipoprotein clearance in rabbits injected with Triton WR 1339-ethyl oleate”, J Lipid Res., 28, pp.684-692 64 Nan Wu, Lindsei K Sarma, Sun-Young Hwang (2013), “Activation of 3hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase during high fat diet feeding”, Biochimica et Biophysica 1832 (2913), pp.156001568 65 Phuong Mai Mai, Ngoc Trinh Huynh (2005), “Study of antihyperlipidemic activity of Cao Bang bitter tea (Ilex kaushue S Y HuAquifoliaceae) leaves extract against tyloxapol induced hyperlipidemia in mice”, Pharma Indochina IV, 2, pp.259-263 66 Rodwell, V W., J L Nordstrom, and J J Mitschelen (1976), “Regulation of HMG-CoA reductase”, Adv Lipid Res 14, 1-74 67 Rosseba AB, Pedersen TR, Boman K, Brudi P, Chambers JB, Egstrup K, Gerdts E, Gohlke-Barwoft C, Holme I, Kesaniemi YA, Malbecq W, Nienaber CA, Ray S, Skjaerpe T, Wachtell K, Willenheimer R, SEAS investigators (2008), “Intensive lipid lowering with simvastatin and ezetimibe in aortic stenosis”, N Eng J Med, 359, pp.1343-1356 68 Schotz M.C., Scanu A and Page I H (1957), “Effect of Triton on lipoprotein lipase of rat plasma”, Am J Physiol 188, pp.399-402 69 SHARP Collaborative Groups (2010), “Study of Heart and Renal Protection (SHARP): randomized trial to assess the effects of lowering 58 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học low-density lipoprotein cholesterol among 9438 patients with chronic kidney disease”, Am Heart J 160, pp.785-794 70 Shechter J R a I (1983), "Regulation of Rat Liver 3-Hydroxy-3methylglutarylC oenzym A Reductase", J Biol Chem 259 (2), pp 870877 71 Sigma-Aldrich (2007),”HMG-CoA Reductase (HMGR) Assay Kit” BioFiles 7, 72 Siperstein M D et al (1960), "Studies on the site of the feedback control of cholesterol synthesis", J Clin Invest 39, pp 642-652 73 Stone J Robinson JG, Lichtenstein AH, Bairey Merz CN, Blum CB, Eckel RH, Goldberg AC, Gordon D, Levy D, Lloyd-Jones DM, McBride P, Schwartz JS, Shero ST, Smith SC Jr, Watson K, Wilson PW (2013), "2013 ACC/AHA Guildline on the Treatment of Blood Cholesterol to reduce Atheroscleotic Cardiovascular Risk in adults", J Am Coll Cardiol, 63(25), pp.2889-2934 74 Thomas P Berso (2011), Drug Therapy for Hypercholesterolemia and Dyslipidemia, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 12th edition, The McGraw-Hill Companies, pp.877-908 75 T.Funatsu, K.Suzuki, M.Goto, Y.Arai, H.Kakuta, H.Tanaka, S.Yasuda, M Ida, S Nishijima, K.Miyata (2001), “Prolonged inhibitor of cholesterol synthesis by atorvastatin inhibits apo B-100 and triglyceride secretion fr0m HepG2 cells, Atheroclerosis, 157, pp.107-115 76 T Huynh Ngoc, Q Nguyen Ngoc, A Tran T Van and N Vo Phung (2008), “Hypolipidemic Effect of Extracts from Abelmoschus esculentus L (Malvaceae) on Tyloxapol-Induced Hyperlipidemia”, Mah Uni Jour of Pharm Sci., 35(1- 4), pp.42-46 77 Vanitha Reddy Palvai, Asna Urooj (2014), “Inhibiton of 3-Hydroxy-3methylglutaryl Coenzyme A Reductase (ex vivo) by Morus indica (Mulberry)”, Chinese Journal of Biology 2014, 78 Wei Ying et al (2013), "In vitro antioxidant activity and inhibitory hepatic steatosis effect on oleic acid-induced fatty liver model of consecutive extracts from Rosa davurica Pall.", African Journal of Biotechnology, 12(31), 4944-4951 79 Wilce PA, Kroon PA (1992) In Lipoprotein Analysis – a Practical Approach (Converse CA, Skinner ER, eds.) Oxford Univ Press, Oxford, pp 207-211 80 Zeggwagh N.A., Sulpice T and Eddouks M (2007), “Antihyperglycaemic and Hypolipidemic Effects of Ocimum basilicum Aqueous Extract in Diabetic Rats”, American Journal of Pharmacology and Toxicology, 2(3), pp.123-129 59 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học 81 Honda A, Yamashita K (2009), “Highly sensitive quantification of key regulatory oxysterols in biological samples by LC-ESC-MS/MS”, Journal of lipid research 50 (2), pp 350-357 82 Ricky Y.K, Man, Edward G., “Cholestin inhibits cholesterol synthesis and secretion in hepatic cells (HepG2)”, Molecular and Cellular Biochemistry, 233, pp.153-158 60 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Trần Thị Thiên Thanh Luận văn Thạc sĩ Dược học PHỤ LỤC PL1 Độ giảm hấp thu mẫu khảo sát ảnh hưởng nồng độ NADPH lên hoạt tính HMG-CoA reductase PL2 Độ giảm hấp thu mẫu khảo sát ảnh hưởng số lượng gan chuột lên HMG-CoA reductase PL3 Độ giảm hấp thu dãy nồng độ atorvastatin với enzym dịch đồng thể in vitro PL4 Độ giảm hấp thu dãy nồng độ atorvastatin với enzym KIT Sigma PL5 Nồng độ cholesterol triglycerid huyết tương thời điểm khác sau tiêm tyloxapol PL6 Nồng độ cholesterol, triglycerid, HDL-C LDL-C lơ chuột thử nghiệm mơ hình tăng lipid huyết cấp tính in vivo tyloxapol PL7 Độ giảm hấp thu hoạt tính HMG-CoA reductase lơ thử nghiệm mơ hình đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase in vivo PL8 Mật độ quang % tế bào sống lô khảo sát ảnh hưởng acid béo lên tế bào HepG2 PL9 Nồng độ cholesterol trìglycerid tế bào HepG2 ủ với nồng độ acid béo khác PL10 Nồng độ cholesterol trìglycerid tế bào HepG2 lơ thử nghiệm mơ hình tăng tổng hợp cholesterol dịng tế bào HepG2 61 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL1 Độ giảm hấp thu mẫu khảo sát ảnh hưởng nồng độ NADPH lên hoạt tính HMG-CoA reductase KIT Enzym dịch đồng thể Thử Trắng Trắng NADPH NADPH NADPH NADPH 10 µM 20 µM 50 µM 100 µM 0,341 0,026 0,003 0,084 0,099 0,103 0,091 0,340 0,025 0,002 0,087 0,094 0,098 0,095 0,336 0,024 0,005 0,083 0,095 0,097 0,093 TB 0,339 0,025 0,003 0,085 0,096 0,099 0,093 SEM 0,002 0,001 0,001 0,001 0,002 0,002 0,001 141,12 36,17 42,87 44,66 39,30 140,68 37,51 40,64 42,43 41,09 138,89 35,73 41,09 41,98 40,19 TB 140,23 36,47 41,53 43,02 40,19 SEM 0,68 0,54 0,68 0,83 0,52 ∆OD Hoạt tính Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL2 Độ giảm hấp thu mẫu khảo sát ảnh hưởng số lượng gan chuột lên HMGCoA reductase Lô KIT (1 gan) ∆OD0-300 TB SEM 0,336 0,339 0,002 0,015 0,022 0,018 0,002 0,031 0,028 0,023 0,027 0,002 0,001 0,018 0,012 0,016 0,015 0,002 0,003 0,026 0,027 0,015 0,023 0,004 0,005 0,021 0,022 0,022 0,022 0,000 0,001 0,021 0,029 0,014 0,021 0,004 0,021 0,002 Trắng L1 L2 L3 0,025 0,341 0,34 0,005 0,017 0,004 TB L1 0,005 1’ 0,004 0,02 0,022 0,025 0,022 0,001 (3 gan) 0,004 0,084 0,088 0,091 0,088 0,002 (6 gan) 0,003 0,099 0,095 0,096 0,097 0,001 TB SEM Hoạt tính (nmol/phút/mgP) Trắng KIT (1 gan) L1 L2 L3 141,12 140,68 138,89 140,22 0,68 5,36 4,47 7,59 5,81 0,93 12,06 10,72 8,49 10,42 1,04 7,59 4,91 6,70 6,40 0,79 10,27 10,72 5,36 8,78 1,72 7,15 7,59 7,59 7,44 0,15 8,93 12,50 5,81 9,08 1,94 7,99 1,09 TB L1 1’ 7,15 8,04 9,38 8,19 0,65 (3 gan) 35,73 37,51 38,85 37,36 0,91 (6 gan) 42,87 41,09 41,53 41,83 0,54 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL3 Độ giảm hấp thu dãy nồng độ atorvastatin với enzym dịch đồng thể in vitro KIT Mẫu ∆OD0-300 TB Thử Trắng 0,262 0,012 0,001 0,001 0,002 0,012 0,262 Trắng SEM Hoạt tính (nmol/phút/mgP) 111,65 TB SEM 37,96 0,93 32,75 0,39 30,96 0,39 22,78 0,77 17,12 1,42 11,91 0,3 10,42 0,79 7,44 0,91 0,60 1,07 0,000 0,001 Nồng độ Ator (ng/ml) 0,1 Enzym dịch đồng thể 10 20 30 50 100 1000 0,089 0,087 0,082 0,076 0,073 0,074 0,072 0,07 0,069 0,049 0,055 0,052 0,045 0,034 0,039 0,027 0,029 0,027 0,021 0,025 0,027 0,021 0,014 0,018 0,007 -0,001 0,001 0,086 0,002 0,074 0,001 0,070 0,001 0,052 0,002 0,039 0,003 0,028 0,001 0,024 0,002 0,018 0,002 0,002 0,002 39,30 38,41 36,17 33,50 32,16 32,60 31,71 30,82 30,37 21,44 24,12 22,78 19,65 14,74 16,97 14,74 12,50 14,74 8,93 10,72 11,61 8,93 5,81 7,59 2,68 -0,89 0,00 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL4 Độ giảm hấp thu dãy nồng độ atorvastatin với enzym KIT Sigma Nồng độ Ator (ng/ml) Trắng 0,1 10 20 30 50 100 1000 ∆OD 0,02 0,021 0,018 0,31 0,311 0,312 0,303 0,305 0,301 0,255 0,256 0,254 0,188 0,189 0,191 0,16 0,162 0,157 0,142 0,134 0,145 0,111 0,107 0,111 0,092 0,093 0,097 0,018 0,026 0,027 TB SEM 0,02 0,01 0,311 0,001 0,303 0,001 0,255 0,001 0,189 0,001 0,16 0,001 0,140 0,003 0,110 0,001 0,094 0,002 0,024 0,003 Hoạt tính (nmol/phút/mgP) 129,51 129,96 130,40 126,38 127,28 124,49 104,95 105,39 104,5 75,03 76,37 75,47 62,52 63,42 61,18 54,48 50,91 55,82 40,64 38,85 40,64 32,15 32,60 34,39 -0,89 2,68 3,13 TB SEM 129,96 0,26 126,48 0,52 104,95 0,26 75,62 0,39 62,37 0,65 53,74 1,47 40,04 0,60 33,05 0,68 1,64 1,27 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL5 Nồng độ cholesterol triglycerid huyết tương thời điểm khác sau tiêm tyloxapol Lô Cholesterol (mg/dL) Triglycerid (mg/dL) 8h 12h 24h 48h 8h 12h 24h 48h 92 90 84 89 106 107 128 117 117 122 115 112 151 155 173 162 99 98 102 95 156 160 172 149 125 133 126 135 128 141 152 159 116 126 120 121 109 123 149 132 132 128 117 125 162 181 162 147 99 108 101 97 139 153 172 130 122 122 109 104 143 166 178 153 108 112 115 108 128 154 199 137 TB 112,22 115,44 109,89 109,56 135,78 148,89 165,00 142,89 SEM 4,51 4,83 4,21 5,07 6,58 7,47 6,76 4,96 378 402 322 123 898 921 1021 163 307 339 289 139 591 878 809 121 356 326 331 102 723 779 822 179 322 346 301 132 789 867 832 141 302 356 298 141 654 836 801 128 341 323 316 99 789 945 939 152 379 363 332 111 801 1009 869 170 357 389 356 139 723 978 881 159 356 366 326 143 689 830 819 149 TB 344,22 356,67 319,00 125,44 739,67 893,67 865,89 151,33 SEM 9,47 8,92 6,89 5,80 30,34 25,08 24,26 6,33 Sinh lý Bệnh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL6 Nồng độ cholesterol, triglycerid, HDL-C LDL-C lô chuột thử nghiệm mơ hình tăng lipid huyết cấp tính in vivo tyloxapol Cholesterol (mg/dL) 101 127 115 85 92 101 108 113 91 103,67 4,47 381 452 421 368 528 326 501 449 428,25 24,13 302 256 312 322 267 221 378 291 293,63 16,76 Lô Sinh lý Trung bình SEM Bệnh Trung bình SEM Atorvastatin Trung bình SEM Triglycerid (mg/dL) 146 136 109 156 165 110 163 142 149 141,78 6,85 798 834 889 751 991 702 923 782 833,75 33,78 521 478 499 421 489 398 545 532 485,38 18,43 HDL-C (mg/dL) 85,7 95,8 95 77,4 86,5 101 88,2 91 81,9 89,17 2,45 63,1 58,1 57,5 48,8 67,1 71,2 69,8 59,1 61,84 2,64 66,9 78 62,2 77,9 81,5 76 70,1 80,1 74,09 2,44 LDL-C (mg/dL) 58 82,9 76,3 79,1 68 64,9 62 82,1 67 71,14 3,05 122,1 148,2 148,9 178,2 124,9 128,4 152,3 160 145,38 6,83 79,6 101,7 121,1 88,5 115,9 98 95,1 93 99,11 4,86 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL7 Độ giảm hấp thu hoạt tính HMG-CoA reductase lơ thử nghiệm mơ hình đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase in vivo Lô Mẫu trắng KIT 0,02 0,318 0,324 0,321 ∆OD Trung bình SEM Hoạt tính (nmol/phút/mgP) Trung bình SEM 0,321 0,001 133,08 135,76 134,42 134,42 8,30 Sinh lý 0,002 0,083 0,089 0,102 0,088 0,079 0,076 0,092 0,087 0,003 36,17 38,85 44,66 38,41 34,39 33,05 40,19 37,96 1,47 Bệnh 0,003 0,122 0,134 0,108 0,112 0,127 0,144 0,151 0,128 0,006 53,14 58,50 46,89 48,68 55,38 62,97 66,09 55,95 2,68 Atorvastatin 0,003 0,076 0,072 0,077 0,078 0,095 0,087 0,081 0,081 0,003 32,60 30,81 33,05 33,49 41,09 37,51 34,83 33,77 1,31 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL8 Mật độ quang % tế bào sống lô khảo sát ảnh hưởng acid béo lên tế bào HepG2 OD570 Mẫu Chứng Acid béo 50 µM Acid béo 1mM Acid béo mM 0,141 0,163 0,125 0,115 0,125 0,091 0,078 0,175 0,145 0,148 0,133 0,089 0,111 0,056 0,148 0,147 0,145 0,132 0,117 0,099 0,048 0,186 0,125 0,133 0,098 0,127 0,106 0,073 0,151 0,171 0,112 0,111 0,114 0,115 0,061 0,133 0,132 0,138 0,138 0,135 0,118 0,051 TB 0,156 0,147 0,134 0,121 0,118 0,107 0,061 SEM 0,008 0,007 0,005 0,006 0,007 0,004 0,005 94,54 85,76 77,84 75,70 68,52 39,29 % chứng Acid Acid Acid béo 100 béo 200 béo 500 µM µM µM Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL9 Nồng độ cholesterol trìglycerid tế bào HepG2 ủ với nồng độ acid béo khác Mẫu Chứng Acid béo 50 µM Acid Acid Acid béo 100 béo 200 béo 500 µM µM µM Acid béo 1mM Acid béo mM Cholesterol (mg/dL) 6 6 10 11 12 11 10 8 13 7 10 12 11 5 7 10 6 10 14 TB 5,33 5,17 6,33 6,83 8,83 10,17 11,67 SEM 0,42 0,48 0,33 0,48 0,48 0,60 0,67 Triglycerid (mg/dL) 13 15 16 17 22 36 39 14 15 17 18 24 34 33 11 13 17 20 27 31 37 12 16 14 19 25 37 40 15 12 15 19 23 39 33 11 13 18 20 28 35 36 TB 12,67 14,00 16,17 18,83 24,83 35,33 36,33 SEM 0,67 0,63 0,60 0,48 0,95 1,12 1,20 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL10 Nồng độ cholesterol trìglycerid tế bào HepG2 lơ thử nghiệm mơ hình tăng tổng hợp cholesterol dòng tế bào HepG2 Mẫu Sinh lý Bệnh Ator Sinh lý Cholesterol (mg/dL) Bệnh Ator Triglycerid (mg/dL) 11 13 36 17 11 14 34 18 9 11 31 13 12 12 37 15 8 15 39 10 6 10 11 35 19 TB 5,33 10,17 7,5 12,67 35,33 15,33 SEM 0,42 0,60 0,56 0,67 1,12 1,38 ... ENZYM HMG- CoA REDUCTASE TRÊN DỊCH ĐỒNG THỂ IN VITRO, IN VIVO VÀ TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEPG2? ?? thực với mục tiêu sau: • Khảo sát quy trình đánh giá tác động ức chế HMG- CoA reductase dịch đồng thể in vitro... SÁNH TÁC ĐỘNG CỦA HMG- COA REDUCTASE TRONG DỊCH ĐỒNG THỂ VÀ TRONG BỘ KIT THƯƠNG MẠI 3.2.1 Khảo sát tác động ức chế atorvastatin với HMG- CoA reductase dịch đồng thể Kết khảo sát tác động ức chế HMG- CoA. .. – Dược lâm sàng – Mã số: 8720205 KHẢO SÁT QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ ENZYM HMGCOA REDUCTASE TRÊN DỊCH ĐỒNG THỂ IN VITRO, IN VIVO VÀ TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEPG2 Học viên: Trần Thị Thiên Thanh