Bài viết sử dụng chỉ thị là ITS, matK và psbA-trnH để đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các loài lan kim tuyến và một vài loài khác trong họ lan, đồng thời so sánh giữa phương pháp phân loại bằng hình thái và di truyền phân tử.
HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ PHÂN TÍCH QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ LOÀI LAN TẠI VIỆT NAM Đỗ Thị Gấm1, Hồng Đăng Hiếu2, Phạm Bích Ngọc2, Chu Hồng Hà2 Trung tâm Phát triển cơng nghệ cao Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Chi Lan kim tuyến (Anoectochilus) thuộc họ Lan (Orchidaceae), có tác dụng việc điều trị chứng bệnh đau bụng, tiểu đƣờng, viêm thận, sốt, huyết áp cao, liệt dƣơng, rối loạn gan, lách chứng đau nhói ngực (Lin, 2007) Chi Anoectochilus có khoảng 30 - 40 lồi, loài Lan kim tuyến phân bố khu vực rộng, từ vùng Himalaya đến Đông Nam Á, miền Nam Trung Hoa, Úc, Papua New Guinea số hải đảo thuộc quần đảo Thái Bình Dƣơng Ở Việt Nam thống kê đƣợc 12 loài, phân bố chủ yếu Lào Cai (Sapa, Văn Bàn), Hà Tĩnh (Hƣơng Sơn), Quảng Trị, Kon Tum (núi Ngọc Linh, núi Chƣ Mom Ray), Đắk Lắk (Krông Bông), Lâm Đồng (núi Bidoup), (Nguyễn Tiến Bân, 2005) Do có nhiều tác dụng quý giá nên loài Lan kim tuyến đƣợc thu mua với giá cao Hiện Lan kim Tuyến tự nhiên bị suy giảm bị khai thác tận diệt nên đƣợc đƣa vào Sách Đỏ Việt Nam Nghị định 32/2006/NĐ-CP, xếp hạng EN A1a,c,d, bị cấm khai thác sử dụng mục đích thƣơng mại Do đặc điểm bên loài lan giống nên để phân loại chủ yếu dựa vào hoa Trong tự nhiên, loài Lan kim tuyến có số lƣợng khơng nhiều, mọc rải rác, khả tái sinh thấp, hoa, việc phân loại lồi lan hình thái khó Sử dụng thị ADN cho phép phân loại xác lồi thực vật có mối quan hệ gần gũi cách nhanh chóng xác vào giai đoạn phát triển Các gen dùng làm thị DNA barcode đƣợc nhiều nhà khoa học sử dụng việc phân loại thực vật Hiện nay, nhiều vùng gen đƣợc nghiên cứu để làm thị DNA cho thực vật, nhƣng cần nhiều vùng DNA thị để phân loại xác lồi thực vật (Chase et al., 2007; Kress and Erickson, 2008) Vùng ITS DNA ribosome đƣợc chứng minh có hiệu việc đánh giá mối quan hệ phát sinh loài loài họ (Baldwin, 1992; Chen et al, 2010) Gen matK DNA lục lạp thị đƣợc sử dụng nghiên cứu biến đổi phạm vi loài mức độ thấp (Aoki and Ito, 2000; Soltis et al, 2001) Gen psbA DNA lục lạp thị DNA đƣợc sử dụng có hiệu việc phân tích mối quan hệ di truyền cá thể loài (Kress et al., 2005) Trong nghiên cứu sử dụng thị ITS, matK psbA-trnH để đánh giá mối quan hệ di truyền loài lan kim tuyến vài loài khác họ lan, đồng thời so sánh phƣơng pháp phân loại hình thái di truyền phân tử I VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Mẫu nghiên cứu: Gồm mẫu loài Lan nghiên cứu đƣợc định danh hình thái (Bảng 1) Các mẫu đƣợc làm khô bảo quản silicagel tách chiết DNA Các trình tự ngân hàng gen: JN166019, EU797513, EU797512, KF361656, AJ543911, JN166018, KF261998, JN166026, KJ501999, KF695167, JN166027, JN166023, KF361648, KC704364, KC704368, KC704374, KC704365, HM021626, HM021605, HM021603, EU213755, KF695176, JN166060, GQ328774, EU817408, AJ539483, JN166073, GQ396668, EU700340, JN166058, JF980331, GQ328779, AF366898, HM021601, HM021595, JN166074 133 TIỂU BAN KHU HỆ ĐỘNG VẬT - THỰC VẬT Bảng Thông tin mẫu nghiên cứu STT Tên khoa học Mẫu số Anoectochilus lylei Rolfe ex Downiex Mẫu số Anoectochilus lylei Rolfe ex Downiex Mẫu số Anoectochilus anamensis Aver (2005) Mẫu số Anoectochilus lylei Rolfe ex Downiex Mẫu số Goodyera hispida Lindl (1857) Mẫu số Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl Mẫu số Anoectochilus lylei Rolfe ex Downiex Mẫu số Ludisia discolor Địa điểm thu mẫu Vƣờn quốc gia Bidoup Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng Vƣờn quốc gia Bidoup Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng Vƣờn quốc gia Bidoup Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng Vƣờn quốc gia Bidoup Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng Huyện Mai Châu, tỉnh Hịa Bình Vƣờn thực nghiệm Kon Plong, tỉnh Kon Tum Vƣờn quốc gia Bidoup Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng Vƣờn quốc gia Bidoup Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng Các cặp mồi sử dụng đƣợc liệt kê bảng Bảng Thông tin cặp mồi sử dụng nghiên cứu Vùng gen matK psbA-trnH ITS Chiều Xi Ngƣợc Xi Ngƣợc Xi Ngƣợc Trình tự mồi CGATCTATTCATTCAATATTTC TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT Nhiệt độ gắn mồi (°C) 50 GTTATGCATGAACGTAATGCTC CGCGCATGGTGGATTCACAATCC 52 ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC 54 Phƣơng pháp nghiên cứu Tách chiết DNA tổng số, khuếch đại gen đích kỹ thuật PCR giải trình tự gen: DNA tổng số đƣợc tách chiết phƣơng pháp CTAB Doyle Doyle (Doyle and Doyle 1987) kiểm tra điện di gel agarose Kỹ thuật PCR khuếch đại gen đích với cặp mồi với chu trình nhiệt: 94oC/5‟; 35 chu kỳ (94oC/30‟‟; 50-54oC/60”; 72oC/50‟‟); 72oC/10‟ Sản phẩn PCR đƣợc kiểm tra gel agarose 1% đƣợc tinh sử dụng kit Qiaquick gel purification Trình tự đoạn DNA đƣợc xác định hệ thống ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) theo nguyên lý Sanger Phân tích kết quả: So sánh trình tự thu đƣợc với với trình tự loài Lan khác phần mềm BioEdit, xây dựng phát sinh chủng lọai phần mềm DNAstar, giá trị bootstrap đƣợc sử dụng 1000 lần 134 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ II KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết phân tích hình thái Các mẫu LKT 1, LKT 2, LKT 3, LKT 4, LKT 7, LKT đƣợc thu hái Vƣờn quốc gia Bidoup Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng; mẫu LKT đƣợc thu hái huyện Mai Châu, tỉnh Hịa Bình mẫu LKT thu hái vƣờn thực nghiệm Kon Plong, tỉnh Kon Tum (Bảng 1) Tất mẫu đƣợc xác định tên khoa học phòng Thực vật Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Dựa vào đặc điểm hình thái thân, rễ, hoa (theo mô tả đƣợc công bố “Sách Đỏ Việt Nam, phần II Thực Vật” phân loại loài Lan kim tuyến “Cây cỏ Việt Nam” GS Phạm Hoàng Hộ), xác định đƣợc loài thuộc chi nhƣ thống kê Bảng 1, hình a b e f c d g h Hình 1: Hình ảnh mẫu lan nghiên cứu a, b, c, d ,e, f, g, h: tƣơng ứng với mẫu LKT 1, LKT2, LKT4, LKT7, LKT3, LKT5, LKT6, LKT8 Kết phân tích trình tự gen xây dựng hệ thống phân phát sinh chủng loại Gen matK Đoạn gen matK đem phân tích trình tự có kích thƣớc 900 bp, nhƣng tiến hành so sánh với trình tự ADN tƣơng đồng từ lồi lan có ngân hàng trình tự ADN Genbank, chúng tơi so sánh đƣợc đoạn gen có kích thƣớc 455 bp Trong lồi nghiên cứu, tìm thấy trình tự loài là: Anoectochilus lylei, Anoectochilus roxburghii, Ludisia discolor Hệ số tƣơng đồng mẫu LKT1, LKT2, LKT4, LKT7 100% tƣơng đồng 99,8% so với loài Anoectochilus lylei, mẫu LKT6 có hệ số tƣơng đồng di truyền 100% so với loài Anoectochilus roxburghii, Anoectochilus koshunensis có hệ số tƣơng đồng di truyền với Anoectochilus formosanus, LKT3 lần lƣợt 99,8% 99,6% Mẫu LKT8 có hệ số tƣơng đồng 100% so với lồi Ludisia discolor mẫu LKT5 có mức độ tƣơng đồng di truyền cao 99,6% so sánh với loài Goodyera virifora Hệ số K2P cho thấy lồi có khoảng cách di truyền xa vùng gen matK Goodyera bomensis Zeuxine nervosa với khoảng cách 7,6% Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng vùng gen matK theo phƣơng pháp Maximum Likelihood Đoạn trình tự đƣợc sử dụng để xây dựng phân loại gồm 455 bp Các vị trí chứa khoảng trống thiếu liệu đƣợc loại bỏ Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng từ trình tự mẫu nghiên cứu 13 trình tự lồi Lan khác ngân hàng Genbank 135 TIỂU BAN KHU HỆ ĐỘNG VẬT - THỰC VẬT LKT7.P1 JN166019.Anoectochilus.lylei 88 LKT2.P1 LKT1.p1 59 LKT4.P1 LKT3.P1 LKT6.P1 89 80 EU797512.Anoectochilus.koshunensis EU797513.Anoectochilus.formosanus 88 KF361656.Anoectochilus.roxburghii 98 JN166018.Anoectochilus.albolineatus 99 LKT8.P1 AJ543911.Ludisia.discolor JN166023.Dossinia.marmorata 55 KF361648.Zeuxine.nervosa 64 KJ501999.Goodyera.fumata KF695167.Goodyera.bomiensis LKT5.P1 50 JN166027.Goodyera.viridiflora 54 KF261998.Goodyera.maximowicziana 56 JN166026.Goodyera.pusilla 83 0.005 Hình 2: Cây phát sinh chủng loại số loài Lan sử dụng vùng gen matK Gen psbA-trnH So sánh 733 bp 800 bp trình tự thu đƣợc vùng gen psbA-trnH với trình tự ADN tƣơng đồng từ lồi lan có ngân hàng trình tự ADN Genbank, nhƣng chi đƣợc quan tâm Anoectochilus, Ludisia Goodyera, tìm thấy trình tự số lồi thuộc chi Goodyera Kết phân tích cho thấy mẫu LKT1, LKT2, LKT3, LKT4, LKT7 có hệ số tƣơng đồng 100% có hệ số tƣơng đồng di truyền vơi mẫu LKT5, LKT6, LKT8 lần lƣợt 98,5%, 99,7% 98,5% Mẫu LKT5 tƣơng đồng di truyền cao với loài Goodyera maximowicziana mức độ tƣơng đồng lên tới 99,5% Khoảng cách di truyền xa 5,1% loài Goodyera schlechtendaliana Chamaegastrodia shikokiana 93 HM021605.Goodyera.rosulacea 87 KF695176.Goodyera.bomiensis HM021603.Goodyera.repens KC704365.Goodyera.schlechtendaliana 90 HM021626.Goodyera.biflora KC704364.Goodyera.maximowicziana 68 KC704368.Goodyera.velutina LKT5.P2 EU213755.Ponthieva.racemosa LKT6.P2 LKT7.P2 LKT4.P2 87 LKT3.P2 LKT1.P2 LKT2.P2 LKT8.P2 93 KC704374.Chamaegastrodia.shikokiana 0.005 Hình 3: Cây phát sinh chủng loại số lồi Lan sử dụng vùng gen psbA-trnH 136 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng vùng gen psbA-trnH theo phƣơng pháp Maximum Likelihood Đoạn trình tự đƣợc sử dụng để xây dựng phân loại gồm 733 bp Các vị trí chứa khoảng trống thiếu liệu đƣợc loại bỏ Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng từ trình tự mẫu nghiên cứu trình tự loài Lan khác ngân hàng Genbank thơng qua MEGA5 Gen ITS So sánh có đoạn gen kích thƣớc 647 bp tổng số 800 bp đoạn gen ITS mẫu nghiên cứu thu đƣợc, với trình tự ADN tƣơng đồng lồi Anoectochilus lylei, Anoectochilus roxburghii, Ludisia discolor có ngân hàng trình tự ADN Genbank, cho thấy: Hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu LKT1, LKT2, LKT4, LKT7 100% 99,8% so với mẫu LKT3 Mẫu LKT6 có hệ số tƣơng đồng di truyền 100% so với loài Anoectochilus roxburghii LKT8 tƣơng đồng 100% so với lồi Ludisia discolor Mẫu LKT5 có hệ số tƣơng đồng di truyền cao 98,3% với loài Goodyera macrantha Khoảng cách K2P lớn 10,6 % đƣợc tìm thấy hai loài Goodyera repens Vrydagzynea lancifolia LKT1.P3 LKT2.P3 LKT4.P3 LKT7.P3 JN166060.Anoectochilus.lylei GQ328774.Anoectochilus.roxburghii 100 86 JN166058.Anoectochilus.albolineatus GQ396668.Anoectochilus.formosanus LKT3.P3 44 LKT6.P3 53 59 EU817408.Anoectochilus.roxburghii EU700340.Anoectochilus.koshunensis JN166074.Vrydagzynea.lancifolia JN166073.Ludisia.discolor LKT8.P3 100 AJ539483.Ludisia.discolor 84 98 LKT5.P3 GQ328779.Goodyera.macrantha JF980331.Goodyera.repens 100 HM021601.Goodyera x tamnaensis 57 AF366898.Goodyera.velutina 90 90 HM021595.Goodyera x tamnaensis 0.01 Hình 4: Cây phát sinh chủng loại số loài Lan sử dụng vùng gen ITS Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng vùng gen ITS phƣơng pháp Maximum Likelihood Đoạn trình tự đƣợc sử dụng để xây dựng phân loại gồm 647 bp Các vị trí chứa khoảng trống thiếu liệu đƣợc loại bỏ Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng từ trình tự mẫu nghiên cứu 14 trình tự loài Lan khác ngân hàng Genbank Đánh giá phân nhánh loài Lan nghiên cứu Với phát sinh chủng loại vùng gen psbA-trnH chúng tơi khơng tìm thấy trình tự chi Anoectochilus Ludisia mà tìm đƣợc số trình tự thuộc chi Goodyera nên khơng nhận diện xác mẫu nghiên cứu nhiên thấy mẫu đƣợc chia làm nhóm chính, với nhóm mẫu LKT5 với lồi thuộc chi Goodyera, nhóm mẫu LKT8 lồi Chamaegastrodia shikokiana nhóm thứ mẫu cịn lại, mẫu thuộc chi phân loại 137 TIỂU BAN KHU HỆ ĐỘNG VẬT - THỰC VẬT Với phát sinh chủng loại matK ITS cho kết tƣơng tự, nhóm mẫu LKT5 với lồi thuộc chi Goodyera (bootstrap 90-100), nhóm mẫu LKT8 loài Ludisia discolor (bootstrap 99-100), độ tƣơng đồng di truyền loài 100%, mẫu LKT8 lồi Ludisia discolor, mẫu lại thuộc nhánh phân loại với với lồi thuộc chi Anoectochilus (bootstrap 98-100), mẫu LKT6 nhóm phân loại với lồi Anoectochilus roxbughii, với độ tƣơng đồng di truyền 100%, kết luận mẫu LKT6 lồi Anoectochilus roxbughii Mẫu LKT1, LKT2, LKT4, LKT7 nhóm phân loại với lồi Anoectochilus lylei có 99,8% vùng gen matK, 100% vùng gen ITS, nên định danh mẫu LKT1, LKT2, LKT4, LKT7 loài Anoectochilus lylei Mẫu LKT3 khơng tìm thấy đƣợc trình tự tƣơng đồng 100%, nhiên xếp lồi thc chi Anoectochilus Sự sai khác vùng gen matK LKT1, LKT2, LKT4, LKT7 so với Anoectochilus lylei đƣợc tìm thấy vi trí nucleotide 228 Trong mẫu Lan kim tuyến nghiên cứu có trình tự G Anoectochilus lylei C, khác biệt vị trí địa lí Nhƣ vậy, kết thu đƣợc cho thấy: thị psbA-trnH khơng có khả phân biệt loài lan nghiên cứu, thị matK phân biệt số lồi nghiên cứu, thị ITS cho phép phân biệt lồi nghiên cứu với Qua khẳng định thị ITS công cụ phân loại hiệu loài lan kim tuyến với Tuy nhiên kết hợp thị matK ITS cho phép phân loại loài lan kim tuyến cách xác điều đƣợc khẳng định qua nghiên cứu TS Vũ Huyền Trang cộng vào năm 2013 (Vũ Huyền Trang cộng sự, 2013) III KẾT LUẬN Trong mẫu Lan đƣợc nghiên cứu, có mẫu thuộc có loài: Anoectochilus lylei, Anoectochilus roxburghii loài Ludisia discolor, mẫu thuộc chi Anoectochilus mẫu thuộc chi Goodyera Trong gen đƣợc sử dụng nghiên cứu, gen ITS phân tách tốt loài Lan với nhau, ƣu gen psbA-trnH matK Chi Anoectochilus có mức độ gần gũi mặt di truyền với chi Ludisia chi Goodyera TÀI LIỆU THAM KHẢO Aoki S., Ito M., 2000 Molecular phylogeny of Nicotiana (Solanaceae) based on the nucleotide sequence of the matK gene Plant Biology 2: 253-378 Baldwin B G., 1992 Phylogenetic utility of the internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA in plants: an example from the compositae Mol Phylogenet Evol 1(1): 3-16 Chase M W., Cowan R S., Hollingsworth P M., van den Berg C., Madrinan S., Petersen G., Seberg O., Jorgsensen T., Cameron K M., Carine M., Pedersen N., Hedderson T A J., Conrad F., Salazar G A., Richardson J E., Hollingsworth M L., Barraclough T G., Kelly L., Wilkinson M., 2007 A proposal for a standard protocol to barcode all land plants Taxon 56: 295-299 Chen S., Yao H., Han J., Liu C., Song J., Shi L., Zhu Y., Ma X., Gao T., Pang X., Luo K., Li Y., Li X., Jia X., Lin Y., Leon C., 2010 Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species PLoS One 5(1): e8613 Kress W J., Erickson D L., 2008 DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics Proc Natl Acad Sci U S A 105(8): 2761–2762 138 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Kress W J., Wurdack K J., Zimmer E A., Weighr L A., Janzen D H., 2005 Use of DNA barcodes to indentify flowering plans Proc Natl Acad Sci USA 102: 8369-8374 Lin W C., 2007 Study of health keeping effects of anoectochilus formosanus Hayata Agriculture World Vol 288, 8-13 Nguyễn Tiến Bân (chủ biên), 2005 Danh lục loài thực vật Việt Nam Tập III, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội,1247 trang Soltis D E., Tago-Nakazawa M., Xiang Q Y., Kawano S., Murata J., Wakabayashi M., Hibsch-Jetter C., 2001 Phylogenetic relationships and evolution in Chrysosplenium (Saxifragaceae) based on matK sequence data Am J Bot 88(5): 883-893 10 Vũ Huyền Trang, Chu Hoàng Hà, Hoàng Đăng Hiếu, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Trƣơng Nam Hải, 2013 Nghiên cứu sử dụng thị DNA mã vạch nhận dạng loài Lan kim tuyến (Anoectochilus roxbughii) Tạp chí Cơng nghệ sinh học 11(1): 121-129 GENETIC ANALYSIS OF SOME ORCHID SPECIES FROM VIETNAM Do Thi Gam, Hoang Dang Hieu, Pham Bich Ngoc, Chu Hoang Ha SUMMARY Members of the genus Anoectochilus share similar morphological characteristics (stem, leaf or root) Curently, they are identified mainly based on flower characteristics In the nature, Anoectochilus populations are small, separately distributed with low reproducibility In addition, over-exploitation has significantly damaged to the flower, leading to the difficulity in identification of these medicinal orchids through morphology In this study, the genetic relationships between five species (Anoectochilus species: Anoectochilus lylei, Anoectochilus anamensis, Anoectochilus roxburghii and two species from another genus: Goodyera hispida and Ludisia discolor) were analyzed using three barcode sequences: matK, psbA-trnH, and ITS The results showed that the psbA-trnH could not distinguish these species On the other hand, the matK could identify three of five species, while the ITS could effectively identify all of the five species Furthermore, the combination of matK and ITS could classified these species much more accurately 139 ... quan tâm Anoectochilus, Ludisia Goodyera, tìm thấy trình tự số lồi thuộc chi Goodyera Kết phân tích cho thấy mẫu LKT1, LKT2, LKT3, LKT4, LKT7 có hệ số tƣơng đồng 100% có hệ số tƣơng đồng di truyền. .. koshunensis có hệ số tƣơng đồng di truyền với Anoectochilus formosanus, LKT3 lần lƣợt 99,8% 99,6% Mẫu LKT8 có hệ số tƣơng đồng 100% so với lồi Ludisia discolor mẫu LKT5 có mức độ tƣơng đồng di truyền. .. Đỏ Việt Nam, phần II Thực Vật” phân loại loài Lan kim tuyến “Cây cỏ Việt Nam? ?? GS Phạm Hoàng Hộ), xác định đƣợc loài thuộc chi nhƣ thống kê Bảng 1, hình a b e f c d g h Hình 1: Hình ảnh mẫu lan