Nghiên cứu chiết tách, tinh chế chất màu từ hạt cây điều nhuộm bằng phương pháp KOH

1 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐHSP Độc lập – Tự – Hạnh phúc KHOA HOÁ - -NHIỆM VỤ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Võ Thị Ngọc Thanh Lớp : 08 – CHD Tên đề tài: Nghiên cứu chiết tách, tinh chế chất màu từ hạt điều nhuộm phương pháp KOH Nguyên liệu, dụng cụ thiết bị: chưng ninh, bếp cách thuỷ, cốc 100ml, bình tam giác 100ml, 250ml, bình định mức 100ml, phễu lọc, phễu chiết, máy đo UVVis, cân điện tử, tủ sấy, tủ nung, bình hút ẩm, nhiệt kế Nội dung nghiên cứu - Xác định độ ẩm, hàm lượng tro hoá, hàm lượng kim loại hạt điều nhuộm - Khảo sát chọn dạng nguyên liệu chiết tối ưu, nồng độ KOH chiết tối ưu, thời gian chiết tối ưu, tỷ lệ rắn/lỏng tối ưu, nhiệt độ chiết tối ưu - Đo IR xác định số nhóm chức chất màu annatto - Định tính, định lượng chất màu annatto dung dịch KOH - Đánh giá cảm quan độc tính chất màu annatto Giáo viên hướng dẫn: GS.TS Đào Hùng Cường Ngày giao đề tài: 25/09/2011 Ngày hoàn thành đề tài: 25/05/2012 Chủ nhiệm Khoa Giáo viên hướng dẫn Sinh viên hoàn thành nộp báo cáo cho Khoa Hoá ngày 25/05/2012 Kết điểm đánh giá Ngày tháng năm 2012 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn thầy giáo GS.TS Đào Hùng Cường tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em thời gian nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo giảng dạy môn thầy cơng tác phịng thí nghiệm Khoa Hoá – Trường Đại học Sư Phạm, Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian nghiên cứu đề tài Cuối cùng, em chân thành cảm ơn gia đình tất bạn bè động viên giúp đỡ em hồn thành khố luận Đà Nẵng, ngày 25 tháng năm 2012 Võ Thị Ngọc Thanh DANH MỤC CÁC BẢNG STT 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 Tên bảng Bảng độ ẩm Bảng hàm lượng tro hoá Bảng hàm lượng số kim loại hạt điều nhuộm Bảng chọn dạng nguyên liệu chiết cảm quan Bảng mật độ quang hai mẫu dung dịch KOH Bảng mật độ quang dịch chiết nồng độ KOH khác Bảng ảnh hưởng nồng độ dung dịch KOH đến hiệu suất chiết Bảng mật độ quang dịch chiết thời gian chiết khác Bảng ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất chiết Bảng mật độ quang dịch chiết tỷ lệ rắn/lỏng khác Bảng ảnh hưởng thể tích KOH đến hiệu suất chiết Bảng ảnh hưởng nhiệt độ đến mật độ quang Bảng ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết Bảng hàm lượng kim loại nặng phẩm màu annatto DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang 33 34 35 36 36 37 39 40 41 42 44 45 46 50 STT 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 1.11 1.12 1.13 1.14 1.15 1.16 1.17 2.1 2.2 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 Tên hình Cây điều nhuộm Quả điều nhuộm non Quả điều nhuộm chín Hạt điều nhuộm Phẩm màu annatto Annatto mát Annatto đồ uống Bột điều nhuộm Chất màu thịt lợn quay Achiote oil Achiote paste Annatto nhuộm loại vải Công thức cấu tạo Clorophyl Công thức cấu tạo số carotenoid Công thức cấu tạo Flavonoid Ống Thilepace Ống Soxhlet Hạt điều nhuộm khô Dụng cụ chưng ninh Mẫu ngâm Phổ UV – Vis hạt điều nhuộm bột điều nhuộm Phổ UV – Vis hấp thụ chất màu với nồng độ dung dịch chiết khác Kết tủa sau axit hoá lọc Phổ UV – Vis dịch chiết với thời gian chiết thay đổi Phổ UV – Vis dịch chiết với thể tích chiết thay đổi Phổ UV – Vis dịch chiết với nhiệt độ chiết thay đổi Phổ hồng ngoại norbixin chiết dung dịch KOH Phẩm màu annatto tan dung dịch KOH tan cồn 960 Phổ hấp thụ phân tử norbixin chiết dung dịch KOH Bột màu annatto Trang 4 12 12 13 13 13 13 14 17 18 20 24 24 26 29 29 35 36 38 40 43 45 47 48 49 50 MỞ ĐẦU Cách bày trí hấp dẫn màu sắc đẹp mắt yếu tố hàng đầu làm nên thành cơng ngành Ẩm thực nói chung tồn giới Bởi từ xa xưa, bà nội trợ biết sử dụng phẩm màu tự nhiên màu đỏ gấc, màu xanh dứa, màu tím cẩm hay màu vàng củ nghệ… để chế biến ăn thêm phần thu hút Cùng với phát triển ngành công nghiệp thực phẩm, phẩm màu tổng hợp ưa chuộng đặc tính rẻ, màu sắc đẹp phong phú, độ bền màu cao… Tuy nhiên việc dùng phẩm màu tổng hợp chưa quản lý chặt chẽ nghiêm ngặt nên nỗi ám ảnh người tiêu dùng phẩm màu tổng hợp khơng an tồn ẩn chứa nhiều nguy gây hại đến sức khỏe người tăng đột biến nhiều loại thực phẩm Do việc lựa chọn phẩm màu thiên nhiên khơng có độc tính để tạo màu cho thực phẩm xu hướng ưa chuộng Vì vậy, việc tìm loại phẩm màu tự nhiên vừa đẹp, vừa có lợi cho sức khỏe, lại có độ bền màu cao đáp ứng yêu cầu người sử dụng nhà khoa học quan tâm Một loại phẩm màu người dân sử dụng phổ biến chất màu annatto lấy từ hạt điều nhuộm có màu đỏ vàng Người dân lấy chất màu cách đun dầu nóng, cho hạt điều mua thị trường vào, cho màu lấy dịch để làm màu thực phẩm cho trực tiếp hạt điều nhuộm vào thức ăn để tạo màu Và giới nhà khoa học chứng minh chất màu chiết từ hạt điều nhuộm không gây độc hại, không ảnh hưởng đến sức khoẻ người nên CODEX đưa vào danh mục loại phẩm màu tự nhiên sử dụng an toàn thực phẩm, dược phẩm, đem lại tính hấp dẫn cho thực phẩm Ngồi ra, loại phẩm màu cịn có hoạt tính sinh học có tác dụng chữa bệnh: giảm cholesterol mẳ, mang tính nhuận trường, chữa bệnh sốt, kiết lị, viêm gan, cao huyết áp, động kinh, tiêu diệt gốc tự loại men gây ung thư thức ăn, nước uống…., giá trị sử dụng nâng cao Ở Việt Nam, điều nhuộm trồng chủ yếu Nam Tây Nguyên Nó viện Hóa học xây dựng mơ hình cộng đồng nhằm góp phần bảo tồn phát triển nguồn gene Việc nghiên cứu quy trình tách chiết chất màu hạt điều nhuộm có ý nghĩa lớn nhằm đưa chất màu tự nhiên annatto vào ứng dụng rộng rãi, góp phần tích cực vào cơng phát triển cơng nghiệp nước ta Trên giới năm sản xuất 10.000 phẩm màu annatto, điều cho thấy phổ biến loại phẩm màu Tuy nhiên việc chế biến sản xuất loại phẩm màu chưa ứng dụng quy mô công nghiệp nước ta Để góp phần giải vấn đề mong muốn xóa tan mối nghi ngờ phẩm màu thực phẩm sức khỏe người sử dụng, chọn đề tài: “NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, TINH CHẾ CHẤT MÀU TỪ HẠT CÂY ĐIỀU NHUỘM BẰNG PHƯƠNG PHÁP KOH” CHƯƠNG TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐIỀU NHUỘM 1.1.1 Tên gọi [5], [6], [8] Tên thường gọi: Cây điều nhuộm, điều màu, cà-ri Tên khoa học: Bixa orellana L (bắt nguồn từ tên nhà thám hiểm người Tây Ban Nha Francisco de Orellana) Các tên khoa học cũ gọi: Bixa acuminata, B americana, B odorata, B platycarpa, B purpurea, B tinctoria, B upatensis, B urucurana, Orellana americana, O orellana Những rocouyer- tên gọi khác: Annatto, annato(French), achiote (Spanish), annatto tree (Anh), orelana (Pháp), kam tai (Thái), kesumba (Indonesia), Acafroa-do-Brasil anato (Bồ Đào Nha), jarak belanda (Malaysia), anotto (Ý), xiêm phung, cham pou, champuk shralok (Campuchia), kamset (Lào) Hình 1.1 Cây điều nhuộm Phân loại khoa học: Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Malavales Họ : Điều nhuộm Bixaceae Chi : Bixa 1.1.2 Đặc điểm thực vật học [6], [9] Điều nhuộm loài bụi hay gỗ nhỏ Cây cao 5-10 m.Vỏ màu xám tro, cành non có lơng tơ màu xám sẫm Lá đơn, mềm, nhẵn, hình ba cạnh, đầu nhọn, phía cuống hình tim dài 12 cm, rộng cm hay hơn, cuống phình đầu, dài 34 cm Hoa lưỡng tính màu đỏ tím hay trắng, lớn (đường kính 4-5 cm) mọc thành chuỳ đầu cành, có lơng tơ Bầu hai nỗn với hai giá noãn mang nhiều noãn Quả to, đỏ tía, hình cầu, mặt có gai mềm, mở hai van, mảnh mang nhiều hạt Hạt hình lập phương cuống ngắn, xung quanh tễ nở thành thứ áo hạt ngắn màu đỏ Hình 1.2 Quả điều nhuộm non Hình 1.3 Quả điều nhuộm chín Khi non, vỏ màu xanh thẫm, mềm, dễ bóp, hạt phía màu đỏ tươi, ướt, trơn, dễ bóp nát Khi già, vỏ màu xanh vàng, hạt phía màu đỏ thẫm, khơ, cứng, khó bóp Khi chín mà khơng thu hoạch kịp thời bị khơ tự nứt, hạt phía khơ lại rơi xuống đất, dễ phát tán phát triển thành điều khác 1.1.3 Đặc điểm sinh thái [6], [8], [9] Cây có nguồn gốc vùng nhiệt đới châu Mỹ, trồng phổ biến Ấn Độ số nước Đông Nam Á Lào, Campuchia Ở nước ta, thường trồng quanh năm trồng phổ biến tỉnh Tây Nguyên, số nơi tỉnh Quảng Nam Trồng đến năm thứ hai điều nhuộm có thu hoạch được, cho tối đa 270 kg hạt màu Thời gian thu hoạch: Cây bắt đầu thu hoạch hạt giống từ năm trồng rừng chăm sóc cách, thu hái quanh năm năm 10 Thời gian thu hoạch điều nhuộm để chiết tách bixin với hàm lượng cao vào khoảng tháng 1, tháng 8, năm (Khoảng tháng sau điều nhuộm cho non) 1.1.4 Thành phần hoá học hạt điều nhuộm [3], [5], [6] Trong cơm hạt điều nhuộm có 20-30% nước, đường, chất dễ bay chiếm 20-28%, oclean 4,0-5,5%, sucrose 3,5-5,2%, 0,3-0,9% tinh dầu, saponin, palmitin, phytosterol, vitamin A(chủ yếu   caroten) Hình 1.4 Hạt điều nhuộm Thành phần quan trọng bixin norbixin (trong dịch chiết annatto hạt điều) Bixin (chủ yếu cis-bixin) este monomethyl acid dicarboxilic norbixin, chiếm 80% phần cơm hạt điều Nó có màu đỏ tươi, có tinh thể Hợp chất thiên nhiên cis-bixin bền, dễ chuyển thành dạng bền vững trans-bixin hay izobixin Bixin kết tinh acid axetic hình thành phiến màu đỏ tươi, tan dung môi hữu cơ, dầu thêm acid sunfuric đặc chuyển thành xanh Thuỷ phân kiềm tạo thành norbixin Norbixin acid dicarboxilic, có màu vàng, tan nước Bên cạnh bixin số lượng lớn chất màu khác nghiên cứu tính chất từ phần chiết điều nhuộm bao gồm apocarotenoids (C30 C32), diapocarotenoids (C19, C22, C24, C25) dẫn xuất carotenoid (C14) 48 quang D giảm dung dịch KOH đậm đặc hệ thống nối đơi liên hợp bị phá huỷ Hình 3.6 Phổ UV-Vis dịch chiết dung dịch KOH với thể tích thay đổi Trong Mẫu 1: Mẫu 5: Mẫu 2: Mẫu 6: Mẫu 3: Mẫu 7: Mẫu 4: 3.2.7.2 Khảo sát theo hiệu suất chiết Tiến hành chưng ninh mẫu với thể tích dung dịch KOH 80ml, 100ml, 120ml, 140ml, 160ml, 180ml, 200ml Lọc nóng thu dịch chiết Làm dịch chiết cách chiết với dung môi n-hexxan phễu chiết Chiết n-hexxan khơng bị đổi màu Sau axit hố HCl đặc cho đạt giá trị pH =  xuất kết tủa màu đỏ lọc kết tủa thu phẩm màu annatto có màu đỏ tươi, sấy nhiều tủ sấy nhiệt độ 450C khô Cân khối lượng chất màu thu tính hiệu suất q trình chiết tách 49  Kết thu thể bảng 3.11 Bảng 3.11 Ảnh hưởng thể tích KOH đến hiệu suất chiết STT Thể tích KOH (ml) m0 (gam) m1 (gam) m2 (gam) m (gam) % Chất màu 80 10,015 1,549 3,475 1,926 19,23 100 10,004 1,586 4,162 2,576 25,75 120 10,006 1,515 4,597 3,082 30,80 140 10,005 1,517 4,771 3,254 32,52 160 10,008 1,561 4,712 3,151 31,48 180 10,010 1,596 4,489 2,893 28,90 200 10,012 1,572 4,382 2,810 28,06 Trong đó: m0 : khối lượng hạt điều nhuộm m1 : khối lượng giấy lọc m2 : khối lượng giấy lọc + chất màu sau lọc m : khối lượng chất màu chiết Như hiệu suất chiết tốt chưng ninh 10g hạt điều nhuộm 140 ml dung dịch KOH 0,4M thời gian 800C 32,52%  Cả hai phương pháp cho thấy thể tích dung dịch KOH chiết tối ưu 140 ml 3.2.8 Khảo sát nhiệt độ chiết tối ưu 3.2.8.1 Khảo sát theo mật độ quang - Lấy mẫu với 10g hạt điều/ 150ml dung môi KOH 0,4M, đánh số thứ tự mẫu, chưng ninh khoảng nhiệt độ: Mẫu 1: 50 ; Mẫu 2: 60; Mẫu 3: 70; Mẫu 4: 80, mẫu 5: 90 - Lắp dụng cụ chưng ninh, nhánh bình cầu có nút gắn với nhiệt kế Tiến hành chưng ninh bếp đun bình cầu thời gian - Lọc nóng dịch chiết, hút 1ml dịch chiết cho vào bình định mức 50ml, định mức đến vạch nước cất Đo UV – VIS vùng từ 400 nm ÷ 700nm, dung dịch mẫu trống dung dịch KOH 50  Kết thu thể bảng 3.12 Bảng 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ đến mật độ quang Mẫu Mật độ quang D Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu (50) (60) (70) (80) (90) 453 1,443 1,453 1,724 1,510 1,495 480 1,195 1,176 1,409 1,085 1,127 430 1,214 1,279 1,534 1,233 1,198  nm Hình 3.7 Phổ UV-Vis dịch chiết dung dịch KOH với nhiệt độ thay đổi Trong Mẫu 1: Mẫu 4: Mẫu 2: Mẫu 5: Mẫu 3: Từ phổ hấp thụ UV – VIS cho thấy mật độ quang tăng dần từ 500C đến 700C Tại 700C đạt giá trị hấp thụ quang D cao Mật độ quang 800C 900C không giảm nhiều nhiệt độ cao (trên 70 độ) khơng có số hợp chất 51 màu bị biến đổi cấu trúc mà số chất hữu khác (gluxit, protein,…) bị phân huỷ nên nhiệt độ chiết tối ưu chất màu 700C 3.2.8.2 Khảo sát theo hiệu suất chiết Tiến hành chưng ninh mẫu nhiệt độ khác 500C, 600C, 700C, 800C, 900C Lọc nóng thu dịch chiết Làm dịch chiết cách chiết với dung môi n-hexxan phễu chiết Chiết n-hexxan không bị đổi màu Sau axit hố HCl đặc cho đạt giá trị pH =  xuất kết tủa màu đỏ lọc kết tủa thu phẩm màu annatto có màu đỏ tươi, sấy nhiều tủ sấy nhiệt độ 450C khơ Cân khối lượng chất màu thu tính hiệu suất trình chiết tách  Kết thu thể bảng 3.13 Bảng 3.13 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết STT Nhiệt độ m0 m1 m2 M % Chất màu 50 10,013 1,593 2,547 0,954 9,53 60 10,014 1,611 2,807 1,196 11,94 70 10,021 1,648 3,377 1,729 17,25 80 10,02 1,627 3,267 1,640 16,37 90 10,019 1,587 3,051 1,464 14,61 Trong đó: m0 : khối lượng hạt điều nhuộm m1 : khối lượng giấy lọc m2 : khối lượng giấy lọc + chất màu sau lọc m : khối lượng chất màu chiết Như hai phương pháp chứng tỏ nhiệt độ chiết tối ưu 700C  Kết hợp yếu tố tối ưu thu phần trăm phẩm màu cao 17,25% 3.2.9 Đo phổ hồng ngoại IR Lấy 10g hạt điều nhuộm chưng ninh với 140 ml KOH 4h 700C Lọc nóng thu dịch chiết Sau chiết với n-hexan để loại bỏ tạp chất cịn lẫn 52 dịch chiết Axit hố dịch chiết thu kết tủa Sấy khô kết tủa 450C thu phẩm màu annatto dạng rắn Ta lấy mẫu đem đo IR Hình 3.8 Phổ hồng ngoại norbixin chiết dung dịch KOH Hình 3.8 Phổ IR norbixin chất màu annatto 53  Kết kiểm tra cho thấy mẫu annatto có chứa số nhóm chức Dao động hố trị nhóm –OH khoảng: 3323,14 cm-1 C Dao động hố trị nhóm C khoảng: 2923,22 cm-1 H Dao động hoá trị nhóm –N+ - O+ khoảng: 1229,48 cm-1 Dao động hố trị nhóm = C – O – C – khoảng: 1026,03 cm-1 Dao động hố trị nhóm = C – H khoảng: 573,83 cm-1 H C Dao động hố trị nhóm C khoảng: 1539,13 cm-1 Dao động hố trị nhóm O- amino O- hiđroxy arcy xeton khoảng: 1654,44 cm-1 3.2.10 Định tính phẩm màu annatto dung dịch KOH 3.2.10.1 Độ tan phẩm màu Hoà tan 5g cao màu annatto 100ml dung dịch KOH 5% 100ml etanol 960 Sau vài tiếng đồng hồ quan sát thấy cao màu annatto tan dung dịch KOH tạo thành dịch màu Còn etanol 960 cao màu annatto tan khơng hết, cịn đáy cốc Hình 3.9 Phẩm màu annatto tan dung dịch KOH tan cồn 960 54 3.2.10.2 Hấp thụ UV-Vis Hoà tan cao màu annatto vào nước cất ta thu dung dịch màu Sau đó, cho dung dịch vào cuvet rửa Chuẩn bị mẫu trống nước cất lần Lau khơ bên ngồi cuvet, cho dung dịch màu vào cuvet Tiến hành đo UV-Vis  Kết đo hình 3.10 55  Vậy bước sóng hấp thụ cực đại norbixin 451 nm 478 nm 3.2.11 Đánh giá cảm quan độc tính phẩm màu annatto 3.2.11.1 Cảm quan Bột màu annatto có màu đỏ sẫm 3.2.11.2 Hàm lượng kim loại nặng Hình 3.11 Bột màu annatto Lấy mẫu cao màu annatto hoà tan dung dịch KOH thu dịch màu, sau xác định hàm lượng kim loại nặng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, Trung tâm khí tượng thuỷ văn, số 660 Trưng Nữ Vương – Đà Nẵng  Kết đo bảng 3.14 Bảng 3.14 Hàm lượng kim loại nặng phẩm màu annatto Kim loại Cu2+ Pb2+ Hg2+ Hình 3.10 Phổ hấp thụ phân tử norbixin chiết dung dịch KOH Hàm lượng (mg/kg phẩm 0,873 0,387 0,053