Phân lập, sàng lọc và tuyển chọn chủng vi sinh vật phân hủy polyetylen từ mẫu đất

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẶNG THỊ NGỌC SANG PHÂN LẬP, SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN HỦY POLYETYLEN TỪ MẪU ĐẤT Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ Tp Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2021 VIET NAM NATIONAL UNIVERSITY HO CHI MINH CITY UNIVERSITY OF TECHNOLOGY DANG THI NGOC SANG ISOLATION, SCREENING AND SELECTING OF POLYETYLEN DEGRADING MICROORGANISMS FROM GARBAGE SOIL Major: Biotechnology MASTER RESEARCH PROPOSAL Ho Chi Minh City, January 2021 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI: TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG - HCM Cán hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Cán chấm nhận xét 1: PGS TS Phan Thị Phượng Trang Cán chấm nhận xét 2: TS Nguyễn Tiến Dũng Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường: Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP HCM ngày 26 tháng 01 năm 2021 Thành phần hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ bao gồm: Chủ tịch: PGS TS Nguyễn Đức Lượng Phản biện 1: PGS TS Phan Thị Phượng Trang Phản biện 2: TS Nguyễn Tiến Dũng Ủy viên: PGS TS Nguyễn Thúy Hương Thư ký: PGS TS Lê Thị Thủy Tiên Xác nhận Chủ tịch Hội đống đánh giá luận văn trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn chỉnh sửa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KTHH ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự – Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: ĐẶNG THỊ NGỌC SANG MSHV: 1870195 Ngày, tháng, năm sinh: 11/11/1990 Nơi sinh: Long An Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201 I TÊN ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP, SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN HỦY POLYETYLEN TỪ MẨU ĐẤT II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG Phân lập vi sinh vật có khả phân hủy polyetylen từ đất Sàng lọc tuyển chọn đánh giá chủng có khả phân hủy nhựa polyetylen III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 02/ 2020 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 12/2020 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Tp HCM, ngày 18 tháng 01 năm 2021 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) (Họ tên chữ ký) TRƯỞNG KHOA (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin gửi lời cảm ơn đến quý Thầy Cô môn Công nghệ sinh học trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh cho tơi kiến thức chuyên sâu, bổ ích suốt thời gian tham gia chương trình Cao học trường Những kiến thức kết hợp với đường nghề nghiệp mà chọn sau tốt nghiệp Đại học tới sở để thực đề tài “PHÂN LẬP, SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN HỦY POLYETYLEN TỪ MẨU ĐẤT” Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Nguyễn Thúy Hương đóng góp quan trọng việc định hướng mục tiêu Luận văn Thạc sĩ Trong trình thực đề tài, lúc gặp khó khăn Cơ người đồng hành em, động viên em để vượt qua khó khăn Một lần em xin cảm ơn Cô Tôi xin cảm ơn sâu sắc đến thầy Thiện phụ trách phịng thí nghiệm môn Công nghệ sinh học hỗ trợ tạo không gian môi trường làm việc thân thiện thời gian thực đề tài trường Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn người bạn, người chị, phịng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Bách Khoa bên cạnh động viên, chia sẻ với suốt thời gian thực đề tài Con xin cảm ởn gia đình ln động viên hỗ trợ cách Gia đình ln cho lời khun bổ ích ln ủng hộ định Xin cảm ơn Chị gái người động viên mặt tinh thần lúc khó khăn Kiến thức tơi chưa hồn thiện, cịn nhiều thiếu sót q trình thực viết Luận văn Thạc sĩ Rất mong q Thầy, Cơ thơng cảm cho góp ý để đề tài hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! TP Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 01 năm 2021 TÓM TẮT Việc sử dụng polyetylen tăng lên theo thời gian việc phân hủy trở thành thách thức lớn Nghiên cứu nhằm mục đích phân lập sàng lọc tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả phân hủy nhựa polyetylen mật độ thấp Nghiên cứu tiến hành phân lập vi sinh vật có khả phân hủy nhựa từ mẫu đất thu thập 19 chủng vi sinh vật có khả phân hủy PE, qua sàng lọc định danh tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus drentensis B8 chủng nấm Aspergillus fumigatus F7 có tiềm phân hủy PE Các kết khảo sát khả giảm trọng lượng PE (48,8%); khoảng cách PE cách bề mặt môi trường; độ bền kéo; thay đổi FTIR thay đổi cấu trúc bề mặt PE (SEM) chứng minh khả phân hủy PE chủng an toàn ưu Bacillus drentensis B8 Nghiên cứu kiến nghị cần khảo sát với chủng ứng viên bảo quản sưu tập ABSTRACT Polyethylene has been used increasingly over time, and its degradation is becoming a great challenge This study aimed at isolating and identifying bacteria and fungi that have the capacity to degrade low density polyethylene” From the isolated microorganisms, totally 19 organisms were screened based on their ability to utilize polyethylene as sole carbon source Bacillus drentensis B8 and Aspergillus flavus F7 were ones of the isolates identified in this study They have the potential to degrade PE The extent of biodegradation on the polyethylene sheets was assessed by various techniques including weight loss analysis (48.8%), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), PE distance from environmental surface, tensile and change of surface structure of PE (SEM), genus Bacillus drentensis B8 were confirmed to be good candidates for PE biodegradation Further research is also recommended to survey biodegradation of strains of microorganisms preservation in strain collection LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Học viên Đặng Thị Ngọc Sang MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC HÌNH .ii DANH MỤC BẢNG .iii DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ .iii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung nhựa 1.1.1 Tổng quan ngành nhựa giới Việt Nam 1.1.2 Tác động chất thải nhựa đến hệ sinh thái người 1.2 Các phương pháp xử lý chất thải nhựa 1.2.1 Tổng quan phương pháp xử lý rác thải nhựa 1.2.2 Tái chế rác thải nhựa 1.2.3 Ảnh hưởng việc chôn lắp rác thải nhựa đến môi trường 1.2.4 Ảnh hưởng việc thiêu đốt rác thải nhựa đến môi trường 1.3 Giới thiệu polyetylen 1.4 Cơ chế phân hủy polyetylen 11 1.4.1 Giai đoạn giảm cấp phi sinh học 12 1.4.2 Giai đoạn giảm cấp tác dụng vi sinh vật 12 1.5 Cơ chế phân hủy sinh học polyetylen 13 1.6 Các nghiên cứu nước liên quan đến đề tài 16 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 2.2 Vật liệu, môi trường, thiết bị hóa chất 22 2.2.1 Vật liệu 22 2.2.2 Môi trường nuôi cấy 22 2.2.3 Hóa chất 23 2.2.4 Trang thiết bị 23 2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 24 2.4 Thuyết minh sơ đồ 25 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu phân lập 25 2.4.2 Sàng lọc nhanh chủng có khả phân hủy polyetylen 28 2.4.3 Đánh giá khả phân hủy PE chủng tuyển chọn 29 2.5 Các phương pháp phân tích 30 2.5.1 Phương pháp nhuộm Gram 30 2.5.2 Định danh chủng vi sinh vật phân hủy polyetylen 31 2.5.3 Phương pháp đo quang phổ FTIR 31 2.5.4 Kính hiển vi điện tử quét (SEM) 33 2.5.5 Phân tích thay đổi lực kéo đứt PE 35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Các thí nghiệm đánh giá khả sử dụng PE vi sinh vật 36 3.1.1 Kết đánh giá khả sử dụng PE vi sinh vật đất 36 3.1.2 Đa dạng sưu tập vi sinh vật phân hủy PE 37 3.2 Sàng lọc, tuyển chọn nhanh chủng vi sinh vật có khả phân hủy nhựa PE định danh chủng tiềm 37 3.2.1 Sàng lọc, tuyển chọn chủng có khả phân hủy nhựa PE 38 3.2.2 Kết định danh chủng vi sinh vật tiềm 40 3.3 Nghiên cứu khả phân hủy PE chủng tiềm 43 3.3.1 Nghiên cứu khả phân hủy PE chủng Aspergillus fumigatus F7 43 3.3.2 Nghiên cứu khả phân hủy PE chủng Bacillus drentensis B8 46 3.3.3 Tổng hợp so sánh với công bố khác 50 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 4.1 Kết luận 53 4.2 Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 61 JF07954 Query 961 Sbjct 525 GTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGG 1020 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGG 466 Query 1021 TACCGGCAGTTACTCCGATACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGACCCGAAGGC 1080 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 465 TACCGGCAGTTACTCCGATACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGACCCGAAGGC 406 Query 1081 CTTCATCGCTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTAC 1140 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 405 CTTCATCGCTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTAC 346 Query 1141 TGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTC 1200 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 345 TGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTC 286 Query 1201 AGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCG 1260 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 285 AGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCG 226 Query 1261 CGGGCCCATCTGTAAGTGTCAGCCGAAACCGACTTTCAGCTTTTCCTCATGAGAGGAAAA 1320 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 225 CGGGCCCATCTGTAAGTGTCAGCCGAAACCGACTTTCAGCTTTTCCTCATGAGAGGAAAA 166 Query 1321 GGATTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTGCC 1380 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 165 GGATTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTGCC 106 Query 1381 CACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACCAACAGGAGCAAGCTCCTATTGAT 1433 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 105 CACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACCAACAGGAGCAAGCTCCTATTGAT Giấy phép số: 05505/ SYT-GPHĐ Sở Y Tế TP HCM cấp ngày 10/03/2016 Giấy chứng nhận AN TOÀN SINH HỌC CẤP II số: 178/GCNATSH Sở Y Tế TP HCM cấp ngày 20/04/2016 Phụ lục 5: Bài báo TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH HO CHI MINH CITY UNIVERSITY OF EDUCATION JOURNAL OF SCIENCE Tập 17, Số 12 (2020): 2198-2209 ISSN: 1859-3100 Vol 17, No 12 (2020): 2198-2209 Website: http://journal.hcmue.edu.vn Bài báo nghiên cứu * PHÂN LẬP SÀNG LỌC TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NHỰA POLYETYLEN Đặng Thị Ngọc Sang*, Lê Thị Cúc Dung, Nguyễn Thúy Hương Trường Đại học Bách khoa, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam * Tác giả liên hệ: Đặng Thị Ngọc Sang – Email: sandang11@gmail.com Ngày nhận bài: 22-9-2020; ngày nhận sửa: 02-12-2020; ngày duyệt đăng: 28-12-2020 TÓM TẮT Việc sử dụng polyetylen tăng lên theo thời gian việc phân hủy trở thành thách thức lớn hàng năm, khoảng 500 tỉ đến 1000 tỉ túi nhựa tiêu thụ tồn cầu Nghiên cứu nhằm mục đích phân lập sàng lọc tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả phân hủy nhựa polyetylen Nghiên cứu tiến hành phân lập thu thập chủng chuẩn, từ 25 chủng vi sinh vật có khả phân hủy PE, qua sàng lọc định danh tuyển chọn chủng Bacillus drentensis (chủng phân lập), Bacillus subtilis ATCC 5230, Aspergillus oryzae ATCC 10124 có tiềm phân hủy PE Các kết khảo sát khả giảm trọng lượng PE (48,8%); khoảng cách PE cách bề mặt môi trường; độ bền kéo; thay đổi FTIR thay đổi cấu trúc bề mặt PE (SEM) chứng minh khả phân hủy PE chủng an toàn ưu Bacillus drentensis Nghiên cứu kiến nghị cần khảo sát với chủng ứng viên bảo quản sưu tập Từ khóa: phân hủy sinh học; FTIR; polyetylen; SEM Giới thiệu Ngày nay, Polyethylene (PE) loại nhựa nhiệt dẻo sử dụng phổ biến chúng có đặc tính bền, đa dạng, tiện dụng rẻ Các loại nhựa nhiệt dẻo sử dụng nhiều PE, PP, PVC PET Trong cấu tiêu thụ vật liệu nhựa toàn cầu năm 2017, PE (với dẫn xuất HDPE, LDPE, LLDPE) PP chiếm tỉ trọng cao với 28% 20% đứng thứ cấu tiêu thụ PVC với 12% (Muhonja, Christabel, Makonde, Magoma, & Imbuga, 2018) Ở Việt Nam, lượng tiêu thụ sản phẩm nhựa tăng lên nhanh chóng Các thống kê nghiên cứu Việt Nam chưa cung cấp thông tin cụ thể lượng, loại thành phần nhựa thải mơi trường, mà có số nghiên cứu chất thải nhựa nói chung số địa phương Phân tích tổng hợp sinh thái quốc gia (NCEAS) Hoa Kì cơng bố kết nghiên cứu Tạp chí Science (tháng 2/2015), Việt Nam, ước tính lượng nhựa thải biển khoảng 0,28-0,73 triệu tấn/năm (chiếm 6% tổng lượng nhựa thải biển giới), đứng thứ danh sách quốc gia có lượng nhựa thải biển nhiều (Jambeck et al., 2015) Cite this article as: Dang Thi Ngoc Sang, Le Thi Cuc Dung, & Nguyen Thuy Huong (2020) Isolating, screening and selecting polyethylen able of degrading microorganisms Ho Chi Minh City University of Education Journal of Science, 17(11), 2198-2209 2198 Đặng Thị Ngọc Sang tgk Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Hiểm họa từ rác nhựa thể chỗ chất liệu bền, chậm phân hủy lại dễ sản xuất Nhựa chất liệu khơng tự phân hủy sinh học mà phân hủy ánh sáng mặt trời phân rã thành mảnh nhỏ Nhựa trở thành thứ gây nhiễm mơi trường lớn có lịng đất, khơng khí đại dương (Jambeck et al., 2015) Để thực việc giảm thiểu chất thải nhựa vào mơi trường trì quản lí bền vững chất thải nhựa, Việt Nam cần có chiến lược cụ thể hành động thiết thực quản lí nhựa thải, đồng thời cần tham khảo cách quản lí, xử lí quốc gia giới, hướng đến tái sử dụng, tạo sản phẩm thay có nguồn gốc sinh học, phân hủy sinh học Phân hủy sinh học định nghĩa q trình làm biến chất vật liệu PE thông qua vi sinh vật Trong q trình cần có tham gia nhiều loại vi sinh vật khác bị chi phối yếu tố như: đặc điểm polymer, loại vi sinh vật chất trình tiền xử lí Trong q trình phân hủy polymer chuyển thành monomer sau monomer khống hóa Phần lớn polymer q lớn để qua màng tế bào nên chúng phải khử thành monomer trước hấp thụ phân hủy tế bào vi sinh vật Suốt trình phân hủy exoenzyme từ vi sinh vật phá vỡ polymer phức tạp tạo phân tử nhỏ chuỗi ngắn ví dụ như: oligomer, dimer, monomer chuỗi ngắn đủ nhỏ để vượt qua màng bán thấm bên vi khuẩn sau sử dụng nguồn carbon lượng Khi sản phẩm cuối CO2, H2O hay CH4 hồn thành q trình phân hủy sinh học polymer (như trích dẫn Shah et al., 2008) Vì PE chất tổng hợp nhân tạo nên khó phân hủy sinh học qua nhiều thực nghiệm tiến hành từ năm 1975 đến (Sangale, Shahnawaz, & Ade, 2012) Nhiều nghiên cứu tìm số chủng giống vi sinh vật có khả phân hủy PE song số lượng hạn chế đa số chủng tìm thấy chủng gây bệnh (Mierzwa-Hersztek, Gondek, & Kopec, 2019) Mục tiêu nghiên cứu tìm thêm chủng vi sinh vật an tồn có hoạt tính phân hủy PE, đồng thời khảo sát chủng tìm thấy trước để tìm chủng vừa mang hoạt tính phân hủy PE cao vừa an toàn, đồng thời định hướng hỗ trợ cho giai đoạn phân hủy PE, nhằm rút ngắn thời gian làm sở cho việc ứng dụng tạo chế phẩm, chủ động việc tăng nhanh trình phân hủy tự nhiên góp phần giảm thiểu nhiễm mơi trường rác thải nhựa Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng - Loại PE lựa chọn đồng thực nghiệm LDPE có độ dày 22,5 µm, khơng có xúc tác phụ gia - Môi trường: + LCFBM (KH₂PO₄: 0,7g; K₂HPO₄: 0,7g; MgSO4 7H2O: 0,7g; NH₄NO₃: 1g; NaCl: 0,005g; FeSO4.7H2O: 0,002g; ZnSO4.7H2O: 0,002g; MnSO4.H2O: 0,001g; nước cất: 1000mL; PE: 1g) môi trường lỏng đặc hiệu với nguồn carbon PE Giúp chọn lọc vi khuẩn có khả phân hủy PE (Yang et al., 2014) 2199 Tập 17, Số 12 (2020): 2198-2209 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM + LCFSDA (nước cất: 1000mL; peptone: 10g; PE: 1g) môi trường lỏng đặc hiệu với nguồn carbon PE Giúp chọn lọc chủng nấm có khả phân hủy PE + CFBAM (được chuẩn bị cách bổ sung thêm 15g agar vào 1000mL môi trường LCFBM) môi trường thạch giúp phân lập vi khuẩn phân hủy PE (Yang et al., 2014) + CFBSDA (được chuẩn bị cách bổ sung 15g agar vào 1000mL môi trường LCFSDA) môi trường thạch dùng phân lập nấm + NB (tryptone: 10g; cao thịt: 5g; NaCl: 5g; nước cất: 1000mL), NA (được chuẩn bị cách bổ sung thêm 15g agar vào 1000mL môi trường NB) Môi trường chứa hàm lượng dinh dưỡng chuẩn cho đa số loài vi khuẩn sử dụng hỗ trợ phân lập vi sinh vật + SDA (dextrose (glucose): 40g; peptone: 10g; agar: 15g; nước cất: 1000mL) môi trường hỗ trợ tăng sinh nấm - Các mẫu đất thu thập từ địa điểm khác (bảng 1) Thành phố Hồ Chí Minh Bảng Các địa điểm thu mẫu đất cho việc phân lập vi sinh vật Mẫu Địa Khu luân chuyển rác Phường Tân Chánh Hiệp, Quận 12 Đất có lẫn mẫu nhựa PE cơng viên Lê Thị Riêng, Quận 10 Khu đất trống nơi tập trung rác ven kênh nước đen đường CN1, Phường Sơn Kỳ, Quận Tân Phú - Các chủng chuẩn: Bacillus subtilis ATCC 5230; Aspergillus niger ATCC 6275; Aspergillus oryzae ATCC 10124; Streptococcus lactis ATCC 11454; Aspergillus glaucus ATCC 14567; Brevibaccillus borstelensis ATCC 51667 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu Thu thập chủng giống Phân lập hoạt hóa giống Đánh giá tiềm phân hủy PE chủng phân lập - Giống chuẩn - Chủng phân lập từ môi trường đất - Chủng phân lập từ mẫu PE mục - Phân lập môi trường CFBAM CFBSDA - Hoạt hóa mơi trường NA SDA - Khoảng cách PE cách bề mặt môi trường - Độ bền kéo đứt Bộ chủng (định danh) Đánh giá khả phân hủy PE chủng tiềm - Trọng lượng PE - Độ chịu lực - Thay đổi tính kị nước - FTIR - SEM Bảo quản chủng (đông sâu) 2200 Đặng Thị Ngọc Sang tgk Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM 2.2.2 Thu thập trữ mẫu - Các mẫu đất thu thập từ địa điểm khác Thành phố Hồ Chí Minh Bảng - Phương pháp thu thập trữ mẫu: dùng dao lấy mẫu đất bên miếng PE bị phân hủy cho vào túi nilon, ghi đem trữ tủ lạnh nhiệt độ 4oC-8oC Mẫu đất lưu trữ Phịng Thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách khoa Thành phố Hồ Chí Minh 2.2.3 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả phân hủy PE a Tuyển chọn sơ chủng vi sinh vật có khả phân hủy PE Lấy 20g đất/mẫu cho vào cốc thủy tinh làm nhuyễn, pha loãng mẫu nồng độ pha loãng khác nhau: 10-4, 10-5, trộn mẫu hút 0,5 ml dịch pha loãng nồng độ cho vào đĩa môi trường đặc hiệu dùng phân lập vi sinh vật phân hủy PE CFBAM CFBSDA với nguồn carbon PE Mẫu ủ tủ 37oC 21 ngày Những khuẩn lạc phát triển môi trường cấy chuyển nhiều lần môi trường NA (vi khuẩn) SDA (nấm) để tuyển chọn chủng trước cấy chuyển sang môi trường chọn lọc LCFBM LCFSDA Chỉ tiêu theo dõi gồm: khoảng cách PE cách bề mặt môi trường LCFBM, LCFSDA độ chịu lực PE b Định danh bảo quản chủng - DNA tổng số tách chiết sau vùng gen 16s-rDNA khuếch đại phản ứng PCR từ DNA tổng số - Sản phẩm phân tích máy đọc trình tự ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, xử lí phần mềm BioEdit Từ kết giải trình tự, so sánh trình tự thu với ngân hàng gen để xác định lồi Mức độ tương đồng trình tự gen vùng 16S-rDNA so sánh với trình tự NCBI - Mẫu phân tích Cơng ty TNHH Thương mại Dịch vụ Nam Khoa Thành phố Hồ Chí Minh - Các giống VSV sau định danh bảo quản phương pháp lạnh sâu -70oC 2.2.4 Phương pháp phân tích tiêu - Đo trọng lượng PE Sự phân hủy xảy biết đổi nhóm etylen cấu trúc PE thành hợp chất khác nên xuất giảm trọng lượng mẫu PE thí nghiệm Đánh giá dựa vào tiêu: + Đo vị trí PE cách bề mặt mơi trường nuôi cấy thước kẹp + Các PE sau rửa sạch, sấy khơ cân để xác định khối lượng - Đo độ chịu lực: dựa vào hai thông số độ bền kéo đứt độ giãn đứt vật liệu, đó: + Độ bền kéo đứt lực lớn mà mẫu thử chịu bị kéo đứt, hiểu dùng lực tác động tăng dần đến vật liệu dạng sợi hay trụ bị đứt; 2201 Tập 17, Số 12 (2020): 2198-2209 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM + Độ giãn đứt tuyệt đối phần chiều dài mẫu thử tăng thêm thời điểm đứt Độ giãn đứt tương đối tỉ số độ giãn đứt tuyệt đối so với độ dài ban đầu mẫu thử, tính phần trăm; + Sử dụng máy kéo nén vạn trục, trục với ngàm kẹp phù hợp để đo độ chịu lực mẫu PE - Đo quang phổ (FTIR): máy đo quang phổ FTIR dùng để nghiên cứu dao động cấu trúc phân tử, để xác định độ tinh khiết chất, phân tích định lượng - Khảo sát thay đổi cấu trúc PE kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope – SEM) Chụp SEM thực Phịng Cơng nghệ Nano, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh 2.2.5 Phương pháp thu thập xử lí số liệu Thí nghiệm bố trí với ba lần lặp, số liệu thu thập, xử lí phần mềm Excel SPSS version 22.0 Kết thảo luận 3.1 Phân lập, thu thập sàng lọc chủng vi sinh vật có khả phân hủy PE Từ 12 mẫu rác nilon mục, nghiên cứu phân lập môi trường đặc hiệu CFBAM 12 chủng (được kí hiệu B1=> B12) mơi trường đặc hiệu LCFSDA chủng (được kí hiệu F1=> F7) Với số chủng phân lập, kết hợp với chủng chuẩn (mục 2.1) ghi nhận có khả phân hủy PE (như trích dẫn Mierzwa-Hersztek, Gondek, & Kopec, 2019, p.605; Sangale, Shahnawaz, Ade, 2012, p.4-7) Đề tài tạo 25 chủng vi sinh vật ứng viên cho nghiên cứu Từ 25 chủng cấy chuyền ổn định nuôi cấy, tiến hành sàng lọc chủng vi sinh vật có khả phân hủy PE thông qua tiêu là: khoảng cách PE cách bề mặt môi trường độ chịu lực PE có đặc tính nhẹ kị nước tồn môi trường lỏng chúng bề mặt môi trường, đồng thời ngăn cách tiếp xúc vi sinh vật với bề mặt PE, PE bắt đầu chìm dần mơi trường lỏng (xác định thơng qua khoảng cách PE cách bề mặt môi trường) tức dấu hiệu tính kị nước PE giảm dần có thay đổi so với ban đầu lực liên kết monomer yếu Kết khảo sát tiêu sau 21 ngày nuôi cấy thể qua Bảng 2202 Đặng Thị Ngọc Sang tgk Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Bảng Sàng lọc chủng vi sinh vật có khả phân hủy PE STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Kí hiệu/ Chủng B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 Bacillus subtilis ATCC 5230 Streptococcus lactis ATCC 11454 Brevibaccillus borstelensis ATCC 51667 Aspergillus niger ATCC 6275 Aspergillus oryzae ATCC 10124 Aspergillus glaucus ATCC 14567 Khoảng cách PE cách bề mặt môi trường (mm) 1,2 3,0 2,5 2,0 5,0 3,5 4,2 5,0 5,5 1,8 3,0 2,5 0,5 0,8 1.2 1,0 1,0 1,5 3,0 4,5 3,5 2,5 1,5 4,0 2,0 Độ bền kéo đứt (GPa) 29,2 27,2 28,0 28,5 26,5 27,2 26,9 26,2 26,0 28,2 27,3 28,1 31,2 30,1 29,5 30,0 29,8 29,2 27,5 27,0 27,4 28,2 29,0 27,1 28,8 Kết thu nhận Bảng cho thấy, 25 chủng ứng viên có khả sinh trưởng mơi trường đặc hiệu có bổ sung PE nguồn carbon Trong 25 chủng vi sinh vật chủng, có chủng sinh trưởng mạnh Trong gồm có chủng phân lập kí hiệu B5, B7, B8, B9 chủng chuẩn Bacillus subtilis ATCC 5230, Aspergillus oryzae ATCC10124 Sau 21 ngày nuôi cấy chủng có dấu hiệu phân hủy rõ kết đo khoảng cách từ vị trí chìm PE đến bề mặt môi trường lớn (≥ mm) độ bền kéo đứt thấp (≤ 27,1 Gpa) Nghiên cứu sàng lọc chủng có tiềm phân hủy PE cao để tiến hành thực nghiệm tiếp sau Trong chủng ưu có chủng phân lập chủng địa kí hiệu B5, B7, B8, B9 Tiến hành định danh chủng địa sàng lọc phương pháp sinh học phân 2203 Tập 17, Số 12 (2020): 2198-2209 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM tử Kết định danh chủng B5 Pseudomonas aeruginosa, B7 Enterobacter cloacae, B8 Bacillus drentensis, B9 Bacillus drentensis Dựa vào kết định danh cho thấy chủng B5 (Pseudomonas aeruginosa) chủng B7 (Enterobacter cloacae) chủng gây bệnh đồng thời có khả tạo độc tố gây bệnh cho người động vật chủng khơng an tồn (Ministry of Health, 2016) Vì từ chủng sàng lọc, đề tài tuyển chọn chủng, chủng phân lập địa Bacillus drentensis B8 (B8 B9 loài Bacillus drentensis có khác khơng đáng kể khoảng cách PE cách bề mặt môi trường độ bền kéo đứt hình ảnh chủng B8 bám bề mặt PE rõ nét chủng B9 nên chọn chủng B8 vào nghiên cứu sâu hơn) chủng chuẩn Bacillus subtilis ATCC 5230, Aspergillus oryzae ATCC 10124 để bảo quản phương pháp đông sâu Về khía cạnh an tồn sinh học chủng B drentensis chủng an tồn khơng gây bệnh Chủng báo cáo chủng Bacillus có lợi ngành dược phẩm ứng cử viên tiềm cho việc phát triển loại thuốc Các chất chuyển hóa thứ cấp từ B.drentensis sử dụng làm chất chống oxy hóa kháng khuẩn mạnh (Hagaggi, 2020) Bên cạnh đó, B drentensis báo cáo chủng tiềm cho việc sản xuất polyhydroxybutyrate (PHB), loại nhựa sinh học, hữu ích cho ứng dụng khác bao gồm vật liệu đóng gói, y tế vật liệu phủ Những kết chứng minh Bacillus drentensis chủng an tồn khơng gây hại cho sức khỏe ứng cử viên thích hợp góp phần giải vấn đề nhiễm nhựa (Penkhrue et al., 2020) 3.2 Nghiên cứu khả phân hủy PE chủng tiềm Bacillus drentensis B8 Bảng Kết khảo sát thay đổi PE sau ủ với chủng B drentensis B8 Chỉ tiêu Thời gian theo dõi (tuần) Ban đầu 12 Thay đổi trọng lượng PE Tỉ lệ giảm Trọng lượng PE (g) (%) 1,000 13,2 0,868 32,0 0,680 48,8 0,512 Khoảng cách PE cách bề mặt môi trường (mm) 6,0 9,2 11,5 2204 Độ bền kéo Độ bền kéo đứt (GPa) Độ giãn dài đứt (%) 32,82 25,11 19,25 15,45 69,15 57,41 40,18 22,15 Đặng Thị Ngọc Sang tgk Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Ống nghiệm Ống đối chứng âm (mẫu khơng xử lí vi sinh) Ống nghiệm Mẫu có xử lí vi sinh Hình Khảo sát thay đổi PE sau ủ với chủng B drentensis B8 Nghiên cứu khả sinh trưởng chủng Bacillus drentensis (chủng B8) môi trường khống có bổ sung PE nguồn carbon cho thấy trọng lượng PE giảm dần theo thời gian đến tuần 12 giảm đến 48,8% so với mẫu ban đầu Kết đo trọng lượng trung bình lặp lại lần đo Khoảng cách PE cách bề mặt môi trường sau thời gian – – 12 tuần có khác biệt rõ rệt Theo thời gian nuôi cấy đến tuần 12 PE cách bề mặt môi trường 11,5 mm, điều chứng tỏ hoạt động chủng B drentensis B8 giúp làm giảm tính kị nước vật liệu PE khiến PE chìm dần vào mơi trường ni cấy Khi tính kị nước vật liệu PE giảm giúp cho tiếp xúc vi sinh vật với bề mặt PE diễn thuận lợi Độ bền kéo đứt PE giảm dần theo tuần – – 12 từ 25,11 giảm xuống 15,45 GPa so với ban đầu 32,82 GPa Tuần thứ 12 độ giãn dài đứt 22,15% khác biệt so với ban đầu 69,15% Bảng Tổng hợp so sánh với nghiên cứu công bố trước Giảm trọng lượng (%) Thời gian tuần tuần 12 tuần Tên chủng so sánh Aspergillus niger Streptococcus lactis Brevibaccillus borstelensis Arthrobacter sp Pseudomonas sp Rhodococcus ruber Bacillus, Micrococcus, Listeria Vibrio Bacillius cerues Psedomonas sp 2205 Chủng so sánh 12,25 12,5 11 12 15 7,5 Chủng B drentensis B8 13,2 13,2 13,2 13,2 13,2 32,0 5% 32,0 12,5 48,8 Tập 17, Số 12 (2020): 2198-2209 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Khi tiến hành tổng hợp so sánh với nghiên cứu trước (Sangale, Shahnawaz, & Ade, 2012) thấy chủng Bacillus drentensis B8 có khả làm giảm đáng kể trọng lượng PE so với chủng so sánh Bảng Sự khác kết cịn khác biệt vật liệu PE thí nghiệm Trong nghiên cứu này, sử dụng loại LDPE độ dày 22,5 µm, khơng có xúc tác phụ gia Có thể có khác biệt với loại LDPE mà nghiên cứu so sánh thực dẫn đến chênh lệch giảm trọng lượng cách đáng kể Một số tiêu đề tài tiến hành thực khoảng cách PE cách bề mặt môi trường (mm), độ bền kéo đứt (GPa), độ giãn dài đứt (%) khơng có cơng bố trước tiêu mà báo đề xuất Khi khảo sát sâu hấp thụ xạ hồng ngoại PE ủ với chủng B drentensis B8 sau 12 tuần, sử dụng phương pháp FTIR (Fourrier Transformation InfraRed – ghi nhận dao động đặc trưng liên kết hóa học nguyên tử) cho thấy có diện nhóm -CH mũi hấp thụ có bước sóng 2921,79 cm¹ 2851,12 cm¹ Ngồi ra, cịn có xuất nhóm chức khác – OH ethylene glycol (mũi hấp thụ 3431,75 3604,79 cm¹), nhóm C=O carbonyl (mũi hấp thụ 1601,17 cm¹) Hình Kết đo FTIR PE sau ủ với chủng Bacillus drentensis B8 2206 Đặng Thị Ngọc Sang tgk Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM (a) (b) Hình (a) Đĩa đối chứng khơng có chủng Bacillus drentensis B8 (b) Chủng Bacillus drentensis B8 môi trường CFBAM Chủng B drentensis B8 xuất phía bề mặt PE (Hình 3b), cịn mặt ngồi mơi trường đặc hiệu CFBAM khơng có, chứng tỏ chủng B drentensis B8 sử dụng nguồn carbon PE để sống phát triển đồng thời chứng tỏ thao tác thí nghiệm PE khơng bị nhiễm Hình Kết chụp PE kính hiển vi điện tử SEM 2207 Tập 17, Số 12 (2020): 2198-2209 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Hình ảnh chụp SEM bề mặt PE dùng làm đối chứng âm khơng xử lí vi sinh (Hình 4) khơng xuất thay đổi bề mặt Sự thay đổi cấu trúc PE thể qua hình ảnh chụp SEM sau 12 tuần ni cấy cho thấy bề mặt phẳng ban đầu vật liệu trở nên gồ ghề, có hố, khoang Vậy qua kết thí nghiệm tiền đề cho thấy chủng B drentensis B8 có khả sử dụng PE, sau 12 tuần khối lượng PE giảm 48,8% so với ban đầu Kết FTIR cho thấy xuất sản phẩm phân hủy PE chất có chứa nhóm C=O carbonyl, nhóm – OH ethylene glycol nhóm –CH polyetylene Cấu trúc PE kính hiển vi điện tử SEM tiến hành so sánh với mẫu đối chứng, ta thấy có tác động vi khuẩn lên bề mặt PE, làm cho bề mặt phẳng ban đầu vật liệu khơng cịn mà trở nên gồ ghề, xuất khe rãnh hố, khoang (Hình 4) Các thí nghiệm cho thấy chủng Bacillus drentensis B8 có khả phân hủy PE Kết luận Nghiên cứu tiến hành phân lập thu thập chủng chuẩn 25 chủng vi sinh vật có khả phân hủy PE, qua sàng lọc định danh tuyển chọn chủng Bacillus drentensis B8 (chủng phân lập), Bacillus subtilis ATCC 5230, Aspergillus oryzae ATCC 10124 có tiềm phân hủy PE Các kết khảo sát khả giảm trọng lượng PE (48,8%); khoảng cách PE cách bề mặt môi trường; độ bền kéo; thay đổi FTIR thay đổi cấu trúc bề mặt PE (SEM) chứng minh khả phân hủy PE chủng an toàn ưu Bacillus drentensis B8 Nghiên cứu kiến nghị cần khảo sát với chủng ứng viên bảo quản sưu tập đồng thời khảo sát thêm chủng tiềm B9 định danh B8 B9 lồi đặc tính khác nên cần khảo sát chủng  Tuyên bố quyền lợi: Các tác giả xác nhận hồn tồn khơng có xung đột quyền lợi TÀI LIỆU THAM KHẢO Ministry of Health, (2016) Thong tu ban hanh danh muc vi sinh vat gay benh truyen nhiem theo nhom nguy co va cap an toan sinh hoc phu hop ky thuat xet nghiem [Circular promulgating the list of microorganisms causing infectious diseases according to risk group and biosafety level in accordance with testing technique] Hagaggi, N (2020) Phenolic Contents, Antioxidant Capacity and Antibacterial Activity of Extracts from Bacillus spp Associated with The Leaves of Some Medicinal Plants Egyptian Academic Journal of Biological Sciences, G Microbiology, 12(1), 55-66 https://doi.org/10.21608/eajbsg.2020.86784 Jambeck, J R., Ji, Q., Zhang, Y.-G., Liu, D., Grossnickle, D M., & Luo, Z.-X (2015) Plastic waste inputs from land into the ocean In Science (Vol 347, Issue 6223, 764-768) https://doi.org/10.1126/science.1260879 Mierzwa-Hersztek, M., Gondek, K., & Kopeć, M (2019) Degradation of Polyethylene and Biocomponent-Derived Polymer Materials: An Overview In Journal of Polymers and the Environment, 27(3), 600-611 https://doi.org/10.1007/s10924-019-01368-4 2208 Đặng Thị Ngọc Sang tgk Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Muhonja, C N., Makonde, H., Magoma, G., & Imbuga, M (2018) Biodegradability of polyethylene by bacteria and fungi from Dandora dumpsite Nairobi-Kenya PLOS ONE, 13(7), e0198446 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0198446 Penkhrue, W., Jendrossek, D., Khanongnuch, C., Pathomareeid, W., Aizawa, T., Behrens, R L., & Lumyongid, S (2020) Response surface method for polyhydroxybutyrate (PHB) bioplastic accumulation in Bacillus drentensis BP17 using pineapple peel In PLoS ONE, 15(3) https://doi.org/10.1371/journal.pone.0230443 Sangale, M K (2012) A Review on Biodegradation of Polythene: The Microbial Approach Journal of Bioremediation and Biodegradation, 3(10) https://doi.org/10.4172/2155-6199.1000164 Shah, A A., Hasan, F., Hameed, A., & Ahmed, S (2008) Biological degradation of plastics: A comprehensive review Biotechnology Advances, 26(3), 246-65 https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2007.12.005 Yang, J., Yang, Y., Wu, W.-M., Zhao, J., & Jiang, L (2014) Evidence of Polyethylene Biodegradation by Bacterial Strains from the Guts of Plastic-Eating Waxworms Environmental Science & Technology, 48(23), 13776-13784 https://doi.org/10.1021/es504038a ISOLATING, SCREENING AND SELECTING POLYETHYLEN ABLE OF DEGRADING MICROORGANISMS Dang Thi Ngoc Sang*, Le Thi Cuc Dung, Nguyen Thuy Huong Ho Chi Minh City University of Technology, Vietnam National University Ho Chi Minh City, Vietnam * Corresponding author: Dang Thi Ngoc Sang – Email: sandang11@gmail.com Received: September 22, 2020; Revised: December 02, 2020; Accepted: December 28, 2020 ABSTRACT Polyethylene has been used increasingly over time, and its degradation is becoming a great challenge Annually, approximately 500 billion to trillion polyethylene carry-bags are being consumed worldwide This study aimed at isolating, screening and selecting microorganisms that are able to degrade polythene A total of 25 microorganism were isolated Bacillus drentensis, Bacillus subtilis ATCC 5230 and Aspergillus oryzae ATCC 10124 were ones of the isolates identified in this study They have the potential to degrade PE The extent of biodegradation on the polyethylene sheets was assessed by various techniques including weight loss analysis (48.8%), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), PE distance from environmental surfac, tensile and change of surface structure of PE (SEM), genus Bacillus drentensis were confirmed to be good candidates for PE biodegradation Further research is also recommended to survey biodegradation of strains of microorganisms preservation in strain collection Keywords: Biodegradation; FTIR; Polyethylene; SEM 2209 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: Đặng Thị Ngọc Sang Ngày, tháng, năm sinh: 11 tháng 11 năm 1990 Nơi sinh: Long An Địa liên lạc: 521/88/2 CMT8, P.13, Q.10 Quá trình đào tạo Năm đào tạo Tên ngành Tên trường Năm 2008 - 2012 Kỹ sư Công nghệ sinh học Đại học Văn Lang 9/2012 – 3/2013 Thực hành hóa sinh lâm sàng Đại học Y dược Tp, HCM 6/2016 – 10/2016 Kỹ thuật y học chuyên ngành xét nghiệm Công nghệ sinh học Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch Đại học Bách Khoa Tp, HCM 2018 – Q trình cơng tác Từ 2013 – 2015: Kỹ thuật viên vi sinh Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp ứng dụng công nghệ Carta Từ 2015 – nay: Kỹ thuật viên xét nghiệm Bệnh viện Nhân Dân Gia Định ... nghệ sinh học Mã số: 8420201 I TÊN ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP, SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN HỦY POLYETYLEN TỪ MẨU ĐẤT II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG Phân lập vi sinh vật có khả phân hủy polyetylen. .. hủy PE từ mẫu đất khái quát sơ đồ 2.1 Mẫu đất mẫu ni lông mục Phân lập vi sinh vật phân hủy PE Sàng lọc tuyển chọn nhanh chủng có khả phân hủy PE - Nhân giống vi sinh vật LCFBM - Tách chủng vi. .. gia giới Từ đề tài nghiên cứu ? ?Phân lập, sàng lọc tuyển chọn chủng vi sinh vật phân hủy polyetylen từ mẫu đất? ?? thực Mục tiêu nghiên cứu Tìm chủng vi sinh vật địa an tồn có hoạt tính phân hủy PE