Xác định hộp rpos và rpon ở vùng promoter của ổ gen mã hóa cho hệ thống bài xuất số 3 ở burkholderia pseudomallei (bp) bằng sinh tin học

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TỒN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÁC ĐỊNH HỘP RPOS VÀ RPON Ở VÙNG PROMOTER CỦA Ổ GEN MÃ HÓA CHO HỆ THỐNG BÀI XUẤT SỐ Ở BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI (BP) BẰNG SINH TIN HỌC Mã số: 340-17 Chủ nhiệm đề tài: TS Đường Thị Hồng Diệp Tp Hồ Chí Minh, Tháng 6/2018 MỤC LỤC Trang Mục lục………………………………………………………………… Danh mục bảng biểu…………………………………………………….3 Thông tin chung…………………………………………………………4 Mục tiêu………………………………………………………………….4 Nội dung chính………………………………………………………… 4 Kết đạt được…………………………………………………5 Hiệu kinh tế…………………………………………………………5 Tổng quan tài liệu phương pháp nghiên cứu………………………6 6.1 Lịch sử…………………………………………………… …… 6.2 Dịch tễ học…………………………………………………… …7 6.3 Vi khuẩn học sinh bệnh học…………………………………11 6.4 Hệ thống xuất protein …………………………………… 16 6.5 Yếu tố phiên mã RpoS RpoN vi khuẩn Gram âm……….19 6.6 Phần mềm HMMer………………………………………………21 6.7 Câu hỏi nghiên cứu………………………………………………24 6.8 Đối tượng phương pháp nghiên cứu…………………… …24 Kết bàn luận…………………………………………………….25 Chương I…………………………………………………………… 25 Chương II……………………………………………………………26 Chương III………………………………………………………… 27 Kết luận kiến nghị ………………………………………………….30 Phụ lục………………………………………………………………… 31 10 Tài liệu tham khảo …………………………………………………….34 DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG BIỂU Trang Hình Bản đồ phân bố melioidosis giới………………………… Hình Khuẩn lạc B pseudomallei ni cấy lâu ngày………………….….12 Hình Khuẩn lạc B pseudomallei ni cấy 24-48h…………………….…12 Hình B pseudomallei nhuộm Gram………………………………….… 12 Hình Bộ gene B pseudomallei………………………………………….…12 Hình Vùng gene T3SS-3 B pseudomallei K96243.…………………18 Hình Sơ đồ gene B pseudomallei ổ gene T3SS3 hay gọi T3SS/bsa locus.………………………………………………………………………… 25 Bảng BipB operon – kết dự đoán phần mềm online DOOR 26 Hình Sơ đồ gene bipB bipD operon (Kết DOOR) với hộp RpoS xác định qua phần mềm HMMer …………… …………………… 29 Hình Sơ đồ gene vùng gene bsaZ-bicA-bipB-bipC-bprA-bipD T3SS/bsa locus với hộp RpoN tìm thấy ………………………………29 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Thơng tin chung: - Tên đề tài: Xác định hộp RpoS RpoN vùng promoter ổ gen mã hóa cho hệ thống xuất số Burkholderia pseudomallei (Bp) sinh tin học - Mã số: 340-17 - Chủ nhiệm đề tài: TS Đường Thị Hồng Diệp Điện thoại: 0989369390 Email: diepdh@yahoo.com - Người thực hiện: TS Đường Thị Hồng Diệp - Đơn vị cộng tác: Bộ mơn Sinh hóa, Đại học Mahidol (Thái lan) - Đơn vị quản lý chun mơn (Khoa, Tổ mơn): Bộ mơn Hóa sinh, Khoa Y - Thời gian thực hiện: 01 năm Mục tiêu: Dùng sinh tin học xác định hộp RpoS hộp RpoN vùng promoter ổ gene mã hóa cho hệ thống xuất protein số vi khuẩn Bp Nội dung chính: Tìm gene vi khuẩn Burkholderia pseudomallei (Bp) sở liệu NCBI Khu trú ổ gene mã hóa cho hệ thống xuất số Bp Tổng quan tài liệu, tổng hợp viện cho hộp vi khuẩn Gram âm liệu RpoS xây dựng RpoN thư vùng promoter Đưa liệu vào phần mềm HMMer3 (Hidden Markov Model version 3): xây dựng training set (tập huấn luyện) Sử dụng phần mềm HMMer3 xác định hộp RpoS RpoN Bp Tổng kết báo cáo kết Kết đạt (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ): Công bố tạp chí nước (tên báo, tên tạp chí, năm xuất bản): báo Xác định hộp RpoS RpoN vùng promoter ổ gen mã hóa cho hệ thống xuất số Burkholderia pseudomallei (Bp) sinh tin học Đường Thị Hồng Diệp Y học TP Hồ Chí Minh*Tập 22*Số 2*2018 Hiệu kinh tế - xã hội đề tài mang lại: Kết nghiên cứu chuyển giao cho Trung tâm Y sinh học phân tử, để sử dụng cho nghiên cứu sinh bệnh học Burkholderia pseudomallei góp phần nâng cao hiểu biết vi khuẩn phục vụ điều trị bệnh Melioidosis khoa nhiễm bệnh viện TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6.1 LỊCH SỬ: Melioidosis bệnh dịch địa phương vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Đông nam Á, bắc Úc, châu Phi, Trung Đông, Trung quốc, Ấn độ Nam Mỹ Những ca melioidosis báo cáo nhiều Thái lan, nơi mà bệnh truyền nhiễm gây nên vi khuẩn Gram âm Burkholderia pseudomallei (B pseudomallei) ghi nhận chiếm tới 20% tổng số ca nhiễm trùng huyết với tỷ lệ tử vong cao điều trị kháng sinh B pseudomallei vi khuẩn hoại sinh sống môi trường đất ẩm ướt nước tù đọng, đặc biệt vùng trồng lúa nước[27] Lần vào năm 1911, nhà bệnh học Alfred Whitmore cộng C S Krishnaswami mô tả melioidosis bệnh “glanders-like” ( giống bệnh nhiễm trùng động vật) nhóm người nghiện morphine tỉnh Rangoon, Myanmar [17][73] Họ đề xuất tác nhân gây bệnh vi khuẩn Vi khuẩn phân lập từ mẫu khám nghiệm tử thi bệnh nhân nuôi cấy môi trường thạch peptone (peptone agar) thạch nghiêng khoai tây (potato slopes) Vi khuẩn khác với tác nhân gây bệnh nhiễm trùng động vật tốc độ tăng sinh nhanh, có khả di chuyển cho phản ứng định danh Strauss (chích vi khuẩn vào chuột lang) âm tính Dựa đặc điểm họ đoán chủng vi khuẩn gây bệnh melioidosis chủng gần với vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng glander động vật, điều làm rõ nghiên cứu sinh học phân tử thời gian gần [50][35][28] Vào năm 1932, Stanton Fletcher đặt tên cho bệnh melioidosis, theo tiếng Hy lạp “melis” tình trạng khó chịu kéo dài (distemper of asses) “eidos” giống với (resemblance), tạm dịch tình trạng khó chịu kéo dài giống với nhiễm trùng động vật Trong suốt kỷ, vi khuẩn hoại sinh môi trường Gram âm biết đến nhiều tên gọi khác nhau: Bacillus pseudomallei, Bacillus whitmorii, Malleomyces pseudomallei, Pseudomonas pseudomallei, từ năm 1992 có tên gọi thức Burkholderia pseudomallei [78] Vào cuối kỷ 20, melioidosis lên bệnh truyền nhiễm quan trọng sức khỏe cộng đồng Đông Nam Á Bắc Úc Tại bệnh viện Hoàng gia Darwin, Úc, bệnh nguyên nhân phổ biến gây nên viêm phổi chết người cộng đồng [14][21] Tại Úc, tỷ lệ tử vong lên đến 20% số người mắc bệnh melioidosis [13] Còn Thái lan, có nhiều chương trình thử nghiệm thuốc lâm sàng nên cải thiện đáng kể việc xây dựng phác đồ điều trị kháng sinh cho bệnh melioidosis Tuy nhiên, lựa chọn phác đồ điều trị kháng sinh tối ưu chưa cải thiện tỷ lện tử vong cao 48h đầu nhập viện ca melioidosis nghiêm trọng Thái lan có tỷ lệ tử vong 50% 6.1 DỊCH TỄ HỌC: Với kinh nghiệm viết 10 năm melioidosis, Dance [16] lưu ý ca bệnh báo cáo hay hàng loạt ca dường phần đỉnh núi băng trôi Ở vùng nhiệt đới hẻo lánh, nơi bệnh truyền nhiễm thịnh hành lại nơi khơng có dụng cụ ni cấy dẫn đến báo cáo khơng đầy đủ tình hình thực tế Ông đưa chứng thay đổi rõ ràng dịch tễ học melioidosis như: Krishnaswami công bố ca melioidosis chiếm 5% tổng số tử vong khám nghiệm tử thi vào năm 1917, đến năm 1945 ca melioidosis Myanmar báo cáo lại từ người du lịch [57][72] Tương tự vậy, Thái lan Úc, nơi xem có tỷ lệ lưu hành melioidosis cao tại, khơng có báo cáo ca bệnh năm 1947 1950 [55] Một điều bất thường khác liên quan đến việc xác định không đầy đủ, bao gồm tỷ lệ dấu ấn huyết cao (7%) số binh sỹ Mỹ tham chiến Việt nam bị melioidosis trở Mỹ [9] , đối lập với tỷ lệ mắc bệnh thấp dân địa Thêm vào đó, tỷ lệ lưu hành melioidosis cao vùng Issan, đông bắc Thái lan, đối lập với tỷ lệ lưu hành thấp Lào, phía đơng sơng Mekong xi xuống phía nam Campuchia [71] Như báo trước cho nghịch lý này, tỷ lệ dấu ấn huyết dương tính với B thailandensis vùng đơng nam Á, chủng độc hơn, có lẽ giải thích phơi nhiễm với B thailandensis thay B pseudomallei Sự phân bố B thailandensis giới xác định rõ, nhiên rõ ràng [67] chúng phân lập chủ yếu đất đơng bắc Thái lan khơng tìm thấy chủng Úc Mặc dù vùng dịch bệnh địa phương melioidosis xác định khoảng vĩ độ 20o bắc 20o nam đông nam Á bắc Á [43], dịch bùng phát lớn lại xảy vùng tận Úc, bao gồm ca Winton (22o nam) 159 ca melioidosis lợn thời gian năm vùng sông Burnett (25,5o nam) ô nhiễm nguồn nước [41] Những ca melioidosis khác xảy vùng dịch tễ xác định, tây nam Úc, vùng thung lũng sông Brisbane Queensland (27o nam) , Alice Springs Mackay Sự phân bố ca bệnh dịch địa phương vào năm 2001 2002 trước đó, nằm ngồi vùng xác định dịch bệnh địa phương liệt kê hình Những nghiên cứu dịch tễ học xác định tỷ lệ bệnh hàng năm vùng cực bắc 16.5/100000 từ 1989-1999, liên quan tới kiện thời tiết nghiêm trọng lượng mưa hàng năm cao Cũng có vài tỷ lệ dựa dân số mô tả trước Úc 40/100000, vùng địa lý giới hạn Torres Strait bắc Queenland vào năm 2000 2002 Ngược lại với nhiều nước khác, nơi melioidosis bệnh dịch địa phương, Úc hầu hết bệnh nhân từ vùng hẻo lánh chuyển tới bệnh viện giới thiệu vùng cực bắc Northern Territory, vùng Kimberley tây Úc, bắc Queensland Torres Strait để chữa trị Hình 1: Bản đồ phân bố melioidosis giới.Khơng màu: chưa có ghi nhận Đỏ: Vùng bệnh dịch địa phương Cam: có khả dịch bệnh địa phương Tím: rời rạc Xanh lá: phân lập vi khuẩn từ môi trường Gạch chéo xanh nhạt: báo cáo chưa xác nhận Tại Thái lan, tỷ lệ ca melioidosis hàng năm 4,4/100000 dân tỉnh Ubon Ratchathani, đông bắc Thái lan [64] Tiếp theo tỉnh Khon Kaen, Nakhon Ratchasima, Buri Ram Udon Thani thấy số lượng lớn bệnh nhân Một khảo sát quốc gia cho thấy 30/125 bệnh viện khơng có khoa vi sinh suốt thời gian 1994-1995 số phân lập hàng năm 1100 ca, điều cho thấy ước tính có tính chất bảo thủ số ca melioidosis Thái lan Kết khảo sát quốc gia bệnh viện có số ca báo cáo lớn liệt kê bảng Bệnh viện Mahosot Viêng Chăn ghi nhận số ca hàng năm, chiếm khoảng 2% số ca phân lập từ cấy máu khoảng thời gian từ 2000-2002 (P Newton, personal communication), phân lập B pseudomallei từ đất vùng Viêng Chăn [76] Ngồi Viêng Chăn điều kiện ni cấy vi sinh hạn chế dịch tễ học chưa xác định Tại Việt nam, ca melioidosis miền nam ghi nhận Pons Advier [52]và nguồn gốc hoại sinh B pseudomallei tìm thấy Vaucel Hà nội Chambon Sài gòn [6][16] Với có mặt quân đội Pháp sau Mỹ, bị phơi nhiễm với B pseudomallei môi trường đất ẩm nước tù đọng, sau điều trị bệnh viện có phịng lab đại nhiều ca lâm sàng mơ tả từ năm 1940 đến 1970 Thậm chí có nhiều ca báo cáo sau 29 năm trở quê nhà binh lính tham chiến phơi nhiễm vi khuẩn Việt nam [8][29][48] Cũng có ca rải rác số dân di cư Việt nam khách du lịch đến Việt nam từ nước khác [33][75] Tuy nhiên cố gắng hệ thống giám sát chưa tìm thấy tỷ lệ có ý nghĩa thống kê diện B pseudomallei mẫu cấy máu mẫu đất khu vực xung quanh thành phố Hồ Chí Minh [51] có ca melioidosis nước điều trị khoa nhiễm bệnh viện lớn Điều tương đồng với trường hợp Papua New Guinea, nơi có phân phối chắp vá B pseudomallei tự nhiên B pseudomallei phân lập từ bệnh nhân Tại Malaysia Indonesia, Stanton Fletcher Viện nghiên cứu Y khoa quốc gia Malaysia ghi nhận ca nhiễm trùng động vật từ năm 1913 họ cơng bố ca với ca người động vật vào năm 1932 [60] Những ca melioidosis rải rác từ Indonesia báo cáo tài liệu Hà lan nhiều năm cộng thêm vào báo cáo khác ca xuất qua Úc, Anh Mỹ Tại Singapore, melioidosis bệnh dịch đáng ý từ năm 1989, tỷ lệ hàng năm 1,7 ca melioidosis báo cáo khoảng thời gian năm 1989-1996 với 89% (337 ca) cấy kiểm tra [32][45] Từ năm 1998, 104 bệnh nhân báo cáo Đầu năm 2004 có 57 ca báo cáo với tỷ lệ tử vong cao (40% ) trùng khớp với thời tiết mưa lớn bất thường lũ lụt (O P Lim, Abstr 4th World Melioidosis Congr.,abstr 3, 2004) Những ca melioidosis nghiêm trọng dẫn đến tử vong lại xuất nước phát triển Tại Trung quốc, đặc khu Hồng kong Đài loan có số ca melioidosis địa phương ghi nhận Hồng Kong xuất huyết học 14% turbeculosis sanatorium Một dịch bùng phát động vật biển công viên đại dương mô tả [34] Các khu vực khác châu Á, nhiều ca báo cáo Ấn độ [38] có ca khách châu Âu du lịch Ấn độ trở về, cho thấy không chắn vị trí ca bệnh Thêm vào đó, khảo sát huyết học cho thấy xuất dấu ấn huyết khoảng 7% vùng trồng lúa gần Vellore Mặc dù ca mơ tả Sri Lanka, cho chắn xảy Một vài ca melioidosis rải rác khách du lịch trở từ Bangladesh báo cáo [15] , có bệnh nhân có biểu nhiễm trùng huyết (septic arthritis) du lịch tới Syhet Mặc dù tỷ lệ báo cáo 10% mẫu giải phẫu xác Rangoon, Myanmar, từ năm 1945, có ca người Hà lan du lịch người thứ người Đài loan du lịch Ca nhập vào Anh phản ánh tỷ lệ xuất melioidosis đất nước mà khởi phát Những ca người động vật nhập từ Bangladesh, Pakistan, India, Indonesia Philipin Những nghiên cứu huyết học Đông Timor cho thấy có phơi nhiễm B pseudomallei, khơng có ca nuôi cấy thành công khẳng định điều (P Armstrong, personal communication) Khu vực châu Á, chủ yếu ca báo cáo từ người du lịch đến vùng dịch bệnh địa phương, điều đòi hỏi cảnh báo bệnh truyền nhiễm bác sĩ toàn cầu [58] Tuy nhiên ca tự trị rải rác báo cáo tồn giới, kể tây đơng Phi, vùng Caribe, Nam phi Địa trung hải 10 nu acid amin Tuy nhiên giống cột nhiều trình tự khơng chắn trình tự có họ hàng xa độ khơng chắn cao HMMer3 tính tốn hậu nghiệm liên kết hồn chỉnh ký tự thay chỉnh tối ưu cho ký tự Sự tổng hòa sử dụng cho suy luận hữu ích kể giống cột khơng hồn chỉnh Ví dụ, trình tự đưa vào HMMER kèm theo giải xác suất, đại diện cho mức độ tin cậy ký tự giống cột Cho điểm chuỗi thay cho điểm giống cột ký tự Sự giống cột không chắn có tác động quan trọng đến khả tìm kiếm chuỗi tương đồng sở liệu Đó tương đồng xa nhất, khó xác định có khả trình tự thú vị nhất, mà giống cột không chắn cao nhất, mà xác suất thống kê cho điểm thấp Để tối ưu hóa khả phân biệt tương đồng thật không tương đồng tìm kiếm sở liệu, lý thuyết suy luận xác suất khuyên phải cho điểm trình tự chuỗi cách tích hợp giống cột không chắn cho điểm tối ưu cho ký tự tương đồng đơn lẻ Tốc độ Nhược điểm chương trình Hồ sơ HMM trước tốc độ chậm (thậm chí HMMER2) HMMER3 tăng tốc độ nhờ thuật toán đoán Đối với hầu hết truy suất trình tự protein có tốc độ nhanh BLAST, truy suất DNA chậm khoảng 10 lần so với BLAST 6.7 CÂU HỎI NGHIÊN CỨU: Yếu tố phiên mã RPOS RPON B Pseudomallei có tham gia vào điều hịa biểu cụm gene mã hóa cho hệ thống xuất protein số vi khuẩn hay không? 6.8 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: Dùng phần mềm HMMER3 để tìm diện hộp RPOS RPON vùng khởi động (promoter) cụm gene T3SS3 vi khuẩn Gram âm B Pseudomallei gây bệnh melioidosis dựa tập huấn luyện 81 trình tự bảo tồn vùng -10 đại diện cho hộp RPOS 186 trình tự bảo tồn vùng -24/-12 đại diện cho hộp RPON vi khuẩn Gram âm tham khảo y văn 24 KẾT QUẢ: Chương I: Khu trú ổ gene mã hóa cho hệ thống xuất số gene Bp xác định đơn vị phiên mã (operon) vùng gene T3SS/bsa locus Hệ thống xuất protein thứ (type secretion system) B pseudomallei cho phát triển từ hệ thống roi chuyển động hệ thống mang tính bảo tồn vi khuẩn nói chung [56] Đó hệ thống phức tạp có tham gia nhiều protein khác nhau, protein mã hóa nhóm gene Nhóm gene mã hóa cho hệ thống xuất protein số (T3SS) giống với Inv/Mxi-Spa T3SS Salmonella spp Shigella spp chỗ đóng vai trị quan trọng cho việc xâm nhập vào tế bào động vật [68] Ổ gene chứa 35 gene 11operon [63] ( Hình 1) Hình Sơ đồ gene B pseudomallei ổ gene T3SS3 hay gọi T3SS/bsa locus Vai trò đốn gene tơ màu giải ô vuông Mũi tên hướng gene Burkholderia secretion apparatus (Bsa) vùng gene nằm ổ gene lớn mã hóa cho tồn protein hệ thống xuất số (T3SS) Hệ thống xuất protein thứ (T3SS) dấu xác định tính độc Salmonella, Shigella vi khuẩn gây bệnh Gram âm khác xem cơng cụ tiêm protein vi khuẩn vào tế bào ký chủ [3][37] Ở B pseudomallei, ổ gene thứ mã hóa cho T3SS yếu tố định làm tăng tính độc vi khuẩn dùng mơ hình chuột hamster để lây nhiễm [70] Chương trình DOOR sử dụng trình tự gene truy cập NCBI, kết cho thấy có nhiều operon, thường hai đến gene dự đoán phiên mã với operon Tuy nhiên nghiên cứu tác giả đặc biệt quan tâm gene bipB bipC thuộc operon ID 111393 bipD thuộc operon ID 111394 (operon đơn gene) BipD (BPSS1529) protein đầu mũi nhọn 25 hệ thống xuất protein số (được ví xi lanh) BipD chứng minh protein xuất hệ thống T3SS3 vào năm 2003 khẳng định lại năm 2015 Vander Broek Thậm chí cấu trúc tinh thể nhiều tác giả nghiên cứu có cấu trúc khơng gian chiều giống với protein tìm thấy Shigella Kết DOOR cho thấy bipD gene operon đơn gene BipB (BPSS1532) BipC (BPSS1531) translocator protein Chủng K96243 đột biến bipB-bipC cho thấy giảm khả xâm lấn vào dòng tế bào Hela T3SS/bsa yếu tố xác định tính độc vi khuẩn gây bệnh Gram âm, Salmonella, Shigella Vi khuẩn dùng protein phức hợp để tiêm protein vào ký chủ chúng tiếp xúc với ký chủ khoảng cách gần bipB, bipC bipD gene mã hóa cho translocator protein điều hịa biểu để tăng khả xâm nhập chúng vào tế bào ký chủ Sau dự đoán operon T3SS/bsa locus, HMMer sử dụng để tìm RpoS RpoN vùng promoter operon Bảng 1. BipB operon – kết quả dự đoán bằng phần mềm online DOOR Mã gene (GI) Bắt đầu (Start) Kết thúc (End) Gene Tên khác Protein mã hóa (Product) 53722552 2084259 2085518 bipC BPSS1531 protein (cell xâm lấn invasion protein) 53722553 2085560 2087422 bipB BPSS1532 Protein (cell xâm lấn invasion protein) 53722554 2087441 2087956 bicA BPSS1533 Protein trình diện kháng nguyên bề mặt (surface presentation of antigens protein) Chương II: Xây dựng training set (tập huấn luyện) từ công bố khoa học Chúng ta biết RNA polymerase với yếu tố phiên mã sigma 54 (RpoN) nhận biết vùng khởi động (promoter) vị trí bảo tồn -24 -12 tính từ nucleotide bắt đầu phiên mã Trong RNA polymerase với yếu tố phiên mã sigma 70 (RpoS) nhận biết vùng promoter vị trí bảo tồn -35 -10 tính từ nucleotide phiên mã Trong nghiên cứu 186 trình tự bảo tồn 26 promoter vùng -24/-12 lấy từ báo Barrios H [1]và đưa vào làm training set cho HMMer để tìm hộp RpoN ổ gene T3SS3 B pseudomallei Theo tài liệu xác định motif hộp RpoS với độ xác 85% dựa vào trình tự bảo tồn vùng -10 -35 dựa vào trình tự vùng bảo tồn -10 mà khơng quan tâm đến vùng -35 81 trình tự vùng -10 promoter phụ thuộc RpoS từ tài liệu E.coli K12 chủng MG1655 sưu tập đưa vào training set để tìm hộp RpoS promoter B pseudomallei bao gồm đoạn khoảng 15-19bp vùng -10 35 đưa vào Trên thực tế, kết nghiên cứu cho thấy xây dựng training set dựa trình tự chưa giống cột (alignment) tốt dùng trình tự multialignment để xác định hộp RpoS Vì vùng -35 trình tự đồng vùng -10 loài, nên vùng -10 chọn để làm training set (tập huấn luyện) nghiên cứu Gói phần mềm HMM chứa nhiều chương trình khác nhau, bắt đầu việc xây dựng training set (hmmt) từ trình tự chưa thẳng hàng (unaligned) giống cột nhiều trình tự (multialignment) (hmmb) Chương trình hmml (HMM local search) dùng để tra cứu sở liệu Sau xây dựng xong training set, hiệu trình tự promoter kiểm chứng vùng 35 -10 promoter P.aeruginosa PAO1 trước dùng cho B pseudomallei Bởi gene chủng B pseudomallei PP844 mà chúng tơi có khơng có sở liệu NCBI, nên chủng B pseudomallei K96243 (cũng phân lập Thái lan) thay để tra cứu trình tự ổ gene T3SS3 Chương III: Dùng phần mềm HMMer tìm hộp RpoS RpoN vùng promoter ổ gene T3SS/bsa Vùng 500bp 300bp trước nucleotide ổ gene T3SS3 phiên mã tra cứu Gene bank (NCBI) Đưa vào phần mềm HMMer phiên 2.3.2 (http://hmmer.org/download.html) để tìm RpoS RpoN dựa training set xây dựng Ở vi khuẩn, đơn vị phiên mã thường khơng gene mà nhóm gene phiên mã với nhau, gọi operon Nghĩa operon ổ gene (gene locus) lại điều hịa riêng, hộp 27 RpoS RpoN tìm vùng promoter operon Để tiên đốn có operon T3SS3 locus, phần mềm trực tuyến DOOR (http://csbl.bmb.uga.edu/DOOR/) sử dụng để chẩn đốn xem có operon ổ gene T3SS3 Sau hộp RpoS RpoN tìm vùng promoter tất operon thuộc T3SS3 gene locus Kết hiển thị hình bên Hai hộp RpoS tìm thấy (hình 2), nhiên có hộp RpoS vùng promoter gene bipD có đặc điểm motif RpoS box nhóm 1, nghĩa vùng 10 có trình tự bảo tồn CTAxxxT (vị trí -13 đến -7 vùng bảo tồn -10 promoter phụ thuộc RpoS(Error! Reference source not found.) Kết cho thấy hộp RpoS vùng promoter bipB-bipC operon khơng đủ mạnh (hình 3) Trong hộp RpoN lại tìm thấy vùng promoter operon bipB-bipC bipD (single gene operon) (hình 3) Theo nghiên cứu Osiriphun cộng năm 2009, công thức mẫu khái quát (motif) hộp RpoS thực tế phân chia làm nhóm Loại chứa trình tự CTAxxxT bảo tồn vùng -10 Chỉ từ 1-3 vị trí (x) thay nucleotide khác nhau, điều có nghĩa trình tự vị trí -10 đến -8 khơng đóng vai trị quan trọng hộp RpoS Nhóm có motif xTAxxxT Nhóm khơng có trình tự bảo tồn cố định, nghĩa có khả RpoS bám vào promoter vị trí khơng thuộc nhóm 2(Error! Reference source not found.)(Error! Reference source not found.) Mặc dù T3SS gene cluster nằm xa vị trí gene rpoN2 rpoS B pseudomallei chromosome, việc tìm thấy hộp RpoS (khơng phải loại 1) RpoN2 vùng promoter operon ID 111393 dẫn đến giả thuyết RpoN2 RpoS trực tiếp liên quan đến việc điều hòa biểu operon Trong hộp RpoS loại RpoN tìm thấy vùng promoter operon ID 111394, cho thấy operon điều hòa yếu tố phiên mã Như trình điều hòa biểu gene gây bệnh B pseudomallei T3SS/bsa locus phức tạp chặt chẽ, điều hòa loại yếu tố phiên mã qua operon 28 Hình Sơ đồ gene bipB bipD operon (Kết DOOR) với hộp RpoS xác định qua phần mềm HMMer với -35/-10 promoter training set ( sử dụng trình tự bảo tồn vùng -10 để xây dựng training set vùng -35 bảo tồn lồi.) Hình Sơ đồ gene vùng gene bsaZ-bicA-bipB-bipC-bprA-bipDtrên T3SS/bsa locus với hộp RpoN tìm thấy Hộp RpoN tìm thấy qua phần mềm HMMer với motif -24/-12 training set vùng promoter (khoảng 300bp UPS (upstream) bipB operon vùng 300bp UPS bipD gene vẽ hình chữ nhật Trên hình có vẽ vị trí primers thiết kế để tiến hành nghiên cứu tiếp biểu gene operon B pseudomallei chủng hoang dại chủng đột biến yếu tố phiên mã, kiểm chứng cho kết sinh tin học nghiên cứu 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: Bằng cách sử dụng phần mềm DOOR HMMer phiên 2.3.2 hộp RpoS RpoN, vị trí yếu tố phiên mã RpoS RpoN gắn lên vùng promoter gene operon để điều hịa biểu operon đó, dự đốn Sự diện hộp RpoS RpoN vùng promoter B pseudomallei T3SS/bsa gene locus cho thấy có mối liên quan yếu tố phiên mã RpoS RpoN với việc điều hòa biểu gene ổ gene Ổ gene T3SS/bsa chứng minh mã hóa cho hệ thống xuất protein số 3, chịu tránh nhiệm cho việc lây nhiễm vi khuẩn vào tế bào ký chủ yếu tố dùng để xác định tính độc vi khuẩn Việc dự đốn giúp ích cho thiết kế nghiên cứu tiếp theo, tiết kiệm chi phí, định hướng nghiên cứu tiên lượng khả xảy Từ kết sinh tin học , thấy gene liên quan đến khả xâm nhập B pseudomallei vào tế bào ký chủ điều hòa cách chặt chẽ mức độ phiên [20] mã qua yếu tố phiên mã Sự điều hòa xảy nhiều cấp độ, gene operon, có phối hợp điều hịa yếu tố phiên mã Từ kết thiết kế thí nghiệm labo để kiểm chứng lại kết sinh tin học cung cấp thông tin kiến thức sâu sinh bệnh học vi khuẩn B pseudomallei cho bác sĩ lâm sàng Kiến nghị: Thiết kế primer chạy PCR kiểm chứng lại kết sinh tin học nghiên cứu Để kiểm chứng đoán vùng khởi động (promoter prediction) dùng kỹ thuật 5’-RACE-PCR sequencing Và kiểm chứng lại đồng phiên mã operon gene dùng RT-PCR Để kiểm chứng gene có nằm kiểm sốt RpoS RpoN hay khơng, dùng kỹ thuật sinh học phân tử, so sánh biểu gene mức độ phiên mã chủng hoang dại chủng đột biến Protein chủng ly trích nghiên cứu proteomics, chứng minh biểu gene mức độ dịch mã 30 PHỤ LỤC : 9.1 Kết tìm kiếm NCBI gene bipB cụm gene T3SS/bsa: bipB cell invasion protein [ Burkholderia pseudomallei K96243 ] Gene ID: 3096083, updated on 16-May-2014 Location: chromosome: Sequence: Chromosome: 2; NC_006351.1 (2085560 2087422, complement) Chromosome NC_006351 9.2 Trình tự bảo tồn RpoS RpoN : 31 9.3 186 trình tự bảo tồn vùng -24/-12 promoter: sưu tầm từ nhiều chủng khác nghiên cứu Barrios, 1999 dùng làm training set cho HMMer nghiên cứu 32 33 10.TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] Attree, O and I Attree, A second type III secretion system in Burkholderia pseudomallei: who is the real culprit? Microbiology, 2001 147(12): p 3197-3199 Barrios, H., B Valderrama, and E Morett, Compilation and analysis of σ54dependent promoter sequences Nucleic acids research, 1999 27(22): p 4305-4313 Blocker, A., et al., Structure and composition of the Shigella flexneri ‘needle complex’, a part of its type III secreton Molecular microbiology, 2001 39(3): p 652-663 Boucher, J., M Schurr, and V Deretic, Dual regulation of mucoidy in Pseudomonas aeruginosa and sigma factor antagonism Molecular microbiology, 2000 36(2): p 341-351 Brown, N.F., A.E Lew, and I.R Beacham, Identification of new transposable genetic elements in Burkholderia pseudomallei using subtractive hybridisation FEMS microbiology letters, 2000 183(1): p 73-79 Chambon, L Isolement du bacille de Whitmore a partir du milieu exterieur in ANNALES DE L INSTITUT PASTEUR 1955 MASSON EDITEUR 120 BLVD SAINT-GERMAIN, 75280 PARIS 06, FRANCE Chen, Y., et al., Effects of soil pH, temperature and water content on the growth ofBurkholderia pseudomallei Folia microbiologica, 2003 48(2): p 253 Chodimella, U., et al., Septicemia and suppuration in a Vietnam veteran Hospital Practice, 1997 32(5): p 219-221 Clayton, A.J., R LIBELLA, and D.G Martin, Melioidosis: a serological survey in military personnel Military medicine, 1973 138(1): p 24-6 Cooper, G.M and R.E Hausman, The cell: Molecular approach 2004: Medicinska naklada Cullinane, M., et al., Stimulation of autophagy suppresses the intracellular survival of Burkholderia pseudomallei in mammalian cell lines Autophagy, 2008 4(6): p 744-753 Currie, B.J and S.P Jacups, Intensity of rainfall and severity of melioidosis, Australia Emerging infectious diseases, 2003 9(12): p 1538 Currie, B.J., et al., Endemic melioidosis in tropical northern Australia: a 10-year prospective study and review of the literature Clinical Infectious Diseases, 2000 31(4): p 981-986 Currie, B.J., et al., The epidemiology of melioidosis in Australia and Papua New Guinea Acta tropica, 2000 74(2-3): p 121-127 Dance, D., et al., Imported melioidosis in England and Wales The Lancet, 1999 353(9148): p 208 Dance, D., Melioidosis: the tip of the iceberg? Clinical Microbiology Reviews, 1991 4(1): p 52-60 Dance, D., Pseudomonas pseudomallei: danger in the paddy fields Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 1991 85(1): p 1-3 Dasgupta, N., et al., A four‐tiered transcriptional regulatory circuit controls flagellar biogenesis in Pseudomonas aeruginosa Molecular microbiology, 2003 50(3): p 809-824 DEJSIRILERT, S., et al., Growth and survival of Pseudomonas pseudomallei in acidic environments Japanese Journal of Medical Science and Biology, 1991 44(2): p 63-74 34 [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] DeShazer, D., et al., Molecular characterization of genetic loci required for secretion of exoproducts in Burkholderia pseudomallei Journal of bacteriology, 1999 181(15): p 4661-4664 Douglas, M.W., et al., Epidemiology of community‐acquired and nosocomial bloodstream infections in tropical Australia: a 12‐month prospective study Tropical Medicine & International Health, 2004 9(7): p 795-804 Eddy, S.R., Profile hidden Markov models Bioinformatics (Oxford, England), 1998 14(9): p 755-763 Egan, F., M Barret, and F O'Gara, The SPI-1-like Type III secretion system: more roles than you think Frontiers in plant science, 2014 5: p 34 Elias, A.F., et al., Altered Stationary-Phase Response in a Borrelia burgdorferi rpoS Mutant Journal of bacteriology, 2000 182(10): p 2909-2918 Finkelstein, R.A., P Atthasampunna, and M Chulasamaya, Pseudomonas (Burkholderia) pseudomallei in Thailand, 1964-1967: geographic distribution of the organism, attempts to identify cases of active infection, and presence of antibody in representative sera The American journal of tropical medicine and hygiene, 2000 62(2): p 232-239 Forbes‐Faulkner, J., W Townsend, and A Thomas, Pseudomonas pseudomallei infection in camels Australian veterinary journal, 1992 69(6): p 148-148 Galyov, E.E., P.J Brett, and D DeShazer, Molecular insights into Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei pathogenesis Annual review of microbiology, 2010 64: p 495-517 Godoy, D., et al., Multilocus sequence typing and evolutionary relationships among the causative agents of melioidosis and glanders, Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei Journal of clinical microbiology, 2003 41(5): p 2068-2079 Goshorn, R., Recrudescent pulmonary melioidosis A case report involving the socalled" Vietnamese time bomb." Indiana Med., 1987 80: p 247-249 Haase, A., et al., Toxin production by Burkholderia pseudomallei strains and correlation with severity of melioidosis Journal of medical microbiology, 1997 46(7): p 557-563 Häußler, S., M Rohde, and I Steinmetz, Highly resistant Burkholderia pseudomallei small colony variants isolated in vitro and in experimental melioidosis Medical microbiology and immunology, 1999 188(2): p 91-97 Heng, B., et al., Epidemiological surveillance of melioidosis in Singapore ANNALS-ACADEMY OF MEDICINE SINGAPORE, 1998 27: p 478-484 Heyse, A., et al., A case of imported melioidosis presenting as prostatitis Infection, 2003 31(1): p 60-62 Hicks, C., R Kinoshita, and P Ladds, Pathology of melioidosis in captive marine mammals Australian veterinary journal, 2000 78(3): p 193-195 Holden, M.T., et al., Genomic plasticity of the causative agent of melioidosis, Burkholderia pseudomallei Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004 101(39): p 14240-14245 Holmes, A., J Govan, and R Goldstein, Agricultural use of Burkholderia (Pseudomonas) cepacia: a threat to human health? Emerging infectious diseases, 1998 4(2): p 221 Hueck, C.J., Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants Microbiology and molecular biology reviews, 1998 62(2): p 379-433 Jesudason, M.V., A Anbarasu, and T.J John, Septicaemic melioidosis in a tertiary care hospital in south India Indian Journal of Medical Research, 2003 117: p 119121 Jørgensen, F., et al., RpoS-dependent stress tolerance in Pseudomonas aeruginosa Microbiology, 1999 145(4): p 835-844 35 [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] Kazmierczak, M.J., et al., Listeria monocytogenes σB regulates stress response and virulence functions Journal of bacteriology, 2003 185(19): p 5722-5734 Ketterer, P., et al., Melioidosis in intensive piggeries in south eastern Queensland Australian Veterinary Journal, 1986 63(5): p 146-149 Kubori, T., et al., Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system Science, 1998 280(5363): p 602-605 Leelarasamee, A and S Bovornkitti, Melioidosis: review and update Reviews of infectious diseases, 1989 11(3): p 413-425 Lertpatanasuwan, N., et al., arabinose-positive: case Reportburkholderia pseudomallei: case Reportinfection in Humans: case Report Clinical infectious diseases, 1999 28(4): p 927-928 Lim, M., et al., Burkholderia pseudomallei infection in the Singapore Armed Forces from 1987 to 1994 an epidemiological review Annals of the Academy of Medicine, Singapore, 1997 26(1): p 13-17 Limmathurotsakul, D., et al., Predicted global distribution of Burkholderia pseudomallei and burden of melioidosis Nature microbiology, 2016 1(1): p nmicrobiol20158 Lingnau, A., et al., Expression of the Listeria monocytogenes EGD inlA and inlB genes, whose products mediate bacterial entry into tissue culture cell lines, by PrfAdependent and-independent mechanisms Infection and immunity, 1995 63(10): p 3896-3903 Mackowiak, P.A and J.W Smith, Septicemic melioidosis: occurrence following acute influenza A six years after exposure in Vietnam Jama, 1978 240(8): p 764766 Nachiangmai, N., et al., Pseudomonas pseudomallei in southern Thailand The Southeast Asian journal of tropical medicine and public health, 1985 16(1): p 83-87 Nierman, W.C., et al., Structural flexibility in the Burkholderia mallei genome Proceedings of the National Academy of Sciences, 2004 101(39): p 14246-14251 Parry, C.M., et al., Melioidosis in Southern Vietnam: clinical surveillance and environmental sampling Clinical infectious diseases, 1999 29(5): p 1323-1326 Pons, R and M Advier, Melioidosis in Cochin China Epidemiology & Infection, 1927 26(1): p 28-30 Prouty, M.G., N.E Correa, and K.E Klose, The novel σ54‐and σ28‐dependent flagellar gene transcription hierarchy of Vibrio cholerae Molecular microbiology, 2001 39(6): p 1595-1609 Rainbow, L., C.A Hart, and C Winstanley, Distribution of type III secretion gene clusters in Burkholderia pseudomallei, B thailandensis and B mallei Journal of medical microbiology, 2002 51(5): p 374-384 Rimington, R., Melioidosis in north Queensland Medical Journal of Australia, 1962 1(2): p 51-3 Saier Jr, M.H., Evolution of bacterial type III protein secretion systems Trends in microbiology, 2004 12(3): p 113-115 Samy, R.P., et al., Melioidosis: Clinical impact and public health threat in the tropics PLoS neglected tropical diseases, 2017 11(5): p e0004738 Seppänen, P.C., Mikko, Melioidosis presenting as urinary tract infection in a previously healthy tourist Scandinavian journal of infectious diseases, 2000 32(1): p 92-93 Smith, M., et al., Arabinose assimilation defines a nonvirulent biotype of Burkholderia pseudomallei Infection and immunity, 1997 65(10): p 4319-4321 Stanton, A.T and W Fletcher, Melioidosis Melioidosis., 1932(20) 36 [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] Stevens, M.P., et al., An Inv/Mxi‐Spa‐like type III protein secretion system in Burkholderia pseudomallei modulates intracellular behaviour of the pathogen Molecular microbiology, 2002 46(3): p 649-659 Sun, G.W and Y.-H Gan, Unraveling type III secretion systems in the highly versatile Burkholderia pseudomallei Trends in microbiology, 2010 18(12): p 561568 Sun, G.W., et al., Identification of a regulatory cascade controlling Type III Secretion System gene expression in Burkholderia pseudomallei Molecular microbiology, 2010 76(3): p 677-689 Suputtamongkol, Y., et al., The epidemiology of melioidosis in Ubon Ratchatani, northeast Thailand International journal of epidemiology, 1994 23(5): p 10821090 THOMAS, A., J FORBES-FAULKNER, and M PARKER, Isolation of Pseudomonas pseudomallei from clay layers at defined depths American Journal of Epidemiology, 1979 110(4): p 515-521 Tong, S., et al., Laboratory investigation of ecological factors influencing the environmental presence of Burkholderia pseudomallei Microbiology and immunology, 1996 40(6): p 451-453 Trakulsomboon, S., et al., Epidemiology of arabinose assimilation in burkholderia pseudomallei isolated from patients and soil in Thailand The Southeast Asian journal of tropical medicine and public health, 1999 30(4): p 756-759 Ulrich, R.L and D DeShazer, Type III secretion: a virulence factor delivery system essential for the pathogenicity of Burkholderia mallei Infection and immunity, 2004 72(2): p 1150-1154 Vorachit, M., et al., Resistance of Pseudomonas pseudomallei growing as a biofilm on silastic discs to ceftazidime and co-trimoxazole Antimicrobial agents and chemotherapy, 1993 37(9): p 2000-2002 Warawa, J and D.E Woods, Type III secretion system cluster is required for maximal virulence of Burkholderia pseudomallei in a hamster infection model FEMS microbiology letters, 2005 242(1): p 101-108 Weller, P and G Dickersin, Case 40-1992: A 43-Year-Old Cambodian Man with Several Years of Recurrent Bouts of Fever and Abdominal Pain New England Journal of Medicine, 1992 327(15): p 1081-1087 White, N., Melioidosis The Lancet, 2003 361(9370): p 1715-1722 Whitmore, A., An account of a glanders-like disease occurring in Rangoon Epidemiology & Infection, 1913 13(1): p 1-34 Wong, K., S Puthucheary, and J Vadivelu, The histopathology of human melioidosis Histopathology, 1995 26(1): p 51-55 Worthington, M.G and D.W McEntry, Chronic melioidosis in a Vietnamese immigrant Reviews of infectious diseases, 1990 12(5): p 966-966 Wuthiekanun, V., et al., Detection of Burkholderia pseudomallei in soil within the Lao People's Democratic Republic Journal of clinical microbiology, 2005 43(2): p 923-924 Wuthiekanun, V., M.D Smith, and N.J White, Survival of Burkholderia pseudomallei in the absence of nutrients Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 1995 89(5): p 491 Yabuuchi, E., et al., Proposal of Burkholderia gen nov and transfer of seven species of the genus Pseudomonas homology group II to the new genus, with the type species Burkholderia cepacia (Palleroni and Holmes 1981) comb nov Microbiology and immunology, 1992 36(12): p 1251-1275 Yildiz, F.H and G.K Schoolnik, Role of rpoS in stress survival and virulence of Vibrio cholerae Journal of bacteriology, 1998 180(4): p 773-784 37 [80] Zielinski, N.A., et al., Alginate synthesis in Pseudomonas aeruginosa: environmental regulation of the algC promoter Journal of bacteriology, 1992 174(23): p 76807688 38 ... KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Thông tin chung: - Tên đề tài: Xác định hộp RpoS RpoN vùng promoter ổ gen mã hóa cho hệ thống xuất số Burkholderia pseudomallei (Bp) sinh tin học - Mã số: 34 0-17... chí, năm xuất bản): báo Xác định hộp RpoS RpoN vùng promoter ổ gen mã hóa cho hệ thống xuất số Burkholderia pseudomallei (Bp) sinh tin học Đường Thị Hồng Diệp Y học TP Hồ Chí Minh*Tập 22 *Số 2*2018... Hóa sinh, Khoa Y - Thời gian thực hiện: 01 năm Mục tiêu: Dùng sinh tin học xác định hộp RpoS hộp RpoN vùng promoter ổ gene mã hóa cho hệ thống xuất protein số vi khuẩn Bp Nội dung chính: Tìm gene