Sàng lọc hoạt tính độc tế bào ung thư vú người mda mb 231 của cao chiết hồng quân (flacourtia indica)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BỘ Y TẾ TRẦN THỊ PHƯƠNG UYÊN SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ VÚ NGƯỜI MDA-MB-231 CỦA CAO CHIẾT HỒNG QUÂN (Flacourtia indica) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BỘ Y TẾ TRẦN THỊ PHƯƠNG UYÊN SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ VÚ NGƯỜI MDA-MB-231 CỦA CAO CHIẾT HỒNG QUÂN (Flacourtia indica) Chuyên ngành: Dược lý – Dược lâm sàng Mã số: 8720205 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THẦY HƯỚNG DẪN: PGS.TS ĐỖ THỊ HỒNG TƯƠI PGS.TS HUỲNH NGỌC THỤY TP Hồ Chí Minh - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu trình bày luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khoa học khác Tác giả luận văn Trần Thị Phương Uyên LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý Thầy Cô Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh truyền đạt kiến thức, kỹ tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên chúng em suốt trình học tập hồn thành chương trình học Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Cơ PGS.TS Đỗ Thị Hồng Tươi, người Thầy hướng dẫn em từ bước đường nghiên cứu khoa học, truyền cho em niềm đam mê để theo đuổi lĩnh vực Dược lý đầy khó khăn Xin cảm ơn Cơ tận tình hết lịng hướng dẫn, bảo, định hướng cho em thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn Cô PGS.TS Huỳnh Ngọc Thụy nhiệt tình hướng dẫn, bảo, giúp đỡ em thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn Cơ ThS.DS Huỳnh Thị Kim Loan, anh chị phịng Arbovirus, khoa Vi sinh – Miễn dịch, Viện Pasteur TP HCM, anh Quân, chị Tâm, chị Tuyền tạo điều kiện thuận lợi, tận tình hướng dẫn, hỗ trợ em trình thực đề tài Em xin trân trọng cảm ơn quý Thầy Cô Bộ môn Dược lý, Bộ mơn Dược lâm sàng tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức quý báu cho em suốt khóa học vừa qua Em xin chân thành cảm ơn Thầy Cô Hội đồng dành thời gian để xem góp ý giúp luận văn em hoàn thiện Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến gia đình, người yêu thương, tin tưởng, sát cánh con, chăm sóc, lo lắng cho để vững bước đường học tập nghiên cứu khoa học Trần Thị Phương Uyên SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ VÚ CỦA CAO CHIẾT HỒNG QUÂN (Flacourtia indica) TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ VÚ NGƯỜI MDA-MB-231 Trần Thị Phương Uyên Thầy hướng dẫn: PGS.TS Đỗ Thị Hồng Tươi, PGS.TS Huỳnh Ngọc Thụy Mở đầu: Cây Hồng quân (Flacourtia indica) dùng từ lâu dân gian điều trị nhiều bệnh khác nhờ tác động giảm đau, kháng khuẩn, chống oxy hóa, bảo vệ gan, hạ đường huyết… Đề tài sàng lọc hoạt tính độc tế bào ung thư vú cao chiết Hồng quân dòng tế bào ung thư vú người MDA-MB-231 Phương pháp: Tế bào MDA-MB-231 nuôi cấy môi trường DMEM, bổ sung 10% FCS, mM L-glutamin, 100 IU/ml penicilin 100 µg/ml streptomycin Tế bào xử lý với cao chiết Hồng quân (nồng độ 4-100 µg/ml) 72 Đánh giá ức chế tăng trưởng tế bào test MTT, hoại tử tế bào test LDH, hoạt hóa apoptosis cách nhuộm acridin orange/ethidium bromid, điện di định lượng ADN phân mảnh, xác định hoạt tính enzym caspase Kết quả: Các cao chiết Hồng quân thể hoạt tính độc tế bào dịng tế bào ung thư vú người MDA-MB-231, làm giảm tỷ lệ tế bào sống sau 72 mạnh theo thứ tự cao chiết cloroform > cao ethyl acetat > cao nước Giữa cao chiết cloroform ethyl acetat phận dùng khác nhau, cao chiết từ thân thể tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào tốt nhất, tiếp đến cao từ rễ > cao từ Các cao chiết cloroform, ethyl acetat từ rễ, thân Hồng quân độc tế bào theo hai chế gây hoại tử tế bào (tăng phóng thích enzym LDH vào mơi trường ni cấy) hoạt hóa q trình apoptosis tế bào (thể qua tượng tạo bóng màng, cô đặc nhiễm sắc thể, tăng tỉ lệ ADN phân mảnh hoạt hóa enzym caspase 3) Kết luận: Các cao chiết Hồng quân thể hoạt tính độc tế bào dòng tế bào ung thư vú người MDA-MB-231 qua chế gây hoại tử hoạt hóa q trình apoptosis tế bào Từ khóa: Hồng qn, độc tế bào, ung thư vú, dòng MDA-MB-231, apoptosis, hoại tử STUDY ON CYTOTOXIC ACTIVITY OF EXTRACTS FROM Flacourtia indica IN HUMAN BREAST CANCER MDA-MB-231CELL LINE Tran Thi Phuong Uyen Supervisors: Assoc Prof Do Thi Hong Tuoi, Assoc Prof Huynh Ngoc Thuy Introduction: Flacourtia indica has been used as a traditional medicine due to antiinflammatory, anti-oxidant, hepatoprotective and hypoglycemia effects This work studied on screening for cytotoxic activity in human breast cancer MDA-MB-231 cell line of extracts from different parts of this medicinal plant Methods: MDA-MB-231 cells ere cultured in DMEM supplemented with 10% FCS, mM L-glutamine, 100 IU/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin Cells were treated with extracts of F indica at different concentrations (4 - 100 µg/ml) for 72 hours Anti-proliferative effect was evaluated by MTT test; necrosis measured by LDH test; apoptosis activation determined by acridine orange/ethidium bromide staining, electrophoresis of DNA fragment, assays of DNA fragment and caspase activity Results: All extracts from root, stem and leaf of F indica showed cytotoxic activity in human breast cancer MDA-MB-231 cell line as decreases in cell viability after treatment for 72h in the order: chloroform extracts > ethyl acetat extracts > aqueous extracts For chloroform and ethyl acetat extracts of different parts, stem extracts exhibited the highest cytotoxic activity, after that root extracts > leaf extracts The mechanism of cytotoxic activity of chloroform, ethyl acetate extracts form F indica root and stem were necrosis by releasing of lactate dehydrogenase into culture medium and apoptosis activation of MDA-MB-231 cells measured as membrane bleeding, chromosome condensation as well as increases in DNA fragmentation and caspase activity Conclusion: All extracts of F indica showed cytotoxic activity in human breast cancer MDA-MB-231 cell line by mechanism of necrosis and apoptosis activation Keywords: Flacourtia indica, breast cancer, MDA-MB-231 cell, apoptosis, cytotoxic activity, necrosis MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT…………………………………………….iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÚ 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Dịch tễ học 1.1.3 Nguyên nhân yếu tố nguy 1.1.3.1 Nguyên nhân gây bệnh 1.1.3.2 Yếu tố nguy 1.1.4 Chẩn đoán 1.1.4.1 Thăm khám lâm sàng 1.1.4.2 Chẩn đoán cận lâm sàng 1.1.5 Phân loại 10 1.1.6 Các liệu pháp điều trị 11 1.1.6.1 Liệu pháp điều trị truyền thống 11 1.1.6.2 Chiến lược điều trị 13 1.2 PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO 14 1.2.1 Phương pháp đo thay đổi điện trở 15 1.2.2 Phương pháp dùng thuốc nhuộm đỏ trung tính 15 1.2.3 Đếm tế bào sống dung dịch trypan blue 16 1.2.4 Phương pháp SRB 16 1.2.5 Đánh giá tỉ lệ tế bào sống phương pháp MTT 16 1.2.6 Dùng dấu ATP đo tỷ lệ tế bào sống 17 Trần Thị Phương Uyên 1.2.7 Dùng dấu protease đo tỷ lệ tế bào sống 17 1.2.8 Khảo sát thời gian thực 17 1.3 KHẢO SÁT CƠ CHẾ HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ 18 1.4 TỔNG QUAN VỀ CÂY HỒNG QUÂN 22 1.4.1 Chi Flacourtia 22 1.4.1.1 Vị trí phân loại 22 1.4.1.2 Đặc điểm thực vật học 23 1.4.1.3 Các loài mang tên hồng quân Việt Nam 23 1.4.2 Đặc điểm thực vật loài Flacourtia indica (Burm.f.) Merr 25 1.4.2.1 Tên gọi 25 1.4.2.2 Mô tả đặc điểm thực vật 25 1.4.2.3 Đặc điểm phân bố, sinh thái 26 1.4.2.4 Bộ phận dùng 27 1.4.2.5 Thành phần hóa học 27 1.4.2.6 Tác dụng dược lý 27 1.4.2.7 Công dụng 29 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 31 2.1.1 Dòng tế bào 31 2.1.2 Mẫu thử 31 2.1.3 Hóa chất 32 2.1.4 Thiết bị dụng cụ 34 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.2.1 Nuôi cấy tế bào 35 2.2.2 Đếm tế bào dung dịch trypan blue 35 2.2.3 Bố trí thí nghiệm 36 Trần Thị Phương Uyên 2.2.4 Xử lý tế bào 37 2.2.5 Đánh giá tỉ lệ tế bào sống phương pháp MTT 37 2.2.6 Khảo sát tác động gây hoại tử tế bào cao Hồng quân 38 2.2.7 Khảo sát tác động gây hoạt hóa q trình apoptosis lên tế bào MDA-MB-231 xử lý với mẫu thử cao chiết Hồng quân 38 2.2.7.1 Nhuộm AO/EB (acridin orange/ethidium bromid) 38 2.2.7.2 Đánh giá q trình apoptosis thơng qua phương pháp điện di ADN 39 2.2.7.3 Định lượng ADN phân mảnh 41 2.2.7.4 Đánh giá q trình apoptosis thơng qua phương pháp khảo sát khả hoạt hóa enzym caspase 43 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44 3.1 SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ VÚ NGƯỜI MDA-MB-231 CỦA CÁC CAO HỒNG QUÂN 44 3.2 TÁC ĐỘNG GÂY HOẠI TỬ TẾ BÀO UNG THƯ VÚ MDA-MB-231 CỦA 04 CAO TỪ THÂN VÀ RỄ HỒNG QUÂN 50 3.3 TÁC ĐỘNG GÂY HOẠT HĨA Q TRÌNH APOPTOSIS CỦA 04 CAO CHIẾT TỪ RỄ VÀ THÂN HỒNG QUÂN 52 3.3.1 Nhuộm AO/EB (acridin orange/ethidium bromid) 53 3.3.2 Điện di ADN phân mảnh 55 3.3.3 Định lượng ADN phân mảnh 56 3.3.4 Khảo sát hoạt tính caspase 58 Chương BÀN LUẬN 60 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60 KẾT LUẬN 60 ĐỀ NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC Trần Thị Phương Uyên DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Ac-DEVD- Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp pNA p-nitroanilide ADN Acid deoxyrinonucleic AO/EB Acridin orange/ethidium bromid ATCC American type culture collection Tiếng Việt Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ ATM Ataxia telangiectasia mutated ATP Adenosine triphosphate BMP-4 Bone morphogenetic protein-4 BRCA Breast cancer CCl4 Carbon tetracloride CD24+ Cluster of differentiation 24 CD44+ Cluster of differentiation 44 CHEK2 Checkpoint kinase CDH1 Cadherin CMF Cyclophosphamide, Methotrexate, Gen ung thư vú Điểm kiểm soát 5-fluorouracil (5-FU) CAF Cyclophosphamide, Adriamycin, 5-fluorouracil (5-FU) CEF Cyclophosphamide, Epirubicin, 5-fluorouracil (5-FU) DAPI ', 6-diamidino-2-phenylindole DMEM Dulbecco's Modified Eagle's medium DMSO Dimethyl sulfoxide EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ER Estrogen receptor Môi trường DMEM Thụ thể estrogen Trần Thị Phương Uyên 11 Amarasinghe Nilupa R et al (2007), "Flacourside, a new 4-oxo-2cyclopentenylmethyl glucoside from the fruit juice of Flacourtia indica", Food Chemistry, 102 (1), pp 95-97 12 Ancy P, Padmaja V, Radha K et al (2013), "Diuretic activity of the roots of Flacourtia indica", Hygeia JD Med , (1), pp.79-83 13 Ashbeck E.L, Rosenberg R.D, Stauber P.M et al (2007), "Benign breast biopsy diagnosis and subsequent risk of breast cancer", Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers, 16 (3), pp.467-472 14 Berry D.A, Cronin K.A, Plevritis S.K et al (2005), "Effect of screening and adjuvant therapy on mortality from breast cancer", New England Journal of Medicine, 353 (17), pp.1784-1792 15 Borenfreund E, Jame A.P (1985), "Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption", Toxicol Lett, 24 (2-3), pp.119-24 16 Bourjot Mélanie et al (2012), "Flacourtosides A–F, phenolic glycosides isolated from Flacourtia ramontchi", Journal of natural products, 75 (4), pp 752-758 17 Brady Hugh J.M (2004), Apoptosis Menthods and Protocols, Springer Science & Business Media, London, pp.1-48 18 Bruening W, Schoelles K, Treadwwell J et al (2009), Comparative effectiveness of core-needle and open surgical biopsy for the diagnosis of breast lesions 19 Calaf G.M, Ponce-Cusi R, and Carrión F (2018), "Curcumin and paclitaxel induce cell death in breast cancer cell lines", Oncology reports, 40 (4), pp.2381-2388 20 Choi Y.H and Yoo Y.H (2012), "Taxol-induced growth arrest and apoptosis is associated with the upregulation of the Cdk inhibitor, p21WAF1/CIP1, in human breast cancer cells", Oncology reports, 28 (6), pp.2163-2169 Trần Thị Phương Uyên 21 Cicek Gercel-Taylor (2005), “Chemosensitivity: Volume II”, Humana Press, pp.79-82 22 Denizot F, Lang R (1986), "Rapid colorimetric assay for cell growth and survival Modifications to this tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability", J Immunol Methods, 89 (2), pp.271-277 23 Eramma (2013), "Antibacterial potential and phytochemical analysis of Flacourtia indica (Burm f.) Merr root extract against human pathogens", Indo American Journal of Pharmaceutical Research, pp.3832-3846 24 Flores M.L, Castilla C, Avila R et al (2012), "Paclitaxel sensitivity of breast cancer cells requires efficient mitotic arrest and disruption of Bcl-xL/Bak interaction", Breast cancer research and treatment, 133 (3), pp.917-928 25 Gnanaprakash K, Madhusudhana Chetty C, Ramkanth S et al (2010), "Aqueous extract of Flacourtia indica prevents carbon tetrachloride induced hepatotoxicity in rat", Energy, 8, pp.2867 26 Godet I and Gilkes D.M (2017), "BRCA1 and BRCA2 mutations and treatment strategies for breast cancer", Integrative cancer science and therapeutics, (1),pp.1-17 27 Hai-Rim Shin (2008), Burden and Risk Factors of Cancer in Asia, International Agency for Research on Cancer, World Health Organization, Lyon, France 28 Hanaa M.S, Mahmoud H.M, Faten M.D (2006), "Phytochemical and biological investigations of Flacourtia cataphracta Roxb cultivated in Egypt", Bull Pharm Sci., Assiut University, 29 (2), pp 371-387 29 Harvard Extension’s Cell Biology (2013), Apoptosis & Necrosis, Harvard Extension’s Cell Biology course 30 Health Quality Ontario (2016), "Magnetic resonance imaging as an adjunct to mammography for breast cancer screening in women at less than high risk for breast cancer: a health technology assessment”, Ontario health technology assessment series, 16 (20), pp.1-30 Trần Thị Phương Uyên 31 Hogen Esch (2012), "Challenges in pre-clinical testing of anti-cancer drugs in cell culture and in animal models", Journal of Controlled Release, 164 (2), pp.183-186 32 Hugh J.M (2004), Apoptosis Menthods and Protocols, Springer Science & Business Media, London, pp.47-48 33 IARC screening group (2013), "Breast cancer" International Agency for Research of Cancer 34 Jamal A, Kausar W, Shamsuddin K.M, Asif Z (1984), "Jangomolide, a novel limonoid from Flacourtia jangomas", Phytochemistry, 23 (6), pp.1269-1270 35 Jänicke R.U, Sprengart M.L, Porter A.G(1998), "Caspase-3 is required for DNA fragmentation and morphological changes associated with apoptosis", Journal of Biological Chemistry, 273 (16), pp.9357-9360 36 Jayasinghe Lalith (2012), "Phenolic constituents from the fruit juice of Flacourtia inermis", Natural product research, 26 (3), pp 278-281 37 Jemal A, Center M.M, Ferlay J, Ward E, Forman D (2012), "Global cancer statistics", A Cancer Journal for Clinicians, 61(2), pp.69-90 38 Kaou (2010), "Antimalarial compounds from the aerial parts of Flacourtia indica (Flacourtiaceae)", J Ethnopharmacol, 130 (2), pp.272-274 39 Korzeniewski (1983), "An enzyme-release assay for natural cytotoxicity", J Immunol Methods, 64 (3), pp.313-320 40 KrupadanamV.S, David G.L (1991), "A butyrolactone lignan disaccharide from Flacourtia ramontchi", Archives of Basic and Applied Medicine, (1), pp.39-44 41 Kundu J (2013), "Analgesic, anti-inflammatory, and diuretic activity of methanol extract of Flacourtia indica", Archives of Basic and Applied Medicine, (1), pp.39-44 42 Lim T.K (2013), Edible Medicinal And Non-Medicinal Plants, Springer, pp 761-766 Trần Thị Phương Uyên Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 43 Lisa C.C, Brooke J M, Nigel J.W (2016), "Analyzing cell death by nuclear staining with Hoechst 33342", Cold Spring Harbor Protocols, 2016 (9), pp.778-781 44 Mahmood T and Yang P.C (2012), "Western blot: technique, theory, and trouble shooting", North American journal of medical sciences, (9), pp.429 45 National Cancer Institute of America (2017), “Female Breast Cancer”, https://seer.cancer.gov/statfacts/html/breast.html (ngày truy cập 01-Jun-2018) 46 Nazneen (2009), "Protective effects of Flacourtia indica aerial parts extracts against paracetamol-induced hepatotoxiciy in rats", Journal of Taibah University for Science, 2, pp.1-6 47 Ndhlala (2007), "Phenolic composition of Flacourtia indica, Opuntia megacantha and Sclerocarya birrea", Food Chemistry, 103 (1), pp.82-87 48 O (2004), "Reduced cardiotoxicity and comparable efficacy in a phase III trial of pegylated liposomal doxorubicin HCl (CAELYX™/Doxil®) versus conventional doxorubicin for first-line treatment of metastatic breast cancer" Annals of oncology, 15 (3), 440-449 49 Park K.W, Kundu J, Chae I.G et al (2014), "Methanol extract of Flacourtia indica aerial parts induces apoptosis via generation of ROS and activation of caspases in human colon cancer HCT116 cells", Asian Pac J Cancer Prev, 15 (17), pp.7291-7296 50 Perez A.T, Domenech G.H, Frankel C, Vogel C.L (2002), "Pegylated liposomal doxorubicin (Doxil®) for metastatic breast cancer: the Cancer Research Network, Inc., experience", Cancer investigation, 20 (2), pp.22-29 51 Phuc V Pham, Nhung T Nguyen, Nhung H Truong, Thuy T Duong, Dong V Le (2011), " Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy", Journal of Translational Medicine, 9, pp.209 Trần Thị Phương Uyên Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 52 Prasanta K Bhaumik Kamakhya P Guha, Gopal K Biswas (1987), "Flacourtin, a phenolic glucoside ester from Flacourtia indica", Phytochemistry, 26 (11), pp 3090-3091 53 Rieger A.M, Nelson K.L, Konowalchuk J.D, Barreda D.R (2011), "Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death" Journal of visualized experiments: JoVE, (50), pp.2597 54 Sashidhara (2013), "Isolation and identification of beta-hematin inhibitors from Flacourtia indica as promising antiplasmodial agents", Eur J Med Chem, 60, pp.497-502 55 Saxena (2010), "In vitro antioxidant activity of methanolic and aqueous extract of Flacourtia indica Merr", American-Eurasian Journal of Scientific Research, (3), pp.201-206 56 Scarlett S.L, Albert Y.L (2002), "Breast cancer characteristics of Vietnamese women in the Greater San Francisco Bay Area" The Western Journal of Medicine, 176 (2), pp.87-91 57 Skehan P (1990), "New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer – drug screening" Journal of the Nation Cancer Institute, 82 (13), pp.1107 – 1112 58 Sleumer H.O (1980), "Flora neotropica: monograph number 22 Flacourtiaceae", New York Botanical Garden for Organization for Flora Neotropica, pp.35-37 59 Sreejith M et al (2013), "Phytochemical, Anti-oxidant and Anthelmintic activities of various leaf extracts of Flacourtia sepiaria Roxb", Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, (12), pp.947-953 60 Susan G.Komen for the Cure (2008), Types of Breast Cancer Tumors, Susan G.Komen for the Cure 61 Tabar L, Yen M.F, Vitak B et al (2003), "Mammography service screening and mortality in breast cancer patients: 20-year follow-up before and after introduction of screening", The Lancet, 361 (9367), pp.1405-1410 62 Takhtajan Armen (2009), Flowering plants, 2nd edition, Springer, pp.350 Trần Thị Phương Uyên Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 63 Tchibozo M.A.D, Savadogo A, Karou D et al (2012), "Connaissances endogènes et études phytochimiques de Flacourtia flavescens Willd.(Flacourtia indica (Burm f.) Merr.)", Tropicultura, 30 (1), pp.3-8 64 Terry L.R., Richard A M., Andrew L Niles, Sarah Duellman, Hélène A Benink, Tracy J Worzella, Lisa Minor (2016), “Cell Viability Assays”, Assay Guidance Manual, Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences, pp.355-385 65 Tran S.L (2011), "Trypan blue dye enters viable cells incubated with the pore – forming toxin Hlyll of Bacillus cereus", PloS One, (99), pp.22876 66 Yiannis A Ioannou and Fannie W Chen (1996), "Quantitation of DNA fragmentation in apoptosis", Nucleic Acids Research, 24 (5), pp.992-993 Trần Thị Phương Uyên Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PHỤ LỤC Phụ lục Kết khảo sát hoạt tính độc tế bào cao chiết Hồng qn nồng độ 100 µg/ml dịng tế bào ung thư vú người MDA-MB-231sau72 Mẫu Cao cloroform chứng Rễ Thân OD1 0,589 0,099 0,064 0,064 0,055 0,067 OD2 0,494 0,119 0,062 0,067 0,068 OD3 0,589 0,128 0,066 0,063 0,060 Lá Cao nước Cao EtOAc Rễ Thân Lá Rễ Thân Lá 0,087 0,176 0,379 0,417 0,066 0,119 0,184 0,362 0,415 0,071 0,111 0,185 0,331 0,403 Phụ lục Kết khảo sát hoạt tính độc tế bào paclitaxel dòng tế bào ung thư vú người MDA-MB-231 sau 72 Mơi trường Paclitaxel 2,5 µM Paclitaxel 1,25 µM Paclitaxel 0,25 µM OD1 0,411 0,121 0,206 0,243 OD2 0,426 0,140 0,175 0,228 OD3 0,415 0,128 0,191 0,231 Trần Thị Phương Uyên Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Kết khảo sát hoạt tính độc tế bào cao Hồng quân dòng tế bào ung thư vú người MDA-MB-231 sau xử lý 72 Nồng độ (µg/ml) Cao Cloroform Rễ Thân Lá Ethyl acetat Rễ Thân Lá Nước Rễ Thân Lá OD 570nm 100 (200) 75 (150) 50 (100) 25 (50) 12,5 (25) 0,077 0,125 0,170 0,194 0,239 0,080 0,111 0,093 0,209 0,240 0,071 0,107 0,112 0,173 0,238 0,074 0,111 0,128 0,139 0,187 0,095 0,064 0,086 0,127 0,191 0,081 0,158 0,138 0,138 0,182 0,059 0,091 0,163 0,217 0,232 0,058 0,106 0,174 0,188 0,203 0,059 0,080 0,169 0,208 0,257 0,060 0,105 0,148 0,193 0,326 0,070 0,106 0,123 0,221 0,283 0,055 0,102 0,137 0,251 0,338 0,057 0,072 0,125 0,218 0,205 0,064 0,071 0,082 0,212 0,278 0,054 0,067 0,090 0,156 0,330 0,076 0,204 0,266 0,301 0,327 0,074 0,175 0,156 0,303 0,303 0,072 0,155 0,211 0,311 0,350 0,119 0,221 0,301 0,370 0,139 0,225 0,328 0,315 0,131 0,215 0,275 0,306 0,108 0,179 0,227 0,256 0,309 0,111 0,159 0,212 0,245 0,338 0,096 0,169 0,238 0,262 0,245 0,088 0,215 0,253 0,271 0,259 0,093 0,217 0,200 0,237 0,254 0,149 0,188 0,238 0,261 0,269 Trần Thị Phương Uyên Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Kết khảo sát tác động gây hoại tử tế bào cao Hồng quân dòng tế bào ung thư vú người MDA-MB-231 sau xử lý 72 Nồng độ (µg/ml) Cao Cloroform Rễ Thân Ethyl acetat Rễ Thân Hoạt tính LDH (mU/ml) 100 50 25 465,778 402,444 305,778 576,889 353,556 368,000 529,111 490,222 296,889 716,889 455,778 405,778 612,444 535,778 370,222 719,111 403,556 476,889 596,889 440,222 423,556 502,444 566,889 521,333 521,333 449,111 525,778 662,444 475,778 356,889 640,889 455,880 380,222 684,000 413,556 302,444 376,330 344,440 Paclitaxel µM 408,220 Mẫu chứng DMSO 1% 162,440 131,330 Trần Thị Phương Uyên Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 141,330 .4 Phụ lục Kết nhuộm AO/EB cao chiết cloroform từ thân Hồng quân Nồng độ 100 µg/ml Nồng độ 75 µg/ml Nồng độ 50 µg/ml Nồng độ 25 µg/ml Paclitaxel nồng độ µM DMSO nồng độ 1% Trần Thị Phương Uyên Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Kết nhuộm AO/EB cao chiết cloroform từ rễ Hồng quân Nồng độ 100 µg/ml Nồng độ 75 µg/ml Nồng độ 50 µg/ml Nồng độ 25 µg/ml Trần Thị Phương Uyên Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Kết nhuộm AO/EB cao chiết ethyl acetat từ thân Hồng quân Nồng độ 100 µg/ml Nồng độ 75 µg/ml Nồng độ 50 µg/ml Nồng độ 25 µg/ml Trần Thị Phương Uyên Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Kết nhuộm AO/EB cao chiết ethyl acetat từ rễ Hồng quân Nồng độ 100 µg/ml Nồng độ 75 µg/ml Nồng độ 50 µg/ml Nồng độ 25 µg/ml Trần Thị Phương Uyên Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Kết tỷ lệ ADN phân mảnh tế bào ung thư vú người MDA-MB-231 sau xử lý 72 với cao Hồng quân Nồng độ Tỉ lệ ADN phân mảnh (%) (µg/ml) Cao Cloroform Rễ Thân Ethyl acetat Rễ Thân 75 50 25 41,176 35,178 29,224 38,068 20,290 28,571 39,216 34,025 22,069 44,022 32,995 25,767 35,519 31,402 17,143 39,301 31,933 27,419 43,842 36,571 24,294 26,271 29,858 26,230 43,523 34,400 34,239 15,556 24,204 27,830 26,519 21,528 10,759 33,333 11,290 13,095 29,084 31,250 5,036 9,655 Paclitaxel µM 38,947 Mẫu chứng DMSO 1% 10,875 Trần Thị Phương Uyên Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục 10 Kết khảo sát hoạt tính enzym caspase tế bào ung thư vú người MDA-MB-231 sau xử lý 72 với cao Hồng quân Nồng độ (µg/ml) Cao Cloroform Rễ Thân Ethyl acetat Rễ Thân Nồng độ pNA (µM) 75 15,51 50 9,51 25 7,61 13,51 7,51 8,49 12,09 8,66 7,70 22,37 16,66 9,30 22,66 16,09 8,88 21,80 13,23 7,92 15,51 7,80 7,53 10,94 12,37 7,90 10,37 10,66 6,87 10,37 7,23 6,80 8,09 8,09 6,51 8,66 9,23 4,99 18,657 17,514 6,371 6,085 Paclitaxel µM 19,514 Mẫu chứng DMSO 1% 6,086 Trần Thị Phương Uyên Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... huyết… Đề tài sàng lọc hoạt tính độc tế bào ung thư vú cao chiết Hồng quân dòng tế bào ung thư vú người MDA- MB- 231 Phương pháp: Tế bào MDA- MB- 231 nuôi cấy môi trường DMEM, bổ sung 10% FCS, mM... 34 Bảng 3.1 Hoạt tính độc tế bào ung thư vú người MDA- MB- 231 cao Hồng quân nồng độ 100 µg/ml sau 72 xử lý 45 Bảng 3.2 Hoạt tính độc tế bào ung thư vú MDA- MB- 231 cao Hồng quân 46 Bảng... chế tăng trưởng tế bào ung thư vú cao Hồng quân 46 Bảng 3.4 IC50 dòng tế bào MDA- MB- 231 cao chiết Hồng quân 48 Bảng 3.5 Hoạt tính LDH môi trường nuôi cấy tế bào ung thư vú MDA- MB- 231 bị hoại tử