Nghiên cứu khả năng kháng viêm dị ứng của cao chiết lá cây phaeanthus vietnamensis ban trên mô hình chuột hen suyễn gây bởi ovalbumin

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MƠI TRƯỜNG ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM-DỊ ỨNG CỦA CAO CHIẾT LÁ CÂY Phaeanthus Vietnamensis Ban TRÊN MƠ HÌNH CHUỘT HEN SUYỄN GÂY BỞI OVALBUMIN ĐỒNG THỊ THU THẢO Đà Nẵng, 2020 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MƠI TRƯỜNG ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM-DỊ ỨNG CỦA CAO CHIẾT LÁ CÂY Phaeanthus Vietnamensis Ban TRÊN MƠ HÌNH CHUỘT HEN SUYỄN GÂY BỞI OVALBUMIN Ngành: Cơng nghệ sinh học Khóa: 2016-2020 Sinh viên: Đồng Thị Thu Thảo Người hướng dẫn: TS Bùi Thị Thơ Đà Nẵng, 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu tác giả chưa công bố cơng trình khác trước Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Tên sinh viên Đồng Thị Thu Thảo LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực Khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng, học hỏi nhiều kiến thức lý thuyết thực hành thí nghiệm phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, qua thân tơi trưởng thành tư duy, bố trí tiến hành nghiên cứu khoa học Để hồn thành Khóa luận tốt nghiệp này, ngồi nỗ lực thân, tơi xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc tận tình giúp đỡ mặt khoa học TS Bùi Thị Thơ Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô thuộc Khoa Sinh – Môi trường truyền dạy cho nhiều kiến thức kĩ thực hành thí nghiệm q trình tơi thực đề tài khóa luận Tơi xin gởi lời cảm ơn đến thành viên nhóm nghiên cứu, giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm nghiên cứu thời gian tơi thực khóa luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, bạn bè ln động viên, kích lệ vật chất lẫn tinh thần để đạt kết tốt Xin trân trọng cảm ơn Đà Nẵng, tháng 07 năm 2020 Sinh viên thực Đồng Thị Thu Thảo MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH 10 TÓM TẮT 11 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài 2 Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn 4 Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan thuốc Thượng 1.1.1 Đặc điểm, phân loại 1.1.2 Vị trí phân bố 1.1.3 Đặc điểm sinh học 1.1.4 Giá trị dinh dưỡng dược liệu 1.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước thành phần hóa học dược tính chi Phaenthus 1.2.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 1.3 Tổng quan bệnh hen suyễn 1.4 Cấu trúc phổi chế viêm đường hô hấp 1.4.1 Cấu trúc phổi 1.4.2 Cơ chế viêm-dị ứng đường hô hấp 10 1.4.3 Vai trò số cytokine phản ứng viêm – dị ứng 11 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 14 2.2.1 Phương pháp thu xử lý, tách chiết mẫu 14 2.2.2 Phương pháp xác định số hoạt chất từ cao chiết 16 2.2.3 Phương pháp thử nghiệm cao chiết mơ hình chuột hen suyễn 16 2.2.3.1 Thiết lập mơ hình hen suyễn điều trị bệnh chuột nhắt trắng 16 2.2.3.2 Thu dịch phổi đếm loại tế bào 16 2.2.3.3 Nhuộm quan sát mô phổi 17 2.2.3.4 Đo kháng thể đặc hiệu OVA sản phẩm tiết tế bào T biệt hóa dịch phổi 17 2.2.4 Xử lý số liệu 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 3.1 Xác định hoạt chất từ cao chiết thuốc Thượng 19 3.2 Tác dụng kháng hen suyễn cao chiết thuốc Thượng 24 3.2.1 PVE làm giảm tích lũy tế bào viêm phổi 24 3.2.2 PVE cải thiện tình trạng viêm thay đổi cấu trúc mô phổi 26 3.2.3 PVE điều hòa mức độ kháng thể đặc hiệu OVA serum 28 3.2.4 PVE điều hòa cân phản ứng tế bào helper T dịch phổi 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 KẾT LUẬN 33 KIẾN NGHỊ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC 36 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT IL Interleukin IFN Interferon Th1 Helper T Th2 Helper T PVE Cao chiết thuốc Thượng OVA Ovalbumin DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Các hoạt chất xác định chiết xuất Phaeanthus vietnamensis GC-MS 21 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Sự khác phổi người bình thường người mắc bệnh hen suyễn 10 Hình 1.2 Cơ chế viêm- dị ứng đường hô hấp 10 Hình 2.1 Sơ đồ chiết cao từ thuốc Thượng 15 Hình 2.2 Thiết lập mơ hình thí nghiệm điều trị chuột nhắt trắng 16 Hình 3.1 Biểu đồ GC-MS Phaeanthus vietnamensis 20 Hình 3.2 PVE ức chế tích lũy tế bào viêm tổng tế bào dịch phổi 25 Hình 3.3 PVE ngăn chặn thay đổi cấu trúc mơ phổi mơ hình chuột viêm - dị ứng phổi gây OVA 28 Hình 3.4 Tác động PVE lên mức độ ovalbumin (OVA)-specific IgE, OVA-specific IgG1 OVA-specific IgG2 serum chuột viêm phổi gây OVA 29 Hình 3.5 Tác động PVE đến cân chất tiết tế bào Th1/Th2 dịch phổi 31 10 Kháng viêm, kháng n-Hexadecanoic 31.038 2.29 acid nấm khuẩn, chống C16H32O2 ung thư, chống oxi hóa, (Palmitic acid) chống Kumar et al 2010 côn trùng 31.352 1.38 Kháng Hexadecanoic acid, ethyl ester C18H36O2 khuẩn, chống oxi hóa Dr Dukes 2014 Kháng viêm, kháng 31.410 0.44 Eicosane khuẩn, C20H42 giảm cytokine, kháng ung Dr Dukes 2014 bứu Kháng viêm, chống 9,1210 32.428 0.75 Octadecadieno ic acid (z,z)-, dị C19H36O2 11 32.488 1.07 methylcorydal 32.732 0.62 C12H15NO Chống viêm loét Camila et al 2013 C19H38O2 Dinesh et al 2011 dày Hoạt tính chưa Methyl stearate Dr Dukes 2014 kháng chống ung thư dine 12 histamin, kháng khuẩn, bảo vệ gan, methyl ester N- ứng, báo cáo - Kháng viêm, chống 13 32.951 4.92 Oleic acid C18H34O2 oxy hóa, apoptosis, gây chống Sreekumar et al 2014 ung thư Kháng viêm - dị ứng, 14 33.080 1.85 Linoleic acid ethyl ester C20H34O2 kháng histamine, ức chế cytokine chống viêm, ung chống sốt rét 22 thư, Dr Dukes 2014 15 33.128 3.25 Ethyl oleate C20H38O2 Octadecanoic 16 33.342 2.4 acid, ethyl C20H40O2 ester Phụ gia thực phẩm, dược phẩm Kháng viêm, chống oxy hóa Dr Dukes 2014 Dr Dukes 2014 Bis(-217 36.060 1.56 ethylhexyl) C24H38O4 Kháng viêm Yamaguchi et al 2017 1-carboxylic C13H17NO Hoạt tính chưa acid,7- phthalate 1,2,3,4Tetrahydroiso quinolin-6-ol18 36.964 2.19 báo cáo - methoxy-1methyl-, methyl ester Chống oxi hóa, điều 19 39.914 0.82 Vitamin E C29H50O2 hòa miễn dịch, giảm Traber Atkinson 2007 tổn thương phổi Kháng viêm, chống oxy hóa, chống ung 20 40.866 0.86 Campesterol C28H48O thư, điều hòa miễn dịch, ức chế Dr Dukes 2014 cytokine viêm histamin Kháng viêm, kháng khuẩn, chống ung 21 41.172 1.5 Stigmasterol C29H48O thư, suyễn, chống hen điều hòa miễn dịch, ức chế 23 Panda et al 2009 Dr Dukes 2014 cytokine viêm histamin Kháng viêm, kháng 22 41.764 2.02 Gamma γSitosterol khuẩn, chống ung C29H50O thư, suyễn, chống chống hen Dr Dukes 2014 dị ứng, lợi tiểu 3.2 Tác dụng kháng hen suyễn cao chiết thuốc Thượng 3.2.1 PVE làm giảm tích lũy tế bào viêm phổi Để đánh giá tác động PVE lên viêm đường hô hấp, số lượng tế bào viêm biệt hóa tổng tế bào dịch phổi xác định phương pháp nhuộm Diff - Quick đếm kính hiển vi Số lượng tế bào viêm eosinophil, neutrophil, macrophage tổng tế bào dịch phổi ghi nhận có gia tăng mạnh nhóm chuột OVA so với nhóm chuột bình thường Naive (P < 0.001) Ngược lại, nhóm chuột điều trị PVE 100 200 mg/kg cho thấy ức chế xâm nhập tế bào eosinophil, tổng tế bào vào phế nang (P < 0.01, P < 0.001) Neutrophil macrophage có xu hướng giảm sau điều trị khơng có ý nghĩa mặt thống kê (hình 3.2.A) Nhuộm Diff – Quick cho thấy nhóm OVA có xâm nhập mức tế bào viêm dịch phổi, vòng tròn đỏ đánh dấu diện tế bào eosinophil, vịng trịn trắng đánh dấu có mặt tế bào neutrophil, vòng tròn vàng đánh dấu xâm nhập tế bào macrophage (hình 3.2.B) Ngược lại, quan sát nhóm PVE 100 PVE 200 nhận thấy giảm hẳn diện tế bào viêm eosinophil neutrophil dịch phổi (hình 3.2.B) 24 Hình 3.2 PVE ức chế tích lũy tế bào viêm tổng tế bào dịch phổi (A) Các giá trị biểu có ý nghĩa ± SD (6 chuột/nhóm) ###P < 0.001, sai khác có ý nghĩa so với nhóm Naive *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, sai khác có ý nghĩa so với nhóm OVA (B) Dịch phổi thu 24 sau lần thử thách cuối cùng, tế bào phân lập slide quay ly tâm nhuộm với thuốc nhuộm DiffQuick Vòng tròn đỏ đánh dấu tế bào eosinophil, vòng tròn vàng đánh dấu neutrophil Tỷ lệ bar: 50μm 25 3.2.2 PVE cải thiện tình trạng viêm thay đổi cấu trúc mô phổi Mô phổi sau xử lý nhuộm thuốc nhuộm Hematoxylin & Eosin (H&E), Periodic Acid-Schiff (PAS), Masson Trichrome Nhuộm H&E để quan sát thay đổi cấu trúc chung phổi, nhuộm PAS để quan sát diện dịch nhầy tiết tế bào goblet bên phế quản, nhuộm Masson Trichrome để quan sát hình thành collagen Trong nhóm chuột OVA, phế quản khu vực phế nang có thay đổi rõ rệt mô bệnh học so với nhóm chuột bình thường Naive Ở hình A, dễ dàng nhận thấy nhóm chuột OVA lớp biểu mô phế quản bị phù nề lớp trơn trở nên dày nhóm cịn lại (mũi tên đen đầu độ dày thành phế quản) Đồng thời quanh ống phế quản khu vực phế nang có diện mật độ dày đặc tế bào viêm (mũi tên xanh khu vực dày đặc leukocytes) Ở nhóm chuột điều trị PVE liều khác nhau, ta nhận thấy có giảm dần triệu chứng viêm Nhóm PVE 100 PVE 200 có cải thiện tình trạng viêm đáng kể, thành phế quản khơng bị phù nề, lớp biểu mô trơn mỏng, khu vực phế nang không bị xâm nhập tế bào viêm (hình 3.3.A) Nhuộm PAS cho thấy nhóm OVA gia tăng diện tế bào goblet với dịch nhầy tế bào tiết mặt đường phế quản (phần màu tím đậm xác định mũi tên đen) Dịch nhầy xuất nhóm chuột điều trị PVE 50, có cải thiện rõ rệt nhóm điều trị PVE 100 PVE 200 (hình 3.3.B) Nhuộm Masson Trichrome để xác định xơ hóa hay collagen hóa phần trơn quanh phế quản Nhóm OVA có xơ hóa xung quanh ống phế quản phế nang, phần xơ hóa xen vào lớp biểu mơ thành phế quản (mũi tên vàng) Sau điều trị PVE liều độc lập, nhóm chuột PVE 100 PVE 200 cải thiện tình trạng xơ hóa (hình 3.3.C) Tóm lại, việc quan sát kính hiển vi mơ phổi cho thấy PVE có tác dụng bảo vệ cấu trúc phế quản phế nang, tránh xâm nhập tế bào viêm vào khu vực phế nang, phù nề đường phế quản xơ hóa khu vực xung quanh phế quản, phế nang 26 27 Hình 3.3 PVE ngăn chặn thay đổi cấu trúc mơ phổi mơ hình chuột hen suyễn - dị ứng gây OVA (A) Mô nhuộm H&E (B) Mô nhuộm PAS (C) Mô nhuộm Masson Trichrome Mũi tên đen đầu độ dày thành phế quản, mũi tên xanh đánh dấu leukocytes, mũi tên đen dịch nhầy màu tím đậm tiết từ tế bào goblet, mũi tên vàng màu xanh thể xơ hóa Tỷ lệ bar: 100μm 3.2.3 PVE điều hòa mức độ kháng thể đặc hiệu OVA serum Kháng thể đóng vai trị quan trọng phản ứng miễn dịch, xem xét biểu kháng thể đặc hiệu OVA serum nhóm chuột khác để đánh giá tác động PVE lên phản ứng hen suyễn - dị ứng Cũng để đánh giá khả kháng viêm PVE thông qua tiết cytokines liên quan Th1 Th2, xác định lượng kháng thể liên quan đến tế bào Th2 OVA specific IgE IgG1, kháng thể liên quan tế bào Th1 OVA specific IgG2a Mức độ anti-OVA specific IgE anti-OVA specific IgG1 ghi nhận gia tăng mạnh cách có ý nghĩa (P